免疫分析在农药残留检测中的应用和发展

通过分析免疫分析技术的基础——抗原抗体制备技术,进一步论述了主要免疫方法(放射免疫分析、酶免疫分析、荧光免疫分析、化学发光免疫分析等)的发展过程及其在农药残留检测中的应用。重点介绍了近年来免疫分析的新发展,尤其突出了免疫分析和理化分析联用技术这一痕量分析的新主流。探讨了免疫分析技术存在的问题和免疫分析的未来发展趋势。     

利用鸡蛋黄制备普通小麦高分子量谷蛋白亚基多克隆抗体的研究

利用免疫鸡的蛋黄制备了普通小麦高分子量谷蛋白１Ｄｘ５和１Ｂｘ１７＋１Ｂｙ１８亚基的多克隆抗体，结果表明：鸡对抗原的免疫耐性较强，３０￣２４０μｇ抗原／只鸡都能产生较高效价的抗体，蛋黄中抗体效价略高于抗血清，两者的动态变化规律基本相同，但前者要晚７天左右。利用硫酸葡聚糖能有效地纯化蛋黄抗体。     

应用免疫印迹法检测异尖线虫病人及实验动物血清中的抗体

本实验应用简单异尖线虫幼虫制备的全虫抗原及分泌－代谢抗原，以免疫印迹法检测异尖线虫病人血清及人工感染实验动物血清中的抗体。在７份病人阳性血清及重复经口感染异尖线虫幼虫的大鼠血清中，均查出识别Ｐ４６蛋白成分的特异抗体。而在２５份蠕虫病人血清中（包括蛔虫病、犬弓蛔虫病、丝虫病、旋毛虫病、肝片吸虫病等）未出现此特异抗体。Ｐ４６抗原成分显然是异尖线虫病的特异抗原成分。免疫印迹法用来诊断慢性异尖线虫病是一种特异性较强的方法。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠试验免疫研究

摘要：纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒，与Bac-N-Blue DNA共转染昆虫细胞sf9，通过同源重组，形成具有感染活性的重组杆状病毒，并利用重组病毒的LacZ表型进行噬斑纯化。纯化后的高效价重组杆状病毒在昆虫细胞中进行表达，表达产物应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、免疫印迹（Western-blot）和免疫酶斑点技术（Dot-ELISA）进行分析，确定所表达的蛋白分子量大小约为67KD，且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察，可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下，免疫6-8周龄的BALB/c小鼠，同时设PPV的灭活疫苗免疫组及PBS接种组作为参比对照，检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明，表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒，不仅能诱导小鼠机体产生抗CSFV的特异性CTL反应，还能刺激小鼠产生高效价的抗PPV的特异性抗体。而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性的初步鉴定

利用基因重组技术将鸡传染性支气管炎病毒（IBV）S1基因分段（A和B段）克隆到pGEX—6p-1载体中，用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳结果显示有明显的融合蛋白表达条带。通过IBV特异性抗体的Western blot检测，两段表达产物均能与抗体发生特异性反应，证明表达产物具有部分抗原性。用Glutathione Sepharose 4B纯化出A段和B段的GST融合蛋白。将纯化得到的融合蛋白免疫家兔。连续免疫3次，将得到的抗体与200 TOCID50（气管环半数感染）/0．1mL病毒工作液在37℃温育1h进行TOC试验。经计算A段抗体的50%血清中和终点为1：18，而B段抗体的50％血清中和终点为1：53，表明这两段的表达产物具有较好的免疫原性，B段表达产物更具有良好的抗原性，适合作为免疫抗原和诊断抗原，具有一定的临床应用价值。     

噬菌体免疫PCR技术及其在真菌毒素检测中的应用

噬菌体免疫PCR(Phage-mediated immuno-polymerase chain reaction,PD-IPCR)技术融合了噬菌体展示技术、特异性抗原-抗体和PCR技术,是三者相结合而派生出来的一项新分析技术。本文介绍了PD-IPCR技术的发展历程、技术原理及类型和技术流程中的关键实验方法,列举了一些噬菌体免疫PCR技术及其在真菌毒素检测中的应用,并结合PD-IPCR技术特点,分析了PD-IPCR技术在真菌毒素混合污染同步检测和污染预警研究等方向上的重要应用前景。     

动物性食品中硝基咪唑类兽药多残留酶联免疫检测方法的建立

本试验采用活化酯法,将合成的具有2-甲基-5-硝基咪唑通用结构的半抗原与载体蛋白偶联制备免疫抗原和包被抗原,以获得的抗原制备2-甲基-5-硝基咪唑通用结构抗体,并建立5种硝基咪唑类药物及代谢物的酶联免疫分析技术。结果表明:制备的抗体效价高于1∶100 000,该方法在不同动物源性食品中的加标回收率在85.65%~108.65%之间,检测限达1.9×10-4mg·L-1,对2-甲基-5-硝基咪唑、甲硝唑、替硝唑、地美硝唑和塞克哒唑5种硝基咪唑抗生素及代谢物交叉反应率达95%以上。本研究为进一步建立和完善酶联免疫法检测动物性食品中硝基咪唑类药物残留提供了技术支撑。     

含CSFV T细胞表位的猪细小病毒样颗粒的表达及小鼠免疫试验

将纯化的重组子pM-VP2-E290阳性质粒利用杆状病毒表达系统进行表达,表达产物应用SDS-PAGE、Western blot和Dot ELISA进行分析,确定所表达的蛋白分子量大小约为67kD,且具有天然蛋白的抗原特异性。应用免疫电镜对表达产物进行观察,可见到细小病毒样颗粒。病毒样颗粒在无免疫佐剂参与的情况下,免疫6～8周龄的BALB/c小鼠,同时设猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的灭活疫苗免疫组及磷酸盐缓冲液(PBS)接种组作为参比对照,检测小鼠的细胞免疫和体液免疫学指标。结果表明,表达蛋白所形成的细小病毒样颗粒,不仅能诱导小鼠机体产生抗猪瘟病毒的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,还能刺激小鼠产生高效价的抗猪细小病毒的特异性抗体,而且机体所产生的抗体效价显著高于灭活疫苗对照组。     

溴氰菊酯残留酶联免疫分析方法的建立

在前期设计合成了溴氰菊酯半抗原（DM）和人工抗原（DM-BSA和DM-OVA）的基础上,进一步利用人工抗原（DM-BSA）免疫新西兰大白兔获得了溴氰菊酯多克隆抗体。研究表明,新西兰大白兔产生的抗体对溴氰菊酯产生了灵敏的特异性免疫反应,所得多克隆抗体的效价为25600。以DM-OVA为包被原建立溴氰菊酯间接竞争ELISA检测方法,确定了抗原抗体最适工作浓度均为1∶12800。在含10%甲醇、pH7.4、盐浓度0.1mol·L^-1的缓冲液条件下制作了溴氰菊酯的标准抑制曲线,抑制中浓度IC50为3.999μg·mL^-1,检出限IC10为0.023μg·mL^-1,检测范围为0.015-100μg·mL^-1。抗体对包括氯菊酯、氯氰菊酯、甲氰菊酯在内的8种菊酯类农药的交叉反应率较低,在苹果中的添加回收率为86.2%-105.8%。成功制备出溴氰菊酯特异性抗体,并建立了水果中溴氰菊酯残留间接竞争酶联免疫分析方法。     

Bt晶体蛋白Cry1Ac放射免疫检测技术研究

通过苏云金芽孢杆菌(Bt)HD-73培养,提取Bt晶体蛋白Cry1Ac,经酶解后获得高抗虫活性蛋白。免疫新西兰白兔得到高纯度的Bt晶体蛋白1Ac抗体,用125I标记抗原,研究和建立了Bt晶体蛋白Cry1Ac的放射免疫检测技术,该试剂盒用磁性微粒作分离剂,不需离心即可分离,简化了测定步骤,检测结果达到国外同类产品(酶联免疫试剂盒)的水平。     

番茄黄化曲叶病毒双抗体夹心ELISA检测方法的初步建立

以纯化的番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)外壳蛋白为抗原,免疫家兔制备并纯化出TYLCV的多克隆抗体IgG,以此抗体做包被抗体,并用碱性磷酸酶(AP)对其进行标记作为酶标抗体,从而建立了番茄黄化曲叶病毒的双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)检测方法。通过ELISA方阵试验确定该法的最佳工作浓度为酶标抗体(IgG-AP)作1∶400倍稀释,包被抗体浓度为6.25μg.mL-1;并且确定了抗原最低检出浓度为9.75ng.mL-1。采用该法对山东寿光的田间病样进行了定性和定量检测,结果表明建立的DAS-ELISA方法灵敏度高、特异性强,可用于番茄黄化曲叶病毒的常规检测。     

利用菊花B病毒外壳蛋白特异片段进行多克隆抗体的制备与分析

菊花B病毒(CVB)是乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员,在浙江杭白菊基地普遍存在。为了能够特异、快速、简便检测CVB,利用SWISS-MODEL分析CVB外壳蛋白(CP)的三维结构,选择暴露在CVB CP三维空间结构外部的片段,片段之间使用连接肽串联以提高柔性,重复4个片段,根据大肠杆菌密码子的偏爱性将其相应的DNA序列进行优化,将合成的特异DNA序列连接表达载体pET-28a(+),转化至Escherichia coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了纯化后大小约为14 kDa的融合蛋白;将其作为抗原免疫家兔制备抗血清,纯化获得相应抗体;对获得的抗血清和抗体进行酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白免疫印迹(WB)检测。间接ELISA检测结果表明,512 000倍稀释的抗血清可检测到1 μg抗原。纯化后最终得到浓度为15 mg·mL^-1 的抗体,WB检测结果,1∶1 000稀释后的抗体可检测500 pg抗原,且能够特异性结合CVB CP蛋白。本研究制备的多克隆抗体为检测CVB提供了便利,也为后续CVB检测试纸条的开发提供了技术支撑。     

水稻OsBTB蛋白在非亲和/亲和互作中表达方式的初步研究

为了解水稻OsBTB蛋白在非亲和/亲和互作中的表达情况,构建含OsBTB全长基因的原核表达载体,经诱导表达及纯化获得OsBTB蛋白。以OsBTB蛋白为抗原制备兔多克隆抗体,经间接ELISA法测定抗体效价为1∶2000。Westernblot分析确认该抗体与OsBTB蛋白可以特异结合。应用该抗体检测受不同稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)生理小种侵染的相应水稻(Oryzasativa)品系中OsBTB蛋白的表达,结果表明OsBTB蛋白的表达方式呈多样性,该蛋白在非亲和反应中的表达时间明显早于其在亲和反应中的表达。免疫胶体金技术确认OsBTB蛋白存在于细胞核内。     

电化学免疫传感器快速检测农产品中的毒死蜱

研究了一种无标记的电化学免疫传感器,用于农产品中的毒死蜱农药残留的快速检测。将毒死蜱人工抗原作为生物识别元件固定在金电极的表面,采用间接竞争法原理,样品中的被测组分与电极上的固定化包被抗原竞争性结合溶液中的抗体。抗体抗原结合反应通过电化学阻抗谱和石英晶体微天平进行表征。将该免疫传感器用于检测青菜、苹果等农产品中的毒死蜱农药残留。结果表明,此免疫传感器灵敏度好、准确度高;对毒死蜱农药的检测限为0.01μg/mL,回收率大于85%,检测时间小于1 h,变异系数小于5%,传感器经过再生处理后能重复使用,经济性较好。该研究可为实现快速检测农产品中农药残留传感器的商品化提供参考。     

体外免疫法制备单克隆抗体的研究

本研究进行了三次体外免疫制备单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的试验，三次融合率分别为：８５．５９％（４９３／５７６），８４．５５％（４８７／５７６）和８５．０７％（４９０／５７６），而体内免疫法为８７．３３％（５０３／５７６）。在三次试验中，有两次产生抗体，经克隆后，与５５匹含有靶抗原的马红细胞反应中，各次试验获得的各株ＭｃＡｂ的最低反应率分别为８５．４５％（４７／５５），８０．００％（４４／５５），而体内免疫法为８３．６０％（４６／５５）。上述结果表明：小鼠脾细胞在体外培养４ｄ后，并不影响其与ＳＰ２／０（小鼠骨髓瘤细胞）的融合，而且在体外可接受抗原的刺激引起免疫应答，并产生抗体，其特异性与体内免疫法相似。     

利用BNYVV CP蛋白研制甜菜坏死黄脉病毒诊断试剂盒

将ＢＮＹＶＶ ＣＰ蛋白作为抗原，免疫家兔制备出了特异性强的ＢＮＹＶＶ抗血清，采用微量沉淀法测定其效价为１：１２０４。用改进的戊二醛二步法将ＨＲＰ酶标记到纯化的抗体上，得到了高质量的酶标抗体。在国内首次研制便于携带、易于操作和具有实用价值的ＢＮＹＶＶ ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒。     

H9亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备及鉴定

A型流感病毒(Influenza A viruses,IAVs)可以感染禽类和包括人类(Homo sapiens)在内的多种哺乳动物,造成重大经济损失,严重威胁人类健康。接种流感疫苗是预防流感发生的最有效手段,然而不同免疫策略对疫苗接种效果的影响仍未知。为探讨不同免疫策略对流感病毒免疫小鼠(Mus musculus)后抗体产生的影响,本研究选取两株血清学交叉反应性较弱的H9N2亚型禽流感病毒(A/chicken/Hubei/YK524/2015,A/chicken/Shandong/LX830/2014,分别简称为YK524和LX830)作为研究对象,比较了同源免疫与异源免疫以及病毒灭活与否对抗体产生的影响。首先将病毒通过蔗糖梯度离心纯化,免疫6~7周龄雌性BALB/C小鼠,定期采集血清测定血凝抑制效价(haemagglutinin inhibition titer,HIT)。结果显示,活病毒抗原较灭活病毒抗原刺激小鼠产生的抗体水平更高,具备良好的交叉反应性。说明活病毒更易于刺激机体产生具有广泛交叉反应性的抗体。另一方面,异源免疫可刺激机体产生更多交叉反应性抗体。本研究进一步选择抗体效价较高的两只小鼠,利用杂交瘤技术制备抗流感病毒单克隆抗体。采用间接免疫荧光法筛选抗体分泌克隆。将阳性克隆经过3轮亚克隆,最终获得3株持续分泌抗体的细胞株,分别命名为H9-1、H9-2和H9-3。在对抗体进行鉴定中,发现3株抗体均对LX830及另外1株H9N2亚型禽流感病毒A/Mink/Shandong/wm/2014(Mink/SD/14)具有血凝抑制活性及中和活性,H9-1与H9-2抗体的血凝抑制效价和中和抗体活性均高于H9-3。推测这3株抗体的抗原识别表位位于血凝素(haemagglutinin,HA)球部受体结合部位。3株抗体均不可与YK524发生特异性结合,也不具备血凝抑制活性及中和活性,推测可能与YK524的血凝素基因上关键位点的差异有关。本研究探讨了可刺激机体产生更广谱抗体应答的途径,为流感疫苗的研发以及免疫策略的制定提供了参考,所制备的单克隆抗体可用于流感病毒诊断试剂的开发。     

自组装膜电化学免疫传感器测定甲基对硫磷

利用自组装技术将三巯基丙酸固定在金电极上,以1-乙基-3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基硫代琥珀亚胺（NHS）作为活化剂,将甲基对硫磷抗体以共价键形式固定在三巯基丙酸自组装单分子膜修饰的金电极上,制备了一种免疫传感器。根据抗体与抗原之间特异反应前后电极电位的变化对甲基对硫磷进行定量测定,该传感器的检测下限为0.085 µg/ml,检测范围为0.5~15µg/ml,并可以再生、重复利用。     

抗氯霉素多克隆抗体的制备

用重氮化和CDI两种方法合成了CAP全抗原 ,紫外分析和商业试剂盒ELISA鉴定表明合成成功 ;动物免疫 4次后采血检测 ,多克隆抗体 50 %抑制率探测限可达1 0ng/ml,效价可达 1 0万以上稀释倍数 ,特异性较好。     

基于双功能螯合剂NOTA的重金属铜人工抗原的合成与鉴定

为研究杂环类双功能螯合剂在重金属铜人工抗原制备方面的效果,以2-S-(4-氨基苯)-1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(P-NH_2-Bn-NOTA,简写为NOTA)为双功能螯合剂,采用戊二醛法将重金属铜离子分别与载体蛋白BSA、OVA偶联制备免疫原和包被原,并用合成的免疫原免疫制备免多克隆抗体,建立间接竞争ELISA(ic-ELISA)。结果表明,所建立的ic-ELISA线性回归方程为y=7.8632Ln(x)+9.6765(R2=0.9934),IC50和IC20值分别为168.70、3.72 ng·m L-1。交叉反应试验结果显示,除与锌交叉反应率达16%外,该抗体与其他重金属铁、铅和镉的交叉反应率均小于5.6%。本研究成功合成了重金属铜人工抗原并制备了兔多克隆抗体,为杂环类双功能螯合剂应用于重金属快速检测技术奠定了理论基础。