应用多重RT2PCR检测百合无症病毒和百合斑驳病毒

 根据病毒外壳蛋白基因序列, 设计了2对检测百合无症病毒(LSV) 、百合斑驳病毒(LMoV)的引物, 对扩增条件进行优化, 建立了同时检测LSV和LMoV的多重RT-PCR检测方法。此方法可特异地从带有LSV和LMoV的样品中扩增出2条带LSV (876 bp) 、LMoV (662 bp)。灵敏性测定结果表明, 该双重PCR可从稀释10⁴ 组织中检测出病毒, 具有与单一PCR相同的灵敏性。扩增产物测序表明, LSV扩增产物与其它分离物核苷酸同源性为87.8%～99.3%, LMoV扩增产物与其它分离物的同源性为90.1%～99.5%。     

喇叭水仙中百合斑驳病毒的RT-PCR检测及序列分析

 根据基因库中已发表的百合斑驳病毒（Lily mottle virus, LMoV）外壳蛋白基因序列设计引物,通过RT-PCR方法从喇叭水仙Narcissus pseudonarcissus‘Pink-charm’ 样品中扩增出1条大小与试验设计相符的553 bp的特异性LMoV RT-PCR带。扩增产物序列分析表明：与GenBank中百合斑驳病毒百合分离物核苷酸相似性在90%以上。将该序列翻译为外壳蛋白的氨基酸序列ABW16938发现它完全存在于GenBank上已登录的LMoV病毒外壳蛋白序列NP-945145中,确认喇叭水仙该样品感染了百合斑驳病毒。     

香蕉两种主要病毒多重PCR检测方法的建立

 根据香蕉束顶病(Banana bunchy top virus, BBTV) 和香蕉花叶心腐病(Cucumber mosaic virus,CMV) 的复制酶基因、外壳蛋白基因序列分别设计特异性引物对, 在BBTV单一PCR和CMV RT-PCR优化体系的基础上, 建立了可同时检测BBTV、CMV的多重PCR检测方法。此方法可以特异地从感染BBTV和CMV的样品中扩增出2条带, BBTV (748 bp) 和CMV (557 bp) 。扩增产物序列测定结果表明, BBTV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为91% ～99% , CMV扩增产物与GenBank中其他分离物的核苷酸序列同源性为93%～98%。     

酿酒葡萄4种病毒多重RT-PCR检测体系的建立

【目的】建立快速、灵敏的葡萄病毒多重RT-PCR检测体系。【方法】通过设计6对不同引物,在退火温度分别为48.0、49.0、50.0、51.0、52.0、53.0、54.0、55.0、56.0、57.0、58.0、59.0和60.0℃,采用单一RT-PCR技术检测酿酒葡萄6种常见的葡萄病毒,即葡萄病毒A(Grapevine virus A,GVA)、葡萄斑点病毒(Grapevine fleck virus,GFKV)、葡萄扇叶病毒(Grapevine fanleaf virus,GFLV)、葡萄卷叶病毒1(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-1)、葡萄卷叶病毒2(Grapevine leafroll associated virus-1,GLRa V-2)和葡萄卷叶病毒4(Grapevine leafroll associated virus-4,GLRa V-4)。在此基础上,对退火温度相似、扩增片段长度不同的引物进行组合,建立能同时检测2种或2种以上病毒的多重RT-PCR检测体系。【结果】单一RT-PCR结果显示,退火温度为49℃、55℃和60℃时,可分别检测GVA和GLRa V、GLRa V和GFKV以及GFLV和GLRa V。多重RT-PCR结果显示,退火温度分别为49℃和55℃时,引物GVA和GLRa V-2以及引物GLRa V-1和GFKV组合所建立的2个多重RT-PCR检测体系可同时检测葡萄叶片中GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV。所检测的河西地区16份样品普遍携带葡萄病毒,部分葡萄样品同时携带两种病毒。其中,5份样品为GVA阳性,8份为GLRa V-1阳性,3份为GLRa V-2阳性,5份为GFKV阳性,所有样品均未检测到GFLV和GLRa V-4。退火温度分别为49℃和55℃时所建立的GVA和GLRa V以及GLRa V和GFKV两个多重PCR扩增体系检测结果与各样品单一PCR检测结果均一致。【结论】建立2套多重PCR检测体系,可同时有效地检测GVA和GLRa V-2或GLRa V-1和GFKV,可用于田间葡萄样品的快速检测。     

香蕉3种病毒的多重PCR检测体系

根据GenBank中已发表的香蕉束顶病毒（Banana bunchy top virus,BBTV）﹑黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和香蕉线条病毒（Banana streak virus,BSV）的基因序列,找出保守序列分别设计出特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,建立了能同时检测3种病毒的多重PCR检测体系。该体系可同时扩增BBTV的615 bp、CMV的480 bp和BSV的945 bp的特异片段。这些片段克隆测序结果表明,多重PCR扩增的不同病毒片段是特异和专化的,其核苷酸序列与相应的病毒基因片段的相似性都达91%以上。该体系的灵敏度测定结果表明,从相当于或大于10-2 mg感病植物组织中均能检测到这3种病毒。     

葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

西番莲TeMV和CMV双重RT-PCR检测体系的建立及应用

【目的】建立西番莲夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)的双重RT-PCR检测体系。【方法】根据TeMV和CMV的外壳蛋白(coat protein, CP)基因序列,分别设计两对特异性引物,并对引物组合浓度、退火温度和循环次数进行优化。【结果】优化结果显示:TeMV和CMV最佳引物组合浓度分别为2.0 mmol·L~(-1)和8.0 mmol·L~(-1);最佳退火温度为57℃;最佳循环次数为35次。【结论】灵敏度分析结果显示,在样品c DNA原液稀释到10-5时,仍能检测到两种病毒扩增出的目的条带。同时,以健康组培苗作为对照组,应用建立的双重RT-PCR检测技术对采集于福建省不同产地的36份西番莲样品进行了病毒检测,发现有8份样品同时感染两种病毒,8份样品仅感染TeMV,10份样品仅感染CMV。本研究可为西番莲TeMV和CMV的检测提供便利。     

利用RT-PCR技术检测辣椒轻斑驳病毒的研究

在田间病害调查过程中发现的一批感染病毒病的辣椒样本,经摩擦接种技术将病毒接种于烟草叶片,以期进行病毒鉴定.结果表明:经摩擦接种后烟草叶片显示斑驳、花叶症状;采用CTAB法提取辣椒及烟草叶片总RNA,利用RT-PCR技术,以辣椒轻斑驳病毒(Pepper mild mottle virus,PMMo V)特异引物,扩增出了预期大小片段,经测序证明其为PMMoV特异片段.     

两步多重RT-PCR快速检测苹果潜隐性病毒

【目的】为建立检测3种苹果潜隐性病毒更为快速准确的方法,【方法】以携带苹果茎沟病毒(ASGV)、苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)和苹果茎痘病毒(ASPV)的成龄苹果树韧皮部为试材,根据基因库中苹果茎痘病毒(Apple stempitting virus,ASPV)的外壳蛋白基因序列,设计合成了2对特异性引物,分别与合成的苹果茎沟病毒(ASGV)引物和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV)的引物组合配伍,筛选出最佳的引物对组合。对cDNA的合成所用引物和总RNA模板进行遴选和量化,对PCR过程中cDNA的用量、引物对的终浓度、退火温度等主要影响因素进行优化。【结果】结果表明,反转录引物为Oligo(dT)18、总RNA 0.1～3.0μL时,可以得到较好的cDNA;ASPV-FR与ASGV-Pch、ACLSV-Pch引物组合优于ASPV-Pch,并且筛选出4组最佳的终浓度处理组合;cDNA用量为2.0~4.0μL、退火温度为50.0~52.9℃、循环数为35时,扩增效果较好。采用优化的多重RT-PCR体系对采自陕西和山东两省的样品进行检测,并用3种病毒的单重RT-PCR体系进行验证。【结论】结果呈现高度一致性,充分印证了该多重RT-PCR体系的准确性,适用于大量样品的快速检测。     

草莓斑驳病毒的RT-PCR技术检测

针对草莓斑驳病毒(SMV)基因组外壳蛋白保守序列设计特异引物,利用改进的CTAB法提取出优质的草莓斑驳病毒的总RNA,然后进行RT-PCR分子检测以期建立草莓斑驳病毒的RT-PCR检测体系。结果表明:RNA质量完好,证明改进的CTAB法应用于草莓总RNA的提取是切实可行的。     

应用多重RT - PCR检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒

 建立了多重RT - PCR同时检测草莓斑驳病毒( SMoV) 和草莓轻型黄边病毒( SMYEV) 的技术体系, 对草莓田间植株和试管苗都可以有效进行检测。多重PCR引物根据引物之间的互补性及引物的Tm值进行筛选。适宜的PCR缓冲液的浓度为2 ×, 退火温度为57℃, 延伸温度为66℃。分别利用单一PCR和多重PCR对微茎尖培养获得的草莓品种宝交早生的11个株系进行了脱毒效果鉴定。     

侵染节瓜的3种病毒多重PCR检测体系的建立

 根据侵染节瓜3种病毒——小西葫芦黄花叶病毒（ZYMV）、番木瓜环斑病毒（PRSV）和黄瓜花叶病毒（CMV）的外壳蛋白基因保守区序列设计特异引物,在建立各种病毒单项PCR技术的基础上,通过优化多重PCR反应条件,初步建立了能同步、快速、灵敏地检测这3种病毒的多重PCR检测体系,为节瓜病毒病原的检测提供了理论与技术支持。     

3种苹果潜隐病毒多重RT-PCR检测体系的建立

 研究建立了能同时检测苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV) 、苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV) 和苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus, ASPV) 的多重RT-PCR方法。以复合感染3种病毒的苹果‘望山红’组培苗为试材, 对影响多重PCR的反应条件进行了一系列的调整和优化。多重RT-PCR体系灵敏性测验显示, 最低能从RNA总量187.5 ng的样品中检测3种病毒的存在。多重RT-PCR产物的序列与报道的病毒序列有较高的同源性, 12个田间苹果样品的多重RT-PCR检测结果与单一PCR的结果一致, 初步证明了多重RT-PCR检测的准确性。     

黄瓜花叶病毒的RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒(CMV)的复制酶基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,CMV质粒作为RT-PCR反应的阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增.对2002-2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的767bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物.结果表明98份材料中96.94%检测到CMV.     

利用siRNA高通量测序和RT-PCR技术鉴定引起茄子斑驳紫花病的病毒种类

为了明确引起茄子斑驳紫花病的病毒种类,利用小干扰RNA(si RNA)高通量测序技术,结合生物信息学方法寻找茄子样本中的病毒序列,发现存在烟草轻型绿花叶病毒(Tobacco mild green mosaic virus,TMGMV)和番茄斑驳花叶病毒(Tomato mottle mosaic virus,ToMMV)。为了验证该结果,对待测样品中TMGMV和ToMMV的外壳蛋白(coatprotein,CP)全长基因进行RT-PCR扩增和系统进化分析,分别得到500bp的TMGMV-CP和482bp的ToMMV-CP特异性条带,与GenBank中TMGMV和ToMMV序列相似性分别达到98%～100%和100%,说明待测样品中确实存在TMGMV和ToMMV。对采自山东、河南、辽宁、河北等地的23份疑似斑驳紫花病茄子样品,分别采用特异性引物524-F/R和ToMMV-F/R进行检测。结果显示,所有样品中均含有TMGMV,20份样品中含有ToMMV,复合侵染检出率为86.96%。对茄子、番茄和辣椒幼苗的致病性检测显示,接种后茄子花表现出与田间相同的症状,茄子、番茄和辣椒的叶片表现典型的病毒侵染症状,在接种发病组织中检测到病毒ToMMV和TMGMV。结果表明,茄子斑驳紫花病样中鉴定出TMGMV和ToMMV两种病毒。