家蚕丝心蛋白轻链基因的克隆及品种间的比较

从蚕品种浙蕾×春晓的蛹中提取基因组DNA ,用PCR的方法克隆出家蚕丝心蛋白轻链基因 3’端 ,包含第 2到第 7外显子区 5 5kb的DNA片段。经测序并与蚕品种J- 139丝心蛋白轻链基因相同区域的比较表明 ,蚕品种间丝心蛋白轻链DNA序列同源性为 95 6 % ,氨基酸序列同源性为 98 8%。     

家蚕丝蛋白基因的表达调控

至少有三种基因特定地在家蚕后丝腺(PSG)中表达,而在中丝腺(MSG)中至少有五种基因特异表达。在这些基因的表达过程中,有很多顺式和反式作用因子参与了对基因转录和翻译的调节,使基因表达体现出精确的时间和空间性。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

家蚕丝素重链表达系统表达外源蛋白的应用研究进展

家蚕丝腺拥有出色的丝蛋白合成能力,家蚕又具有容易饲养、生长周期短等优点,利用家蚕丝腺来生产大量有价值的蛋白,生产出的重组蛋白可在生物、医药、材料学等领域广泛应用,所以家蚕丝腺是一种理想的生物反应器。高效表达系统的构建是家蚕丝腺生物反应器产生重组蛋白的关键步骤之一。为了构建出更加优良的表达系统,结合国内外研究进展,对家蚕丝素重链表达系统的建立、发展与应用情况进行综述,为该系统的深入研究与应用提供参考。     

家蚕不同发育时期对氟化物的敏感性试验

本文对家蚕不同发育时期对氟化物的敏感性进行了研究。结果表明:无论2、3、4、5龄期蚕儿均以起蚕第1天对氟化物最为敏感。随蚕儿发育时期的延长,对氟化物的抵抗性相应增强。连续吃氟化物污染叶的危害大于偶尔一天的危害。同样天数吃氟化物污染叶,以龄初期的危害大于后期的危害。     

家蚕中肠组织在变态发育不同时期的蛋白表达差异分析

分析了家蚕在变态期不同发育时段中肠组织蛋白表达差异的信息。SDS-PAGE电泳分析显示,从家蚕吐丝前1 d到化蛹72 h的中肠蛋白分离到相对明显的16条泳带,其中分子量约为30、45、70 kD的蛋白组分含量较大,且比较稳定,分子量约为50、60、62 kD的蛋白组分在不同时期存在着显著的表达差异。进而通过聚丙烯酰胺双向凝胶电泳分析,发现家蚕中肠组织蛋白的表达种类和差异蛋白数目的变化在化蛹1～3 d非常明显:蛋白表达种类的变化呈现2个高峰,分别为化蛹0 h和化蛹41 h;差异蛋白数目的变化呈现3个波峰,分别在吐丝98 h至化蛹0 h、化蛹30～41 h和化蛹41～58 h。在化蛹1～3 d,这种显著峰值变化的时期刚好与家蚕中肠组织发生旧肠壁细胞退化死亡和新生肠壁细胞分化增殖的盛期相吻合,从一个侧面反映了家蚕中肠组织在变态期活跃的发育进程。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6在不同发育时期的表达分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是一类具有重要生理调控功能的蛋白酶超家族。为研究家蚕serpin-6基因(Bmserpin-6)在蚕体内的功能,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因mRNA在家蚕不同发育时期的转录水平。Bmserpin-6基因在家蚕各个发育阶段均有表达,在4龄眠期、5龄6d、吐丝48h(化蛹前)和化蛹6d的转录水平较高,在5龄4d、吐丝初期和蛹末期的转录水平较低。Bmserpin-6基因在5龄期家蚕精巢和卵巢中的表达均呈现先下降后上升的趋势。研究结果表明,Bmserpin-6基因mRNA的转录具有明显的时空特异性,推测其在家蚕不同的变态发育期执行不同的功能。     

家蚕丝素蛋白H链基因启动子区域的克隆及活性分析

家蚕(Bombyxmori)丝素蛋白H链基因(fib-H)具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。为利用其时空调控机制,通过PCR扩增方法克隆fib-H启动子片段,并进行序列分析,进而构建由fib-H启动子控制报告基因DsRed的重组载体pSK-FH-DsRed-PolyA,通过家蚕BmN细胞和丝腺进行瞬时表达。结果表明:克隆的fib-H启动子序列具有典型的丝腺特异性表达启动子的特征,并可以驱动DsRed报告基因在BmN细胞和家蚕后部丝腺组织中瞬时表达。     

家蚕丝素基因的研究进展

家蚕丝素蛋白基因不仅高度专一地在后部丝腺中表达，而且在家蚕胚胎发育及幼虫发育过程中，丝素蛋白基因的表达在时间和空间上受到精细的调控，因此研究丝素蛋白基因的调控方式，能使我们了解生物体如何利用遗传信息，对基因进行时间和空间上的表达调控。调控丝素蛋白基因表达专一性的启动子／增强子结构相对较为简单，也更利于研究。本文就近年来在家蚕丝索蛋白基因研究中取得的成果进行综述。     

家蚕丝素重链启动子克隆片段在家蚕体内和昆虫培养细胞内的渗漏表达

为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部;克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光;克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。     

不同截短的丝素重链基因启动子驱动报告基因在家蚕组织中的表达

应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,研究不同截短的丝素重链基因启动子(-2127/+23、-925/+23和-238/+23)驱动报告基因在家蚕5龄幼虫组织中的表达情况。结果发现,通过病毒感染介导,3种长度丝素重链基因启动子驱动的报告基因在脂肪体和血细胞中存在异位表达,从个体体表可直接观察到明显的绿色荧光;3种长度的启动子都能在后部丝腺中高效起始EGFP的转录,产生绿色荧光;长度为0.9kb和0.2kb的启动子0.9KH、0.2KH在中部丝腺能起始EGFP转录产生绿色荧光,而2.1kb的启动子(2.1KH)能起始EGFP转录,但未能检测到绿色荧光;3种长度的启动子也能在Sf9培养细胞中起始EGFP基因表达。上述结果表明,丝素重链基因启动子没有严格的组织特异性。     

类蚕丝丝素结晶区蛋白表达载体的构建与表达

为探讨蚕丝结构与性能的关系,设计了几种类似蚕丝丝素结晶区高度重复序列结构(GAGAGX)n的基因序列,并构建了大肠杆菌表达载体,在BL-21菌株中成功诱导表达了4种约由110个氨基酸组成的小分子蛋白。对表达产物进行W estern印迹分析和ELISA检测的结果显示,(GAGAGA)n、(GAGAGY)n、(GAGAGV)n3种蛋白都有小于14.4 kD的大小相同的条带,而(GAGAGS)n有一条稍大于20.1 kD的条带。以超声波破菌的缓冲液作空白对照,4种蛋白的ELISA的结果均比对照的BL-21(无质粒)高,显示为阳性。     

外源蜕皮激素和保幼激素类似物对家蚕丝腺蜕皮激素受体基因表达活性的影响

为了进一步探讨外源蜕皮激素（Moulting hormone,MH）和保幼激素类似物（Juvenile hormone analogue,JHA）处理家蚕的增丝机理,本试验分别于5龄24h注射植源性MH和5龄72h注射JHA,采用半定量RT-PCR方法,测定了蜕皮激素受体（ecdysone receptor,EcR）（BmEcR-B1型）基因在家蚕5龄不同发育时期在中部丝腺和后部丝腺中表达量的变化。结果表明,正常对照家蚕丝腺中,EcR基因的表达均在5龄前期表达量较低,中后期表达量较高,但丝腺不同部位,表达模式不同。5龄24h用MH处理后,无论是中部丝腺还是后部丝腺,EcR基因的表达活性与对照组相比,总体上均是先上调后下降;而5龄72h用JHA处理,EcR基因的表达一直到对照熟蚕前均低于对照区;但两种处理区在对照区熟蚕之后仍有不同程度的表达。说明外源激素可通过影响MH受体基因的表达,从而影响了MH信号转导,进一步影响丝蛋白的合成。     

应用重组家蚕核多角体病毒在蚕体中表达人丙型肝炎病毒C区及E1区基因

将人丙型肝炎病毒的C区、E1区及部分E2区基因装入转移载体 pBM0 3 0 ,经原位杂交筛选、酶切鉴定、Southern杂交检测确定转移质粒装载成功。将转移质粒与家蚕核多角体病毒重组 ,在家蚕BmN细胞中挑选重组病毒 ,经点杂交技术确证重组病毒带有目的基因。将重组家蚕核多角体病毒通过针刺和注射方法感染蚕蛹及 5龄期家蚕 ,肽抑制试验检测目的基因表达的多肽活性。结果表明 ,目的基因已得到表达 ,表达量较高 ,为每蛹体约 60～ 60 0 μg。     

sch基因在家蚕性别控制及单养雄蚕品种选育上的应用研究

将伴性赤蚁基因导入经济性状优良的实用家蚕品种 ,育成单养雄蚕实用系统纯系夏sch、秋sch ,其经济性状基本达到实用水平。配制的夏芳×秋sch、秋白×夏sch为单养雄蚕杂交种 ,实验室和农村小区试验证明其茧丝质成绩明显优于对照 ,可在生产上推广应用 ,并且可降低雄蚕品种的繁育成本。