鸡肠炎沙门氏菌ompA基因的克隆与表达

根据GenBank中鸡肠炎沙门氏菌ompA基因序列设计1对引物,以鸡肠炎沙门氏菌贵州分离株基因组为模板,扩增鸡肠炎沙门氏菌ompA基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建重组表达质粒pET-32a-ompA,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞, 经IPTG诱导, 实现了鸡肠炎沙门氏菌ompA蛋白在大肠杆菌中的表达。SDS-PAGE分析结果表明, 该重组蛋白的分子质量约为55 ku,可溶性分析结果表明表达蛋白大部分以包涵体形式存在。Western blotting分析结果表明,该重组蛋白具备免疫原性。     

1型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及其ompA基因B细胞表位预测

本研究从贵州发病鸭中分离到1株致病菌,经生化试验、16S rRNA序列分析、血清学试验和动物回归试验,鉴定为1型鸭疫里氏杆菌(RA),药敏试验结果表明,其对头孢拉定、头孢曲松钠、头孢噻肟和氟苯尼考高度敏感;同时根据GenBank中鸭疫里氏杆菌ompA基因序列,设计1对引物,成功克隆出鸭疫里氏杆菌ompA基因,扩增产物大小为1149 bp。采用DNAStar Protean程序,综合运用二级结构、亲水性、可塑性和抗原性指数等参数,对鸭疫里氏杆菌ompA基因的氨基酸序列进行了B细胞表位预测,为进一步研究鸭疫里氏杆菌表位疫苗和分子诊断技术的建立奠定基础。     

B细胞抗原表位预测方法的研究进展

抗原表位是抗原分子的主要功能单位。B细胞抗原表位的准确定位对疫苗设计、诊断试剂的研发及高通量抗体的制备均具有重要意义。作者对目前常用的B细胞线性表位预测方法和B细胞构象表位预测方法进行概述,并对不同预测方法进行比较,旨在为病原微生物抗原表位研究提供一定的理论参考。     

PRRSV-GP5基因的克隆及其蛋白结构和B细胞表位预测

应用RT-PCR扩增PRRSV-GP5目的基因,将纯化DNA与pMD18-T载体连接并转化入DH5α菌株,将阳性重组质粒进行测序和同源性对比。以此基因为材料,应用同源模型化的方法建立其3D结构和DNAStar软件预测其二级结构、亲水性、抗原指数、表面可及性及柔韧性,并综合分析了其B细胞抗原表位。结果表明,该基因高度保守,同时PRRSV-GP5蛋白呈现较规则的空间结构,其肽段32～36、51～53、140～142、146～151和196～197可能是其优势B细胞抗原表位区域,该结果将为PRRSV-GP5基因工程疫苗的研究和体外表达产物的应用提供理论依据。     

猪内源性反转录病毒囊膜蛋白基因的克隆及其蛋白二级结构和B细胞表位预测

猪内源性反转录病毒（PERV）是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对PERV-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现PERV-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于PERV疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及PERV对人源细胞的感染机制。     

马疱疹病毒1型gB糖蛋白线性B细胞表位的预测与鉴定

试验旨在应用生物信息学技术综合分析马疱疹病毒1型（equine herpesvirus 1,EHV-1） gB糖蛋白,预测B细胞表位,筛选出具有潜在诊断价值的线性B细胞表位。将EHV-1 gB糖蛋白的基因序列输入DNAStar软件中的Protean工作区中,经参数综合比较分析筛选潜在的B细胞表位,克隆、表达预测表位的基因片段,利用表达的融合蛋白作为抗原与马疱疹病毒阳性血清反应。经预测分析,gB糖蛋白的B细胞表位可能位于第6-10、23-32、53-65、72-98、111-120、152-166和173-180位氨基酸区域。本试验成功构建并原核表达含7个潜在B细胞表位的融合蛋白。Western blotting试验结果显示,其中5个融合蛋白能被马疱疹病毒阳性血清识别。本试验利用生物信息学技术结合分子生物学技术成功筛选到5个潜在的B细胞表位,为EHV-1表位诊断、表位疫苗抗原的设计奠定了技术基础。     

鸡传染性支气管炎病毒陕西分离株M蛋白基因的变异及其B细胞表位稳定性

以陕西8株鸡传染性支气管炎病毒（AIBV）分离株M蛋白的基因序列为基础，应用DNAStar软件中的MegAlign模块对其进行了同源性分析；用Kyte-Doolittle方法、Jameson—Wolf方法、Karplus—Schulz方法、Plot—Emini方法和Garnier-Robson方法综合预测了其中4株代表毒株的M蛋白B细胞抗原表位和二级结构。结果，8株AIBV的M蛋白主要在10～40aa和90～175aa处存在无规律的点突变，与参考毒株H52、M41、SAIB20、LX和Gray的M蛋白的核苷酸序列和预测的氨基酸序列的同源性分别介于87．4％～99．5％和96．3％～99．5％；分离株间的核苷酸序列和预测的氨基酸序列同源性分别介于91．8％～99．8％和95．4％～100％。4株代表株的M蛋白B细胞优势抗原表位都在159～164aa和181～193aa肽段区（这2个区域都包含了无规则卷曲和β-转角结构）或其附近。结果表明，AIBV分离株的M蛋白基因相对保守，只存在无规律的点突变，该变异对AIBVM蛋白B细胞表位的稳定性无影响。     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白B细胞抗原表位预测

以鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因组序列为基础,采用Garnier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Karplus-Schultz方法预测VP2蛋白质的二级结构;用Kyte-Doolittle方案预测蛋白质的亲水性;用Emini方案预测蛋白质的表面可能性;用Jameson-Wolf方案预测氨基酸的抗原性指数。综合分析,预测VP2蛋白的抗原表位。通过以上几种方法预测IBDV病毒VP2蛋白的B细胞表位位于VP2蛋白N端3-10、30-45、77-84、150-157、197-206、211-222、278-288、298-303、315-325、376-381、386-394、403-411、415-425区段。     

狂犬病病毒糖蛋白基因的克隆及其二级结构和B细胞抗原表位预测

对狂犬病病毒CVS株糖蛋白基因进行克隆与测序,推导出相应的氨基酸序列。然后采用Gam-ier-Robson法和Chou-Fasman法预测糖蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle法、Emini法和Jameson-Wolf法分别预测蛋白质的疏水性、表面可能性和抗原指数,并综合分析预测糖蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,该蛋白结构中含有少量的α螺旋、较多的β折叠以及较为丰富的转角区域,在序列的121~126、133~137、161~165、191~193、201~204、214~216、221~225、264~267区域或其附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。     

绵羊痘病毒ORFl21基因的序列分析及其B细胞表位预测

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株ORF121基因序列,采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测ORFl21蛋白B细胞表位.结果表明:4株不同绵羊痘毒株ORF121基因核苷酸序列的同源性为99%;在ORFl21蛋白的肽链中,35～46、76～82、160～167区段亲水性强,35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好,37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高,33～45、78～83和159～167区段表面可及性高,30～57和151～170区段可形成一定的空间构象.结果说明ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,ORF121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区.具有潜在的疫苗或/和诊断价值.     

绵羊痘病毒ORF121基因的序列分析及其B细胞表位预测

选取GenBank上4株不同绵羊痘毒株ORF121基因序列,采用DNASTAR软件对该基因序列进行同源性分析,并以B细胞表位分析参数及蛋白质二级结构分析数据,综合预测ORF121蛋白B细胞表位.结果表明:4株不同绵羊痘毒株OBF121基因核苷酸序列的同源性为99%;在ORF121蛋白的肽链中,35～46、76～82、160～167区段亲水性强,35～45、54～83、90～124、130～139、144～158和160～167区段柔韧性好,37～45、112～116、129～137和143～167区段抗原指数高,33～45、78～83和159～167区段表面可及性高,30～57和151～170区段可形成一定的空间构象.结果说明ORF121基因在不同的绵羊痘病毒流行株之间非常保守,ORF121蛋白35～45、160～167区段可能是B细胞表位优势区,具有潜在的疫苗或/和诊断价值.     

犬瘟热病毒N蛋白的B细胞抗原表位预测

将1段犬瘟热病毒N蛋白氨基酸序列(GenBank编号为:AEV77096.1)与Gen Bank登录的其他氨基酸序列进行比对,分析其同源性;通过DNAStar生物信息学分析软件中的Protean模块及The PredictProtein server在线蛋白分析工具预测犬瘟热病毒N蛋白的理化性质、二级结构、亲水性、表面可及性、柔韧性、抗原指数、跨膜螺旋、蛋白相互作用位点、蛋白功能位点等特性,并预测其B细胞优势抗原表位。结果显示,犬瘟热病毒N蛋白具有规则的二级结构、亲水性、柔韧性片段多,多处于表面可及性大,抗原指数高,蛋白质相互作用位点区域。潜在的B细胞优势抗原表位为12¹8、6118、61⁶6、24366、243²46、410246、410⁴15、421415、421⁴29、434429、434⁴47、452447、452⁴56、480456、480⁴87氨基酸序列。结果表明,本试验预测了犬瘟热病毒N蛋白的B细胞优势抗原表位,为进一步设计犬瘟热病毒的诊断抗原多肽、免疫用抗原多肽和研发血清学检测试剂盒奠定了理论基础。     

犬瘟热病毒N蛋白的B细胞抗原表位预测

将1段犬瘟热病毒N蛋白氨基酸序列（GenBank编号为：AEV77096．1）与GenBank登录的其他氨基酸序列进行比对,分析其同源性;通过DNAStar生物信息学分析软件中的Protean模块及The PredictProteinserver在线蛋白分析工具预测犬瘟热病毒N蛋白的理化性质、二级结构、亲水性、表面可及性、柔韧性、抗原指数、跨膜螺旋、蛋白相互作用位点、蛋白功能位点等特性,并预测其B细胞优势抗原表位。结果显示,犬瘟热病毒N蛋白具有规则的二级结构、亲水性、柔韧性片段多,多处于表面可及性大,抗原指数高,蛋白质相互作用位点区域。潜在的B细胞优势抗原表位为12～18、61～66、243～246、410～415、421～429、434～447、452～456、480～487氨基酸序列。结果表明,本试验预测了犬瘟热病毒N蛋白的B细胞优势抗原表位,为进一步设计犬瘟热病毒的诊断抗原多肽、免疫用抗原多肽和研发血清学检测试剂盒奠定了理论基础。     

马立克氏病毒pp38基因的克隆测序和B细胞抗原表位预测

对Ⅰ型马立克氏病毒的pp38基N进行了扩增、克隆及序列测定。采用DNAStar Protean软件对pp38蛋白的二级结构、亲水性和抗原性指数等参数进行分析，并预测其B细胞表位分布。结果表明，pp38基N长873bp，包含完整的开放阅读框架，编码290个氨基酸。蛋白的B细胞表位可能位于第1～11，18～162，180-217和274-290位等氨基酸区域内或附近。本试验为pp38蛋白的表达和抗体制备奠定了理论基础。     

猪水肿病大肠杆菌FedF的B细胞抗原表位预测

目的是预测致猪水肿病主要毒力因子FedF的B细胞抗原表位。方法为基于FedF的蛋白基因组序列,采用Oarnicr-Robson法、Chou-Fasman法和Karplus-Schulz法预测其结构蛋白的二级结构柔性区域,Kyte-Doolittle方案预测其蛋白的亲水性,Emini方案预测其蛋白结构的表面可能性,Jameson-Wolf方案预测其蛋白结构的抗原指数,同时使用BepiPrcd在线分析预测其可能的B细胞抗原表位,综合以上方法最终预测FedF可能的B细胞表位。结果显示,经过分析推测FedF最有可能的B细胞表位位于FedF蛋白N端第51．57、115．122,148．153、199．206、225：232、254．259区段内。     

细胞的抗原表位研究方法

多表位疫苗有望成为预防多种病原体感染的理想疫苗,因而被认为是将来疫苗的发展方向。抗原表位是研究抗原的免疫机制和表位疫苗的基础,近年来在表位研究方面取得了一些可喜的进展,特别是抗原表位的研究方法。B细胞表位的研究方法已经不局限于通过交叠合成多肽进行研究,又诞生了噬菌体随机肽库以及表位预测等方法;在T细胞抗原表位的研究方面也有了相应的预测方法,尤其是将ELISPOT试验、体外抗原提呈试验等应用于T细胞表位活性的鉴定,极大的促进了T细胞表位的研究进展。文章全面系统地对B细胞表位与T细胞表位的研究方法的进展进行了综述。旨在为表位和表位疫苗的研究提供先进的多种技术方法。     

微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础．     

猪链球菌2型溶血素B细胞表位预测

目的预测猪链球菌2型(SS2)溶血素(SLY)B细胞表位。方法以DNAstar分析为主,综合分析二级结构、亲水性、表面可及性及抗原性指数,辅以吴玉章氨基酸抗原指数计算方法进行SS2溶血素B细胞表位预测。结果推测最有可能的B细胞表位位于溶血素N端第74～85、231～244区域位。结论应用多参数预测SS2溶血素的特征,为表位疫苗的研制奠定了基础。     

猪水肿病大肠杆菌SLT-IIeB蛋白的B细胞抗原表位预测

基于SLT—IIeB的蛋白基因组序列,采用Garnier-Robson法、Chou—Fasman法和Karplus—Schulz法预测其结构蛋白的二级结构柔性区域．利用Kyte—Doolittle方案预测其蛋白的亲水性,Emini方案预测其蛋白结构的表面可能性,Jameson—Wolf方案预测其蛋白结构的抗原指数,同时使用BepiPred在线分析预测其可能的B细胞抗原表位．综合以上方法最终预测SLT—IIeB可能的B细胞抗原表位。经过分析推测,SLT—IIeB最有可能的B细胞抗原表位位于N端第31—36区段内。