家蚕Bmtdh基因的克隆与序列分析

克隆了家蚕苏氨酸脱氢酶基因(Bmtdh),其cDNA长1 310 bp(No.ABA43639.1),包括227 bp 5′-UTR和1 026 bp的完整开放读码框(ORF)。Bmtdh在家蚕基因组上以单拷贝形式存在,编码342个氨基酸,其Ile29-Val322区域是一个完整的表面异构酶功能域。表达谱分析与EST数据的分析表明,Bmtdh在丝腺和卵巢中的转录水平高于其它组织,并且Bmtdh在家蚕4龄眠期、5龄早期的转录水平也很高,而在卵期(G2胚胎)和1龄早期没有检测到其转录表达,表明Bmtdh基因可能参与了蚕丝蛋白的合成过程。     

家蚕丝素基因表达水平的定量分析

采用实时定量RT-PCR方法,对丝素轻链基因(fib-L)、丝素重链基因(fib-H)、P25基因在家蚕幼虫不同组织和不同发育时期的表达进行了定量分析。结果发现3种丝素基因除主要在5龄幼虫的后部丝腺中表达外,在其它组织如脂肪体和中部丝腺中也有一定程度的表达;在4龄眠期的后部丝腺中3种丝素基因也有一定的表达水平,其中fib-L在这一时期的表达量较高。同时发现在5龄第3天和第5天的后部丝腺中,fib-H、fib-L与P25在mR-NA水平上的摩尔比分别为9∶18∶1和19∶32∶1,推测丝素基因的表达可能具有转录后调控,此结果说明家蚕丝素基因的表达可能具有更加精细的调控机制。     

家蚕后部丝腺细胞数与茧质性状关系的研究

采用OLYMPUS位相差显微镜(10×20)观察计数家蚕后部丝腺细胞数,结果得知:家蚕后部丝腺一侧细胞数在180—260个之间,标准差大多在5—25个之间;不同品种后部丝腺细胞数存在极明显差异;同一品种雌雄间差异不显著,其细胞数的分布属正态分布;同一头家蚕的两条后部丝腺的细胞数,少数个体存在一定的开差。后部丝腺细胞数与茧质性状的线性回归及离回归方差均达到极显著水平;后部丝腺细胞数杂种优势率与茧质件状杂种优势率大多没有显著的相关关系;说明后部丝腺细胞的多少是丝素蛋白产量高低的一个条件,而每个细胞合成、分泌丝素蛋白的能力强弱是产量高低的另一条件。     

家蚕4眠期与5龄期后部丝腺细胞蛋白质组成分析

为探讨家蚕丝腺细胞合成分泌蛋白质过程中有关基因的表达调控机理,采用蛋白质双向电泳和图像分析技术,研究了家蚕4眠期和5龄期后部丝腺细胞的蛋白质组成。在4眠家蚕的后部丝腺细胞中检测到425个蛋白斑点,5龄期随着生长发育的进程,可检测到新的特异蛋白斑点,说明不同的发育时期,后部丝腺细胞的蛋白组成是不一致的。5龄前、中期新增加的特异蛋白斑点可能与丝素蛋白的合成、分泌有关,而5龄后期新增加的特异蛋白斑点可能与丝腺组织的形态变化、细胞的分解凋亡有关。     

家蚕五龄后部丝腺蛋白质构成与茧层量的关系

家蚕 5龄期是后部丝腺细胞大量合成并分泌蚕丝主要成分丝素蛋白的时期 ,对这一时期后部丝腺细胞的蛋白质构成进行研究 ,有利于发现丝腺细胞分泌丝素蛋白有关的功能蛋白质 ,阐明蚕茧高产的机理。采用蛋白质双向电泳和图像分析技术 ,研究发现家蚕同一品种的不同个体 ,或同一个体不同部位的后部丝腺细胞蛋白质的构成基本一致。该结果反映了家蚕同一品种不同个体后部丝腺细胞的新陈代谢水平基本没有差异 ,家蚕品种个体间茧层量差异 ,可能是个体生长发育和后部丝腺细胞数的不同等原因造成 ,而与每一个体后部丝腺细胞的新陈代谢关系不显著。该结果也说明在目前双向电泳技术和染色技术的条件下进行家蚕后部丝腺蛋白质组研究时 ,从家蚕同一品种的任一个体、任一部位提取后部丝腺细胞的蛋白质样品 ,所得的蛋白质双向电泳结果基本相同     

家蚕丝腺因子SGF-1的基因克隆及序列结构和表达特征与亚细胞定位

Fox类转录因子在细胞生长、增殖、分化和胚胎发育等过程中发挥重要功能,SGF-1是家蚕丝腺细胞转录因子,属于Fox类转录因子家族。家蚕SGF-1(BGIBMGA005101-TA)基因位于第25号染色体nscaf2823:112743~113792(+strand),含有1个外显子,CDS全长1 050 bp,编码349个氨基酸。家蚕品种大造5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,SGF-1基因在大多数组织中有表达,在丝腺中高量表达,其中在前部和中部丝腺的表达量略高于后部丝腺,在雄蚕中的表达量略高于雌蚕。氨基酸组成分析显示,SGF-1蛋白富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸,且多数为亲水性氨基酸。序列结构分析表明,SGF-1包含典型的Forkhead结构域,其两端分别为Forkhead_N末端结构域和HNF3_C末端结构域,其中大多数氨基酸残基形成了无规则卷曲结构,α-螺旋与β-折叠结构分别约占18.0%和0.6%。从家蚕后部丝腺克隆了SGF-1基因,并构建麦芽糖结合蛋白标签融合表达载体,表达并纯化了重组SGF-1蛋白。通过RT-PCR与Western blotting检测分别从基因转录水平和蛋白质表达水平上证实,SGF-1在家蚕5龄第3天幼虫丝腺中高量表达。亚细胞定位实验显示SGF-1定位于细胞核中。这些结果为深入研究SGF-1的结构和功能提供了有益的基础信息。     

家蚕5龄幼虫后部丝腺细胞酶基因表达的比较分析

基于了解家蚕后部丝腺细胞分泌丝素蛋白基因的表达调控信息,阐明蚕茧高产的机理,根据EST分析结果,分析了家蚕5龄幼虫不同发育时期后部丝腺细胞中酶基因的表达谱特征。发现家蚕5龄幼虫第1天和第5天的生理生化反应涉及氧化还原酶的数量最多,达到30个,转移酶数量达28个,水解酶数量达22个,合成酶数量达12个,裂合酶数量达6个,异构酶数量最少,只有4个。这6种酶基因在家蚕5龄第1天和第5天之间表达差异不大,表达频率超过10次的酶只有细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ、S腺苷甲硫氨酸合成酶和肽基脯氨酸顺反异构酶。上述结果暗示家蚕5龄不同时期,丝素蛋白合成能力的差异与酶分子的数量关系不密切。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16的表达规律及体外重组表达

家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。     

吲哚丁酸和赤霉素对家蚕后部丝腺谷氨酸—丙酮酸转氨酶活力的影响

就植物激素吲哚丁酸（IBA）和赤霉素（GA_3）对家蚕（Bombyx mori）后部丝腺谷丙转氨酶（GPT）活力和产丝量的影响作了调查和探讨。试验结果表明,在4龄第3日或5龄第1日添食IBA或GA_3,都能提高家蚕5龄期后部丝腺GPT的活力,产丝量也有较大幅度的增加,其中,以3×10~（-5）ppmIBA在4龄3日处理或3×10~（-4）ppmGA_3在5龄1日处理效果最佳,其茧层量分别比对照区提高22％和10％。另外,就这两种植物激素对多丝量品种或少丝量品种的影响差异作了讨论。     

不同产丝量家蚕品系后部丝腺的蛋白质组学分析

家蚕幼虫后部丝腺是合成和分泌丝素蛋白的重要器官。为从蛋白质水平探究不同家蚕品系产丝量差异的原因,应用蛋白质组学研究方法,选取3个产丝量有较大差异的家蚕品系Ndx、大造和21-872为材料,通过双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对各品系5龄第5天幼虫后部丝腺表达的差异蛋白进行鉴定,查找与丝蛋白合成相关的蛋白质。结果表明,茧丝突变品系Ndx后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系大造和高丝量品系21-872有差异,差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,其中核糖体磷酸化蛋白P0和P2、蛋白质二硫化物异构酶、丝素轻链蛋白Fib-L以及丝素蛋白P25等在Ndx后部丝腺的含量明显低于其它2个品系。推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。     

家蚕cDNA文库构建及大规模EST测序

EST(expressedsequencetag,表达序列标签 )测序分析技术广泛应用于基因功能和表达模式的分析研究。以家蚕品种“大造”为材料 ,采用非均一化的Oligo dT引物定向克隆技术构建了 13个组织的cDNA文库 ,进行了cDNA克隆 5′端测序 ,共获得 84 791万条EST序列 ,初步拼接得到 2 76 93个非重复序列 ,其中包括 10 4 33个Contigs,172 6 0个Singletons。家蚕大规模EST测序将为家蚕功能基因组研究和全基因组测序计划的实施奠定基础     

家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。     

植物杀虫剂印楝素对家蚕的毒性测定及解毒方法

测定了植物杀虫剂印楝素(azadirachtin)对家蚕的食下、熏蒸、内吸毒性及安全间隔时间:印楝素对3龄起蚕的致死中浓度(LC50)为202.67×10-6mg/L,致死中量(LD50)为12.56×10-10mg/头,家蚕对印楝素极敏感,但中毒后至死亡的时间较长,一般需3~5d;印楝素在田间常规使用浓度下对家蚕基本无熏蒸毒性;0.5%印楝素乳油2000倍稀释液根灌、喷叶处理,通过桑根或桑叶内吸并在树体内传导的作用极小,即未喷洒到药液的桑叶对家蚕相对安全;印楝素对家蚕的安全间隔时间很长,饲喂0.5%印楝素乳油800、1200、1800和2700倍稀释液处理后的桑叶,间隔30d对3龄蚕的死亡率均在50%以上。蚕用消毒剂消力威(三氯异氰尿酸、碳酸氢钠粉)1000倍和500倍溶液浸渍受印楝素污染的桑叶30min有良好的解毒作用。     

家蚕转录因子AP-4基因cDNA的分子克隆与生物信息学分析

AP-4(activator protein 4)是一种转录因子,在生物的生长发育中有重要作用。根据家蚕表达序列标签(EST)并利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法克隆了家蚕AP-4(Bombyx mori activator protein4)基因,结合生物信息学方法对所获的序列进行开放阅读框、序列同源性分析,预测了AP-4蛋白的理化性质。获得的家蚕AP-4基因cDNA的全长为1621bp,其开放阅读框为996bp,编码331个氨基酸,基因由3个外显子和2个内含子组成。同源性比对表明该基因推导的氨基酸序列与棉铃虫AP-4和谷蛀虫AP-4推测的蛋白同源性分别为76%和54%,第45-99位氨基酸序列是一个典型的保守结构域。实时定量RT-PCR显示该基因在所检测家蚕的各发育时期中,除幼虫1龄和蛹期第4天无表达外,其它时期均有表达,其中幼虫3龄和4龄期的表达量较高。     

家蚕精巢特异性蛋白激酶基因Bm-TSSK的克隆及序列与表达分析

睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(testis-specific serine/threonine kinase,TSSK)首先在哺乳动物中被发现,是一类在精子发生过程起重要作用的蛋白激酶。通过EST同源筛选方法,用人(Homo sapiens)的TSSK2、TSSK4、TSSK6基因cDNA和小鼠(Mus musculus)的TSSK1、TSSK3、TSSK5基因cDNA为探针在GenBank家蚕EST数据库中搜索同源基因,通过在家蚕基因组数据库的同源性检索以及电子克隆,获得一条家蚕精巢特异性蛋白激酶基因的序列,命名为Bm-TSSK(GenBank登录号:JN159476)。据此预测序列设计引物,成功地在家蚕精巢组织中克隆了Bm-TSSK基因完整的开放阅读框(ORF),序列分析及同源性比对表明:Bm-TSSK序列长1 402 bp,ORF为1 041 bp,没有内含子,推测编码346个氨基酸残基,在编码氨基酸序列20～284区域有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域;该基因推导的氨基酸序列在进化上与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、熊蜂(Bombus terrestris)、顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)的亲缘关系较近,相似度分别为81%、86%和85%。基于定量PCR和基因芯片的数据分析显示Bm-TSSK在家蚕5龄第3天幼虫的精巢特异性高表达,推测Bm-TSSK参与了家蚕精子的形成。     

家蚕幼虫性腺表达序列标签分析(英文)

分别以5龄幼虫的精巢和卵巢构建了2个家蚕cDNA文库.利用表达序列标签方法分析参与家蚕性腺发育的基因,通过测序获得 16 737条ESTs(精巢 8 407条,卵巢 8 330条),拼接这些ESTs共得到 2 107个重叠群(contig)和 3 532个单拷贝(singlet).将这些转录物与GenBank非冗余蛋白质库比较,结果显示约34.3%的基因与数据库中蛋白质具有相似性.功能注释表明蛋白质合成相关基因、精巢特异基因等在文库中大量存在.基因本体(gene ontology)功能分类显示精巢与卵巢基因表达谱差异较大.研究结果为理解家蚕性腺发育提供了信息.     

催青温度对家蚕二化性品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构特征

家蚕二化性品种的卵滞育与否受上代环境影响,25℃高温明催青将产滞育卵,而15℃低温暗催青将产非滞育卵。为探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,对从家蚕卵巢细胞中克隆的家蚕滞育激素受体基因(Bmdhr)的5种cDNA进行生物信息学分析,结果表明Bmdhr基因的5种cDNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mR-NA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,Bmdhr mRNA-4编码的氨基酸序列与家蚕滞育激素BmDHR-1的序列相似度达99.2%。将家蚕二化性品种秋丰的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR分析催青温度对家蚕不同发育时期及蚕体组织中Bmdhr基因mRNA转录的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青的转录水平高于低温催青;Bm-dhr mRNA-4主要在各发育时期的蚕体血液中表达,特别是在高温明催青条件下,其在蛹期血液中的转录水平是低温暗催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种卵滞育与否的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2～3 d的卵巢中转录水平高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平开始下降,至化蛹后4～5 d 2种催青处理间的转录水平无显著差异。研究结果为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。     

犬弓首蛔虫雄虫cDNA文库构建及EST分析

为构建T.canis雄虫cDNA文库,采用Trizol法提取T.canis雄虫的总RNA,合成cDNA,连接到λTripEx2载体上,通过包装蛋白对连接产物的包装,接种到大肠杆菌XL-1-Blue中进行原始文库和扩增文库的滴度测定.经质量鉴定表明:初始文库的滴度为5.25×106 pfu·mL-1,扩增后文库的滴度为6.90×109 pfu ·mL-1.文库的插入片段大小在500～2 000 bp,平均片段大小为1 000 bp,重组率为99.47％.所有指标均显示已成功构建了T.canis雄虫的cDNA文库.利用该文库获得了189条5'有效表达序列标签(EST).对ESTs拼接后代表了101个Unigenes,含有27个Contigs和74个Singletons.其Unigenes在GenBank中的序列号为HO348195～HO348295.同源性分析检索到有56个Unigenes与已知基因同源,其中具有已知或推测功能的基因有40个,未知功能基因有16个,未比对上的基因45个.未比对上的基因与NR数据库中的蛋白序列没有任何意义的匹配,为研究中发现的新基因.这些结果为进一步开展犬弓首蛔虫功能基因及分子机制研究奠定了基础.     

塑料薄膜覆盖育壮蚕的生理生化研究

研究了打孔塑料薄膜覆盖育壮蚕 (4～ 5龄 )的部分生理生化变化。发现壮蚕每日用打孔塑料薄膜覆盖2 0h ,并将给桑次数减少为 1日 2回 ,其蚕座内CO2 浓度显著高于不覆盖对照区 ,但仍大大低于能引起蚕产生不良反应的水平。同时 ,超氧化物歧化和过氧化氢酶的活性均未发生明显的不良变化。此结果为生产上用打孔塑料薄膜覆盖省力化饲育壮蚕提供了科学依据     

家蚕一种富含半胱氨酸蛋白基因BmCRP的原核表达与定位研究

从家蚕蛹cDNA文库中获得一条cDNA序列,经生物信息学分析显示该cDNA序列全长1 011 bp,包括5′-UTR 200 bp和3-′UTR 136 bp,编码224个氨基酸,其编码蛋白质的N-端富含半胱氨酸,将该基因命名为BmCRP(基因登录号:DN985186.1)。该基因编码蛋白主要有α螺旋、β-折叠、无规则卷曲3种二级结构,具有cAMP和cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点等5种功能位点。构建重组表达载体pET-28 a(+)-BmCRP并转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后获得融合蛋白,用纯化后的目的蛋白免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体与BmCRP有较好的特异性。W estern b lotting检测结果:BmCRP蛋白在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,蛹期表达量最高;在5龄幼虫的表皮、头部、卵巢、睾丸、马氏管中均有表达。荧光定量RT-PCR检测结果:BmCRPmRNA在家蚕卵、幼虫、蛹、蛾的整个生命周期中,其转录水平呈增加趋势;在5龄幼虫不同组织中的转录水平从高到低依次为表皮、头部、生殖腺、中肠、马氏管、气管、丝腺和脂肪体。细胞定位实验结果显示BmCRP蛋白在Bm5细胞的细胞核和细胞质中均存在,细胞核中的荧光信号比细胞质中的信号强。研究结果有助于进一步探明家蚕BmCRP蛋白的结构和功能。