猪繁殖与呼吸综合征病毒流行株Nsp2基因的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法,从吉林省部分地区猪场的病料中扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的Nsp2基因并测序.应用DNAStar 7.0、ClustaⅨ 1.83、MEGA 4.0软件对测序结果进行分析,并与NCBI上已登录的PRRSV代表毒株的Nsp2基因进行序列比对,结果显示,得到的Nsp2基因与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为62.0%～87.5%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为97.8%～98.9%;氨基酸序列比对结果显示与VR-2332、CH-1a等代表毒株的一致性为34.4%～59.0%,与国内高致病性PRRSV毒株JXA1、HUB2等的一致性为95.1%～98.4%.因此,引起吉林省部分地区猪场发生猪繁殖与呼吸综合征的PRRSV与国内流行的高致病性PRRSV毒株亲缘关系较近.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州PT分离株Nsp2基因克隆及序列变异分析

为了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州PT分离株Nsp2基因序列特征,选择PRRSV JXA1株Nsp2基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV贵州PT分离株Nsp2基因片段,克隆至pMD18-T载体并测序,应用DNAStar、PSORTⅡ、TMHMM、MLRC等软件对Nsp2序列的理化参数、同源性、亲水性、表面可及性、抗原性和亚细胞定位等进行分析和预测。结果显示,该基因cDNA长588 bp,蛋白理论分子质量为21.5674 ku,理论pI值为5.02,为不稳定蛋白,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明该蛋白极有可能位于细胞核,其Nsp2基因与所选18个毒株相应片段的同源性为80.0%~99.8%。预测Nsp2蛋白具有良好的抗原性,在PRRSV的流行过程中,Nsp2基因不断发生遗传变异,产生新的变异序列。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株的鉴定及部分Nsp2基因序列分析

本研究采集山西省不同地区的发病猪脏器组织与血液样品,采用特异性 RT-PCR方法检测高致病性猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)样品16份,应用设计的特异性引物扩增出Nsp2基因序列,利用DNAStar生物信息学分析软件,对获得的序列与国外代表毒株VR-2332、国内代表毒株CH-1a、BJ-4、HB-1及PRRSV变异毒株HuN4和JXA1的序列进行了比较,绘制系统发生树。氨基酸序列比较分析发现山西省流行毒株同源性分别在69.8%~71.7%、85.3%~87.9%、68.7%~70.6%、91.7%~94.3%、94.3%~98.5%、95.1%~98.9%。所获得的16株病毒之间的同源性在90.9%~100%之间。研究结果发现所获得的序列同源性与国内近几年流行的PRRSV的变异毒株HuN4和JXA1毒株的序列同源性最高,分别在94.3%~98.5%与95.1%~98.9%之间,Nsp2 基因缺失位置一致,其Nsp2均有2个部位出现了缺失,即Nsp2基因分别为编码1个氨基酸的3个核苷酸的缺失和编码29个氨基酸的连续87个核苷酸的缺失,结果表明,山西省目前流行PRRSV的变异毒株与国内流行株属于同一分支。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GD07b株的分离鉴定及Nsp2基因同源性分析

在某集约化猪场采集疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病死猪的肺、淋巴结等病料,进行检测,将RT-PCR检测结果为阳性的病料处理后接种Marc-145细胞,培养72~96 h后细胞单层出现明显的CPE。收获病毒经RT-PCR方法检测,并将此PCR产物经纯化后连同引物送相关公司进行测序,结果显示,该病毒为繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因缺失株,将该病毒命名为HPPRRSV-GD07b株。将GD07b株序列与国内外19株PRRSVNsp2基因进行比较分析,结果表明,该毒株Nsp2基因与CH-1a株等4株PRRSV经典株同源性较低,为60.5%~81.6%;而与14株变异株同源性较高,为90.6%~98.9%。     

云南高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因变异分析

采用RT-PCR技术对云南2007年采集的48份猪组织样品中病毒Nsp2基因进行检测,获得阳性样品14份,选择5份代表性样品将其PCR产物纯化后,克隆至pMD18-T载体测序,并与已知代表性毒株进行比较及系统发育分析。结果发现云南病毒样品Nsp2基因核苷酸及氨基酸序列同源性分别为95．8％～99．0％和92．3％～98．6％。5份样品病毒Nsp2蛋白482位、534位～562位氨基酸均存在缺失,其中1份样品（YNMG）486位～489位氨基酸也发生了缺失。云南病毒样品在系统发育树上可划分为4个亚组群,分别与广东、广西、贵州、浙江、江苏、山东毒株遗传关系密切。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒江苏分离株ORF5及Nsp2基因部分序列分析

对2006—2007年分离于江苏省部分发病猪场的PRRSV,采用RT-PCR技术,进行ORF5基因序列以及Nsp2基因部分序列的扩增、克隆并测序。应用DNAStar软件将测序结果与已发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果表明,分离的21株病毒ORF5基因大小均为603bp;与国内分离株之间同源性为87.7%～97.0%,与国外美洲型分离株同源性为85.6%～90.5%;21株PRRSV分离株与欧洲型毒株之间的同源性仅为54.1%～56.6%。14株用于扩增Nsp2基因部分序列的PRRSV在全基因组第2778～2780位及第2947～3033位分别缺3个和87个碱基,其中的2个江苏扬州分离株在第2747～2836位又缺失了90个碱基;14个毒株之间同源性为93.2%～99.0%,与VR-2332相比同源性为74.9%～78.5%,与国内河北、河南等地2006年的PRRSV分离株相比同源性为94.1%～99.1%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒 Nsp10基因的克隆及序列分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒 BJ-4序列,选择Nsp10基因保守区域设计并合成特异性引物,用RT-PCR方法扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州地方株(命名为JL株)Nsp10基因片段,克隆到pMD18-T载体并测序,应用DNASTAR、Clustal_1.81和Mega序列分析软件进行同源性比较.结果表明:贵州JL株Nsp10基因的cDNA长699 bp,可编码233 个氨基酸;贵州JL株Nsp10基因与早期分离毒株MLV株、BJ-4株、VR-2332株、CH-1a株、CH2002株和GS2004株相应序列的核苷酸同源性为 91.7%～94.0%,氨基酸同源性为97.4%～98.7%;而与最近分离毒株HN2007株、SX2007株、GD2007株、YN2008株、GS2008株、XL2008株、TJ株和JXA1株的核苷酸同源性为 98.3%～98.6%,氨基酸同源性为 99.6%～100%.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒FS株Nsp9基因的克隆与序列分析

为了对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）Nsp9基因的功能进行预测,利用RT-PCR法从细胞毒中扩增PRRSV FS株的Nsp9基因,并将其克隆至pMD18-T载体上,测序得到Nsp9基因序列,利用多种生物信息学软件分析Nsp9序列生物学信息。结果显示,Nsp9基因全长1 929 bp,目的基因的蛋白分子质量为70.5 ku,pI为7.78,表明该蛋白不稳定;抗原性分析显示,Nsp9基因存在多个抗原位点,柔韧性较好,多处位点的亲水性较强,适合作为单抗制备的表位;同种亚型不同毒株的Nsp9基因氨基酸同源性为96.9%～98.9%,这表明Nsp9基因高度保守,可进一步作为检测靶蛋白用于猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的诊断与疫苗免疫;亚细胞定位预测该基因可能定位于细胞质中,而不是细胞核内;同源建模预测三级结构结果显示,三维结构呈右手型,具有3个亚结构域,没有信号肽。此外,亲本株Nsp9基因与疫苗株Nsp9基因存在多个氨基酸的突变,这些氨基酸的插入与缺失是否与病毒的聚合酶活性和毒力有关还需要进一步试验验证。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒特殊变异株LD812的分离与序列分析

从2008年送检的病猪病料中分离到1株致细胞病变代次、时间以及细胞病变形态与典型高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)培养特性不同的PRRSV(LD812株)。对LD812株的Nsp2和ORF5基因进行测序发现,该株病毒与标准HP-PRRSVJXA1株(与VR2332相比,JXA1Nsp2基因的第478、538～566位氨基酸缺失,缺失形式为1+29个氨基酸)的Nsp2基因同源性为98.3%,LD812分离株Nsp2基因上第475～520和538～566位氨基酸缺失,缺失形式为46+29个氨基酸,比JXA1株在1号缺失位多缺失45个氨基酸;LD812株ORF5基因序列与JXA1株相比仅有8个核苷酸的点突变。结合该毒株的临床特征、细胞培养及分子特性,推测LD812为一弱毒株。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒Nsp2基因缺失株Jiangxi-3灭活疫苗免疫效果评价

将猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因缺失株Jiangxi-3的第9代病毒(Jiangxi-3F9)按常规方法制成油佐剂灭活疫苗,经肌肉注射免疫PRRSV和猪圆环病毒(PCV2)抗原与抗体均为阴性的60日龄健康猪,免疫组分别于初次免疫第21和28天、二次免疫第28天(即初次免疫第28天加强免疫1次)用200LD50的Jiangxi-3 F9进行攻毒,同时各组均设立对照组。通过试验动物体温变化、临床症状、血清PRRS抗体和抗原定期检测结果评价灭活疫苗的免疫效果。结果表明,初次免疫第21和28天免疫组攻毒后体温仍然明显升高,而二次免疫第28天免疫组攻毒后体温升高不明显,最高体温约40℃。初次免疫21-28 d免疫组特异性抗体水平持续升高,初次免疫第21天与第28天抗体水平差异显著(0.01P0.05);二次免疫后免疫组抗体水平仍持续升高,第28天可达3.105±0.125,二次免疫第28天与初次免疫28天抗体水平差异显著(0.01P0.05)。初次免疫第21天和第28天免疫组攻毒后仍能在血清中检出PRRSV抗原,仍表现不同程度的临床症状,而二免第28天的免疫组攻毒后其PRRSV抗原检出率、发病率、死亡率均为0。表明初次免疫第28天加强免疫一次比免疫一次效果好。     

高致病性PRRSV SC-JX01株Nsp2基因的序列分析和抗原表位预测

将扩增SC-JX01株得到的Nsp2基因cDNA片段克隆于pMD-T载体中。提取pMD-Nsp2质粒,测序后利用DNAStar软件进行序列分析。结果表明,SC-JX01株Nsp2基因与GenBank已发表的高致病性PRRSV Nsp2基因序列的相似性为98.1%~99.1%,氨基酸的相似性为95.9%~98.0%,具有相同的30个氨基酸缺失。本研究表明,SC-JX01株Nsp2基因与分离自不同地区高热病毒株的Nsp2基因序列具有相同的缺失。由于SC-JX01株的Nsp2基因存在氨基酸的缺失,与VR2332株比较,其亲水性、抗原指数均发生了大的变化。     

福建省谱系3 PRRSV的分离及其ORF5基因序列分析

对福建省新流行谱系3的PRRSV进行分离,并对其分子生物学特性进行初步研究,为新流行毒株的防治提供依据和参考。分离的毒株通过RT-PCR和IFA对PRRSV分离毒株进行鉴定,并对其ORF5基因进行序列测定分析。结果显示,分离株能够在Marc-145细胞上增殖并产生典型的细胞病变,被抗PRRSV的特异性单克隆抗体所识别,具有特异性免疫荧光,其TCID_(50)为10~(5.3),将其命名为FJFQ1805。分离株ORF5基因与北美型PRRSV参考株核苷酸同源性为83.9%～92.2%,与谱系3病毒株QYYZ的同源性最高,为92.2%。系统进化树分析表明,该分离株属于北美型,与QYYZ、GM2和FJFS等谱系3的病毒株属于同一分支。综上,所分离的FJFQ1805毒株为谱系3的病毒株。     

鸡传染性囊病病毒青岛分离株VP2基因的克隆及序列分析

为了克隆传染性囊病病毒青岛分离株(IBDV-QD)的VP2 基因及对其高变区序列进行分析,首先根据GenBank上已经发表的传染性囊病病毒(IBDV)UK661株的核苷酸序列,设计并合成了一对特异性的扩增IBDV-QD VP2 基因的引物.以IBDV-QD株基因组为模版,利用RT-PCR技术扩增出长约1.5 kb的基因片段,将其连接到pGEM-T-Easy载体上.经酶切分析、PCR鉴定及核苷酸序列测定,成功获得该分离株VP2基因的重组质粒.将IBDV-QD株VP2基因的高变区核苷酸序列及推导出的氨基酸序列与GenBank中公布的14株IBDV相应序列应用软件进行同源性比较,并构建系统进化树.同源性比较和进化树分析表明,IBDV-QD与IBDV超强毒株(vvIBDV)关系最近,与标准强毒株、弱毒株、变异株相差较远;并且我国不同地区的vvIBDV存在差异,这为我国传染性囊病的流行病学调查奠定了基础.     

一株Nsp2蛋白自然缺失123个氨基酸的PRRSV分离和鉴定

通过RT-PCR方法检测到一份猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性肺组织病料。将该病料研磨、过滤后感染Marc-145细胞,连续传代都能产生明显的细胞病变。为鉴定细胞病变是否由PRRSV引起,抽提细胞总RNA,通过RT-PCR的方法成功的检测到了PRRSV基因。同时用间接免疫荧光方法证实了感染的细胞内有PRRSV N蛋白的表达。将成功分离的毒株命名为GXYL1403株。对分离株的ORF5基因和Nsp2高变区进行扩增、克隆和遗传进化分析,结果发现该毒株Nsp2高变区与NCBI登录的参考序列VR-2332氨基酸同源性为68.6%,JXA1的同源性为90.8%。通过ORF5遗传进化分析该分毒株为北美型PRRSV,且与高致病性PRRSV分布在同一个小分支上。Nsp2序列对比显示该分离株Nsp2蛋白含有高致病性PRRSV特异的1+29个氨基酸的缺失。特别的是,在缺失29个氨基酸区域的上游,含有连续20个氨基酸缺失,在下游更出现了连续73个氨基酸的缺失。该PRRSV毒株的分离和Nsp2蛋白部分序列的缺失鉴定,为下一步研究Nsp2部分氨基酸缺失对病毒生物学特性影响奠定了基础。     

我国苏皖地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了分析2009年安徽省和江苏省周边地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的遗传变异特征,采用RT—PCR方法对该地区分离的22株PRRSV的Nsp2和ORF5基因进行了扩增、克隆和测序,并进行序列分析。结果表明：22株PRRSV均属于美洲型毒株,其中21个毒株的Nsp2存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征;而且此21个毒株的ORF5基因推导的氨基酸序列也发生多处突变,集中出现在毒力相关位点、抗原表位和糖基化位点序列中。只有HZNJ株与疫苗株的同源性较高。进化树分析显示,21个分离株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,而HZNJ株与疫苗毒株有较近的亲缘关系,进一步说明高致病性PRRSV已成为该地区的优势流行毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒JX0708株的分离鉴定及其Nsp2 基因的遗传变异分析

采集江西省某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料,RT-PCR检测可扩增出PRRSV ORF7特异性片段,序列分析发现其与美洲型毒株序列一致性达93.9%以上,与欧洲型毒株仅为69.8%。将采集的脑和肺脏处理后接种Marc-145细胞盲传,在盲传的细胞中可扩增到PRRSV ORF7特异性片段,传至第6代时出现明显的细胞病变;将该毒株NSP2非结构蛋白基〖JP2〗因测序分析,发现其编码的氨基酸与国内近年来分离的高致病性PRRSV毒株有较高的同源性,与美洲型代表株VR-2332相比缺失第482位和533-561位共30个氨基酸;纯化病毒并进行电镜观察,可见典型的PRRSV病毒粒子。第8代的细胞毒回归30日龄仔猪,可观察到猪繁殖与呼吸综合征典型症状和病理变化。这表明已成功地分离到1株美洲型PRRSV变异株,命名为JX0708株。