卤虫胚胎和无节幼体超低温冷冻保存的研究↑（*）

用玻璃化液作为低温保护剂,对卤虫胚胎和无节幼体进行超低温冷冻保存实验。通过实验筛选出５种适宜卤虫胚胎保存的玻璃化液,找出了影响胚胎成活的降温温层和升温温层,使胚胎经－１９６℃保存后的成活率稳定在９０％。建立了较为完善的卤虫胚胎冷冻保存的程序。卤虫无节幼体经超低温冷冻保存后,获得３－５％的成活率。     

泥鳅胚胎玻璃化液超低温冷冻保存研究

泥鳅胚胎（胚孔封闭期）用10＃玻璃化液作为低温保护剂,经低温（－196℃）冷冻保存17h后,38℃水浴解冻,解冻后的胚胎获得了成活。在稀释液B1、B2、B3中分别有26．7％,15．0％,3．0％成活的胚胎。解冻后的胚孔封闭期胚胎经过50h的培养,胚胎从胚孔封闭期发育至尾鳍出现期。     

哺乳动物 胚胎冷冻研究进展

哺乳动物胚胎冷冻研究始于50年代。该方法的研究进展速度很快。部分家畜的冷冻胚胎已走向商品化阶段。本文着重阐述了胚胎冷冻的方法及其研究进展。     

海藻糖对施氏鲟精子冷冻保存效果的影响及其冷冻损伤机理的初步探究

为了解抗冻剂对施氏鲟(Acipenser schrenckii)精子冷冻保存效果的影响及其冷冻损伤机理,比较了添加不同浓度海藻糖和蔗糖作为冷冻保护剂的精子稀释液处理后施氏鲟精子冷冻复苏的活力、快速运动时间和寿命。结果表明,添加60 mmol·L^-1海藻糖1.0 mmol·L^-1氯化钾的稀释液处理后,精子冻后快速运动时间和寿命与鲜精相比无显著差异(P>0.05);且活力较其他处理组有所提高,达到(26.67±3.32)%,但仍显著低于鲜精(P<0.05)。利用透射电镜和扫描电镜对施氏鲟精子超低温冷冻保存前后的超微结构进行观察,并对其能量代谢酶和抗氧化酶活进行测定和比较,结果表明,低温冻存造成施氏鲟精子的膜系统和细胞器(主要为线粒体和轴丝)损伤;能量代谢酶[总ATP酶、肌酸激酶(CK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)]和抗氧化酶[过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)]活性均显著下降(P<0.05),而抗氧化酶谷胱甘肽还原酶(GR)活性显著上升(P<0.05),表明...     

卤虫的营养

卤虫(Arem ia)是水产经济动物苗种生产中重要的活饵料之一,卤虫营养价值的高低直接影响到苗种生产的成败与效益。笔者拟就卤虫的营养价值研究作一综述,供学者参考。1卤虫粗蛋白及氨基酸的研究卤虫一直被水产界认为是高蛋白的生物饵料。不同发育阶段、不同产地和不同投喂条件下的卤虫,其体内的粗蛋白含量不同。随着卤虫的生长,粗蛋白的含量有逐步增加的趋势。国内文献报道卤虫卵粗蛋白含量为45.44%[1],卤虫去壳卵的粗蛋白含量为43.03%~57%[1-3],以新疆巴里坤盐湖卤虫卵粗蛋白含量最高(57%),卤虫初孵无节幼体粗蛋白含量为54.61%~59.92%[2],养…     

大菱鲆胚胎的玻璃化冷冻保存

Vitrification solutions were examined for their suitability of cryopreservation of turbot (Seophthulnms maximus) embryos. PMPI gave higher survival rate (75.68%) than other vitrification solutions and was considered to be suitable liar the cryopreservation of turbot embryos. The freezing point of the vitrification solutions consisted of PG and MeOH in the proportion of 3:2 was measured when the vitrification solutions were cryopreserved. It showed that the vitrification solutions with a cryoprotectant concentration of over 41% have no freezing point and the freezing points of vitrification solutions containing 33.33%-40% cryprotectants were between -32.4℃ and -65.4℃, The freezing point decreased with the increase of cryoprotectant concentration. The resistance of turbot embryos at different stages to the cryoprotectants was studied, It was found that the turbot embryos from 4-5 pairs somite to tail bud were more resistant to cryoprotectants and suitable to vitrify. A live embryo was obtained after cryopreservation in liquid nitrogen for 14h and was hatched out。     

超低温冷冻对中华绒螯蟹胚胎形态结构的影响

为了解超低温冷冻对胚胎形态结构的影响,以中华绒螯蟹为研究对象,运用石蜡切片、扫描电镜和透射电镜观察细胞分裂期、原肠期和原溞状幼体期胚胎,分别用玻璃化液处理和经超低温冷冻后外部形态和内部结构的变化。结果发现:(1)显微观察表明,细胞分裂期胚胎在玻璃化液中用二步平衡法处理后吸水膨胀明显,三步平衡后胚胎形态无明显变化,超低温冷冻后,卵黄物质从细胞中溢出,细胞破损严重;原肠期胚胎在玻璃化液中用二步平衡法处理后,外部形态与鲜胚无明显差异,经过冷冻后,所有胚胎内部变成粉红色,胚体由原来的透明变成不透明状,细胞膜边缘模糊似绒毛状;(2)扫描电镜观察,玻璃化液处理后的所有原肠期胚胎表面褶皱呈沟壑状,形成一层网状结构;透射电镜观察,处理后胚胎细胞内出现白色团块,细胞边缘变得粗糙有突起,细胞内冰腔清晰可见,空泡形成,80%以上线粒体解体,细胞破裂明显;(3)组织切片观察,原肠期胚胎细胞外面的膜脱落破损,胚层内有大小不一的冰腔,细胞内出现明显的空泡。原溞状幼体期胚胎经过玻璃化液处理后,外部形态与鲜胚间无明显区别,但经过超低温冷冻后,95%以上胚胎组织呈弥散状,部分卵黄物质碎裂成颗粒状,胚胎的细胞膜脱落,胚层内出现大量冰腔和空泡,90%胚胎表面皱缩凹陷,但仍有10%的胚胎表面保持光滑完整,表明原溞状幼体期胚胎是适合进行冷冻保存的时期。     

超低温冷冻对中华绒螯蟹胚胎线粒体DNA的影响

为了解超低温冷冻对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)胚胎线粒体DNA影响,选取细胞分裂期胚胎为研究对象,研究了4种玻璃化液处理和超低温冷冻对胚胎线粒体DNA的影响。结果表明:经过玻璃化液处理和冷冻后,胚胎线粒体上的Cytb基因能被稳定扩增,PCR电泳产物大小约1 600 bp,产物经回收后进行双向测序、比对和校正,获得10条Cytb基因全序列,长度为1 135 bp,其中有5个核苷酸变异位点,1 135 bp的Cytb基因序列一共编码378个氨基酸残基,从ATG第一位起始密码子开始到1 140位终止。经过玻璃化液处理和冷冻后,胚胎线粒体上的COI基因也能被稳定扩增,PCR电泳产物大小约1 600 bp,产物经回收后进行双向测序、比对和校正,获得10条COI基因全序列,长度为1 534 bp,其中有6个核苷酸变异位点,1 534 bp的COI基因序列一共编码511个氨基酸残基,从ATG第一位密码子开始到1 533位终止。经过玻璃化液处理和冷冻后,中华绒螯蟹胚胎线粒体上Cytb和COI基因共有11个位点发生了变异,但不同的玻璃化液处理和冷冻对碱基变异没有影响,发生的碱基变异中存在4种类型,即G→A、A→G、C→T、T→C,变异间只有转换发生,没有颠换发生,这些变异均未引起相应氨基酸残基的变异。     

中华绒螯蟹胚胎的玻璃化冷冻保存

研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)4个不同发育时期胚胎对A号玻璃化液的耐受性和玻璃化冷冻保存。结果表明,不同时期的胚胎对玻璃化液的耐受能力不同,其中卵裂期胚胎对玻璃化液的耐受能力较差(20~30 min),前无节幼体期和原溞状幼体期胚胎在玻璃化液中的适应时间较长(40~60 min);随着平衡时间的延长,中华绒螯蟹各个时期的胚胎成活率逐渐下降。中华绒螯蟹前无节幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,0.25mol/L的蔗糖分别洗脱5、10、15、20 min后,胚胎成活率无显著性差异(P>0.05)。前无节幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,在–196℃冷冻40 min,快速解冻后用0.25 mol/L的蔗糖洗脱10 min,有8个胚胎成活,成活率为(9.3±2.5)%,胚胎培养至第4天死亡;原溞状幼体期胚胎在A号玻璃化液中平衡40 min,在–196℃冷冻35 min,经相同浓度的蔗糖洗脱相同的时间,有7个胚胎成活,成活率(11.3±3.6)%,培养至第6天时,1个胚胎孵化出膜,出膜胚胎成活1d后死亡。     

玻璃化冻存对斑马鱼卵母细胞的影响

采用比色法测定了在不同玻璃化冻存液中冻存1、2、4、8d时斑马鱼卵母细胞中谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶的活性,以研究玻璃化冻存对卵母细胞谷胱甘肽含量和线粒体三磷酸腺苷酶活性的影响。试验结果显示,V4组斑马鱼(玻璃化液组分是:1.5mol/L甲醇、6.0mol/L乙二醇、0.25mol/L蔗糖)卵母细胞冻存1、2、4、8d后存活率最高[分别为(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%],显著高于其他组。经玻璃化冻存后,斑马鱼卵母细胞谷胱甘肽含量和线粒体三磷酸腺苷酶活性均随冻存天数的增加而显著下降(P0.05)。V4组的谷胱甘肽含量[(13.37±0.59)mg/g]和线粒体三磷酸腺苷酶活性较高,线粒体Ca~(2+)-三磷酸腺苷酶[(3.823±0.144)U/mg]、Mg~(2+)-三磷酸腺苷酶[(4.503±0.144)U/mg]和Na~+/K~+-三磷酸腺苷酶[(7.520±0.198)U/mg]活性最高。各组细胞的活性随着冻存天数的增加而逐渐下降。试验结果表明,玻璃化冻存不能完全避免低温和冷冻保护剂的毒性和对卵母细胞的损伤。     

Survival of zebrafish, Brachydanio rerio (Hamilton-Buchanan), embryo after immersion in methanol and exposure to ultrasound with implications to cryopreservation

This study examined the viability of embryos after immersion in highly concentrated methanol solutions (40–60%) and exposing embryos to ultrasound to enhance efficient transport of the cryoprotectant. The exposure to ultrasound, methanol concentrations, duration of treatment and the stages of embryonic development was found to have measurable effects on embryo viability. The effect of ultrasound was more evident at high voltage (>440 V) settings and at early developmental stages (30 and 60% epiboly stage). Older embryos were more resistant to cryoprotectant toxicity and ultrasound‐induced mortality. The high concentration of methanol (60%) was more toxic to embryos than the low concentration (40%). When methanol treatment and ultrasound were applied simultaneously the optimum concentration was found to be 45% methanol (45% survival; P<0.05) in a 3 min treatment. Although there was no significant difference between the 2 and 3 min treatments, embryos treated for 4 min had a significantly lower survival rate (P<0.05). These findings provide initial results to select the developmental stage of the embryo, the concentration of methanol for the preparation of a vitrification solution and duration of ultrasound treatment for cryopreservation. Furthermore, it indicates the potential use of ultrasound to enhance the transport of methanol intracellularly with minimum mortality of the developing embryos.     

超低温保存对罗氏沼虾胚胎几种酶活性的影响

研究了超低温冷冻保存(-196℃)对罗氏沼虾胚胎内总三磷酸腺苷酶(ATPase)、肌酸激酶(CK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)等酶活性的影响。运用试剂盒分别测定了冷冻前后罗氏沼虾胚胎内酶活性的变化。结果表明,经过超低温冷冻保存后,胚胎内7种酶的活性均显著下降(P0.05),其中总ATPase、CK、LDH和SDH的活性分别从冻前的1.322±0.162 U/mg prot、0.404±0.015 U/mg prot、352.225±23.214 U/gprot和2.067±0.139 U/mg prot下降到0.087±0.003 U/mg prot、0.010±0.002 U/mg prot、5.890±0.658 U/gprot和0.552±0.138 U/mg prot;SOD、CAT和GSH-Px的活性分别从冻前的19.217±0.677 U/mg prot、3.587±0.233 U/mg prot和7.626±1.106 U/(min.mg)下降至3.579±0.234 U/mg prot、1.773±0.227 U/mg prot和1.524±0.096 U/(min.mg);MDA的活性从1.015±0.038 n mol/mg prot上升到20.937±0.320 n mol/mgprot,超低温冷冻对罗氏沼虾胚胎酶活性有显著性影响。     

不同抗冻剂对牙鲆胚胎毒性研究以及玻璃化颗粒冷冻保存方法的应用

以牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同发育期胚胎为实验材料,研究了7种渗透性和5种非渗透性抗冻剂对牙鲆尾芽期和心跳期胚胎的毒性,同时对玻璃化液在不同胚胎发育期的毒性作用,以及玻璃化颗粒冷冻过程中,冷冻颗粒降温和解冻的时间进行了研究。结果表明,单一渗透性抗冻剂对牙鲆胚胎的毒性随着抗冻剂浓度的升高、平衡时间的延长而提高,其毒性由大到小依次为乙二醇(EG)、酒精(EtOH)、甘油(Gly)、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、甲醇(MeOH)、1,2-丙二醇(PG)。非渗透性抗冻剂中聚乙烯吡咯酮(PVP)对牙鲆尾芽期胚胎的毒性最强,其次是蔗糖和D果糖,葡聚糖和葡萄糖毒性最弱。在总体积分数一定的情况下,PG、MeOH与DMSO体积比为9∶6∶5的混合抗冻剂对牙鲆尾芽期胚胎毒性最低;各发育期胚胎经过玻璃化液平衡后,尾芽期以前胚胎的成活率随胚胎发育期逐渐升高,心跳期以后逐渐降低,尾芽期和心跳期成活率最高。含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温时间最短为15.09 s,解冻时间最短为6.22 s;而不含胚胎的玻璃化颗粒冷冻降温和解冻时间分别为(13.83±1.86)s和(7.20±0.90)s。将PG、MeOH与DMSO按体积比9∶6∶5配成总体积分数为35%的混合溶液,再添加5%的蔗糖配制成玻璃化液,采用此玻璃化颗粒冷冻方法对173粒牙鲆尾芽期至心跳期胚胎进行超低温冷冻保存,解冻后共获得4粒成活胚胎。