猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5基因的变异分析

从河北、江西猪场中分离到3株猪繁殖与呼吸综合征病毒(HB-1(sh)／2002、HB-2(sh)／2002和JX-1／2002)。采用RT-PCR方法扩增其完整的ORF5基因片段，进行了序列测定，并与其它5个国内毒株的ORF5基因序列进行了比较和变异分析。所有这些毒株的ORF5基因均编码200个氨基酸，推导的氨基酸相似性在88．2％～99．0％之间。其中BJ4、S1及J1间的相似性较高，在98％～99％之间；HB-1(sh)／2002，HB-2(sh)／2002，JX-1／2002及CH-1a间的相似性为92％～96％之间。根据ORF5基因核苷酸序列的遗传进化距离，这些毒株可分为两个亚群，BJ4、S1和J1为一个亚群，与VR2332及疫苗毒株接近；HB-1(sh)／2002、HB-2(sh)／2002、JX-1／2002和CH-1a为另一个亚群。     

表达外源基因的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性克隆的构建及病毒拯救

为建立表达标记基因的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)反向遗传操作平台,本研究在PRRSV HuN4-F112疫苗株感染性分子克隆的基础上,采用突变PCR技术将新城疫病毒(NDV)NP蛋白末端优势抗原区插入PRRSV NSP2蛋白的复制非必须区,经基因片段的克隆、拼接,构建了含有外源标记基因的感染性的PRRSV cDNA克隆psk-HuN4-F112-Δ52+NP49。用限制性内切酶SwaΙ将psk-HuN4-F112-Δ52+NP49线性化后通过细胞外转录获得病毒RNA,用脂质体法将病毒RNA转染叙利亚仓鼠肾细胞(BHK-21)包装出病毒粒子,再转接到猴胚胎肾上皮细胞(MACR-145)传代拯救病毒。对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定。结果表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记(病毒基因组14667位人工产生的MluⅠ酶切位点)和插入的标记基因序列。间接免疫荧光试验表明,外源基因NP49在拯救的PRRSV中表达,且能够在PRRSV传代过程中稳定遗传。病毒生长特性比较显示,拯救病毒与亲本病毒在MARC-145细胞上具有相似的增殖特性。本研究构建了含有标记基因PRRSV的感染性克隆并获得了拯救病毒,为进一步开发新型PRRS疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒ORF5基因的融合表达

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合症病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus , PRRSV)ORF5基因的核苷酸序列设计3对特异性引物，从重组质粒pMD- ORF5中扩增去除ORF5基因中包括全部信号肽在内的N端跨膜区(28 residues)和中部跨膜区(60 residues)。改造后的ORF5基因分别命名为ORF5-1和 ORF5-2。将2个基因片段定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-ORF5-1和pET-ORF5-2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞，经IPTG诱导表达和SDS-PAGE电泳分析，ORF5-1和ORF5-2基因获得融合表达，表达量分别为12.2%和39%，证明删除双跨膜区能明显提高ORF5基因的表达量。经Western blot分析，融合蛋白具有一定的免疫学活性，表明摘除跨膜区对该蛋白的抗原性影响不大。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） BJ-4株ORF2基因的原核表达

通过PCR方法从重组质粒pGEM-ORF2扩增得到缺失N端疏水序列的基因片段dORF2(deleting ORF2)。将dORF2克隆至原核高效表达载体pGEX-4T-2，在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21细胞中成功地表达了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组蛋白GST-dORF2，表达量为22％。Westem-blot结果表明重组蛋白可被谷胱甘肽S-转移酶(GST)抗体识别。表达的重组蛋白为进一步研究PRRSV次要结构蛋白的结构和功能奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的表达及其单克隆抗体的制备

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and resp iratory syndrom e,PRRS)是以妊娠母猪繁殖失败和仔猪出现呼吸困难为特征的传染病,PRRSV是该病的病原体。将PRRSV CH-1a株ORF6基因疏水性较强的区域删除后,克隆于pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌,并进行诱导表达。经SDS-PAGA分析发现,表达了M r约为37 000的融合蛋白rtM,W estern b lot分析证实,重组蛋白能被PRRSV抗血清所识别。收获融合表达的rtM,按50μg/只的剂量与等量弗氏佐剂乳化后,经腹腔接种BALB/c小鼠,免疫3次后,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,用rtM作为包被抗原,通过间接EL ISA方法筛选阳性克隆,结果获得了1株能稳定分泌抗rtM蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为M 2B3。间接免疫荧光检测结果发现,所获得的单克隆抗体能与PRRSV感染细胞产生特异性免疫荧光。亚型鉴定结果显示,单克隆抗体M 2B3为IgG 1型,其轻链均为κ链。研究获得的融合蛋白rtM及单克隆抗体将为今后深入研究PRRSV病毒结构和功能,分析M蛋白的抗原表位等提供有益帮助。     

用噬菌体随机肽库分析猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） N蛋白单克隆抗体识别的表位

利用噬菌体随机7肽库分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白B细胞抗原表位。以PRRSV BJ-4株N蛋白的单克隆抗体(mAb)GE3作为筛选分子，筛选噬菌体展示的随机7肽库。经序列测定和分子生物学软件分析，表明噬菌体展示的外源氨基酸序列与PRRSV BJ-4株N蛋白的50～55aa的氨基酸序列有极高的同源性。ELISA分析结果表明，筛选到的噬菌体能特异性地与PRRSV阳性血清结合，从而证实了该表位是单克隆抗体GE3所识别的抗原表位。     

荧光显色在环介导等温扩增（LAMP）检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的应用

介绍了一种应用荧光显色的猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)反转录环介导等温扩增(RT-LAMP)的检测方法.该方法使用了针对靶序列M+N基因的一组引物,并且能在63 ℃等温条件下30 min内完成反应.在敏感性检测中RT-LAMP与RT-PCR都能检测103个包含靶基因片段的重组质粒.几种其它病原的核酸也被用来比较这两种方法的特异性,两种方法只能检测PRRSV.在荧光显色剂应用试验中,证实0.05 mmol/L钙黄绿素以及0.6 mmol/L锰离子可以用于LAMP扩增产物的判断,并且其判断结果与浊度判断结果一致.在对103个临床血液样本的检测中,RT-LAMP与RT-PCR检出的阳性样本数量分别是56个和48个.结果说明,应用荧光显色剂的RT-LAMP检测方法可以快速检测PRRSV.     

PRRSV GP5和M蛋白重组腺病毒对猪的安全性和免疫效力

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) GP5 重组腺病毒(recombinant Adenovirus-GP5,rAd-GP5)和M蛋白重组腺病毒(rAd‐M)分别接种4只30日龄PRRSV阴性断奶健康仔猪，结果为仔猪接种后2周内体温和食欲正常，猪血液、鼻塞、粪便和猪舍环境中重组腺病毒及其野生型腺病毒检测均为阴性。同时，将rAd‐GP5、rAd-M、rAd-GP5+M (rAd-GP5和rAd-M,V/V=1)和PRRSV-Resp弱毒株分别接种4只30日龄PRRSV阴性仔猪，不同时间检测PRRSV抗体，结果为免疫后14和45 d可检出PRRSV ELISA抗体和中和抗体；免疫后60～90 d，rAd-GP5和rAd-M免疫组ELISA抗体滴度均达1∶2400以上，与PRRSV‐Resp弱毒免疫组相似，而中和抗体滴度达1∶6以上，低于PRRSV-Resp弱毒免疫组；rAd-M免疫组ELISA抗体和中和抗体滴度则低于rAd‐GP5免疫组。rAd-GP5和rAd-M混合免疫组ELISA抗体达1∶4800,其中和抗体滴度与其单独免疫组相似。15只仔猪免疫后28 d进行攻毒保护试验，结果为重组腺病毒免疫猪攻毒后3 d平均体温为39.5℃,病毒血症和排毒时间仅为2周，与PRRSV-Resp弱毒免疫组相似，而空白对照组病毒血症和排毒时间至少60 d。攻毒后7～14 d，rAd-GP5和rAd‐M免疫组ELISA抗体和中和抗体水平明显升高。研究表明rAd-GP5和rAd-M重组腺病毒具有较好的安全性，均可诱导猪体产生较好的免疫反应，两者具有明显的协同免疫作用。     

苹果蠹蛾颗粒体病毒(CpGV)GP37蛋白在Bac-to-Bac系统中的表达和亚细胞定位

苹果蠹蛾颗粒体病毒(Cydia pomonella granulovirus,CpGV)是防治苹果蠹蛾最重要的生物药剂之一,为探寻苹果CpGV GP37蛋白的增效机制,本研究利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将苹果CpGV gp37基因和绿色荧光蛋白基因(egfp)以N端或C端融合的方式插入苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleocapsid NPV,AcMNPV)基因组中,获得重组的杆状病毒质粒(bacmid),转染昆虫细胞Sf9,然后进行Western blot检测。结果显示,检测到GP37和EGFP的融合蛋白(vAcEGFPGP37、vAcGP37EGFP)和非融合蛋白(vAcGP37、vAcEGFP)都得到了高效表达;用激光共聚焦显微镜观察蛋白的亚细胞定位情况,融合GP37的EGFP主要聚集在细胞质中,没有融合GP37的EGFP遍布整个细胞,说明CpGV GP37蛋白定位于细胞质中。本实验研究了CpGV GP37蛋白的真核表达,为该蛋白的后续研究提供了条件;而该蛋白的亚细胞定位研究,不仅为CpGV GP37蛋白增效机制的研究提供了基础资料,同时丰富了杆状病毒GP37蛋白的相关理论。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株全长cDNA的构建

依据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)BJ-4株全基因组序列，分6段设计引物A1F／A1R、A2F／A2R、B1F／B1R、B2F／B2R、C1F／C1R和D1F／D1R，应用RT-PCR技术扩增出其全基因组cDNA片段。将各cDNA重叠片段AJ、A2、BI、B2、C和D分别克隆入pGEM-T Easy载体后，依次连接并克隆到低拷贝质粒载体pWSK29，获得该毒株全长cDNA克隆pWSK DCBA。为进一步研究该毒株的感染性cDNA克隆和深入研究PRRSV的分子致病机理以及发展安全有效的活病毒疫苗奠定了基础。     

核酸探针检测人工感染猪及死胎的猪繁殖与呼吸综合症病毒

利用反转录－聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合症病毒（ＰＲＲＳＶ）美洲株ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２ＯＲＦ６及部分ＯＲＦ７５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ。将ＰＣＲ产物连接进线状克隆载体ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ后获阳性重组质粒。用ＥｃｏＲＩ及ＳｍａＩ双酶切阳性重组质粒ＤＮＡ,回收４６３ｂｐ的小片段并以此制备出地高辛标记的核酸探针。应用该探针对４头鼻内人工感染ＡＴＣＣＶＲ－２３３２的     

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）BJ—4株全基因组序列测定与分析

在国内首次完成了猪繁殖与呼吸综合征病毒分离毒株的全基因组序列测定。用RT－PCR方法分段扩增出PRRSV北京地区分离株BJ－4株的21条cDNA片段，分别克隆于pGEM-T-easy质粒载体并进行测序，按顺序将这些序列进行拼接得到PRRSV BJ－4株全基因组cDNA序列。测序结果表明PRRSV BJ－4株基因组全长15504b，包含8个开放阅读框，5′端有190nt先导序列；3′端有256ntUTR，其中包括95ntPoly(A)尾。PRRSV BJ－4株与美洲型毒株VR－2332和Nebreska的核苷酸同源率分别为99．5％和98．4％，而与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源率为62．5％，与另一国内分离株CH－1a株编码构蛋白基因的核苷酸同源率为93．3％。     

猪生殖和呼吸综合征病毒中国分离株B13株ORF5基因在杆状病毒系统中的表达

本研究将PRRSV B13株ORF5基因克隆到杆状病毒转移载体质粒pVL1393中,构建了重组转移载体质粒pVL1393-ORF5.用该重组转移载体质粒与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV-SVI-G)基因组DNA(BaculoGold Linearized Baculovirus DNA)共转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda,sf9)细胞,得到重组病毒AcMNPV-OCC-- ORF5 .在感染了重组病毒的sf9细胞中成功地检测到分子量为25kD的ORF5基因表达产物,其能被猪抗PRRSV B13株多克隆血清特异识别.表明sf9细胞表达了所期望的产物,进而也说明基因片段的正确性.猪抗PRRSV VR-2332株多克隆血清对ORF5基因的表达产物无反应,而猪抗LV株多克隆血清则能特异识别,说明PRRSV中国分离株B13株在抗原性上更接近欧洲亚群分离株LV株的抗原性,进一步证实了PRRSV中国分离株B13株属于欧洲亚群.ORF5基因表达产物与天然蛋白分子量十分接近,说明杆状病毒表达系统能较适当的进行合成蛋白的加工和修饰.本研究的结果为PRRS基因工程疫苗的研究奠定了基础.     

猪生殖和呼吸综合征病毒中国分离株B13株ORF5基因在杆状病 …

本研究将ＰＲＲＳＶＢ１３株ＯＲＦ５基因克隆到杆状病毒转移载体质粒ｐＶＬ１３９３中,构建了重组转移载体质粒ｐＶＬ１３９３－ＯＲＦ５。用该重组转移载体质粒与线性化苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＭＮＰＶ－ＳＶＩ Ｇ）基因组ＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ Ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＤＮＡ）共转染草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ,ｓｆ９）细胞,得到重组病毒ＡｃＭＮＰＶ     

体内外感染PRRSV处理下仔猪脾淋巴细胞增殖活性的变化

为了探讨体内或体外感染猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）的仔猪脾淋巴细胞在体外培养的增殖能力,本研究将PRRSV—GXA分离株经Mare-145细胞大量增殖培养,然后体内感染仔猪,接种病毒后分别于第11天、第14天和第21天从活体猪收获脾脏,分离脾淋巴细胞后用ConA和LPS于体外进行诱导增殖。研究结果显示第11天收获的T淋巴细胞增殖能力高于对照组,而B淋巴细胞增殖能力明显下降;第14天收获的T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力均极显著低于对照组;第21天收获的B淋巴细胞增殖能力略高于对照组,T淋巴细胞增殖能力略低于对照组。同时,用不同滴度的PRRSV体外感染PRRSV阴性的猪脾淋巴细胞,经ConA和LPS诱导增殖后,发现病毒滴度在10^3-10^6TCID50/mL范围内,能明显提高脾淋巴细胞的体外增殖能力;而病毒滴度在10^0-10^2TCID50/mL范围时,脾淋巴细胞增殖能力低于对照组。本研究结果说明PRRSV体内或体外感染对仔猪脾淋巴细胞增殖活性均有显著的影响,将为临床上PRRS的综合防治提供理论依据。