一种鸭病毒的分离及鉴定

试验对江苏省某地雏鸭群中发生的传染性疾病进行鉴定,初步确诊为鸭病毒性肝炎。采集疑似鸭肝炎病死鸭的肝脏组织,分离病毒经鸭胚传代培养发现鸭胚变红,肝脏变性;抗体可被Ⅰ型DHV标准阳性血清完全中和;RT-PCR测定714 bp处出现了特异性的DNA条带;序列分析鉴定与Ⅰ型DHV标准毒株DRL-62株的同源性为97.1%,可以证明所分离的病毒株是血清Ⅰ型。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒鸡胚致弱毒MY株的培育及实验研究

将I型鸭肝炎分离株XC-1适应鸡胚,培育成1株毒力弱而稳定、免疫原性良好的鸭肝炎鸡胚化MY弱毒株.该毒株毒力为1011.40ELD50/0.1mL,1013.62TCID50/0.1mL;对雏鸭无致病性;在雏鸭体内连续盲传5代未见毒力返强;1日龄雏鸭用8,000 ELD)50/0.1mL的MY株致弱毒腿部肌注0.2ml免疫后3d强毒原液0.5mL/只攻击,可产生2/5的保护,第6d-21d产生完全保护,免疫后第3d、5d、6d、7d、9d、14d、21d抗DHV I的中和抗体滴度分别为10-1.38、10-1.55、10-1.64、10-1.65、10-1.68、10-1.8、10-1.89,表明MY是1株理想的鸡胚弱毒疫苗后备株;通过MY株的鸡胚的繁殖规律观察,确定该病毒的最佳收毒时间为接胚后的72h～84h,为疫苗生产条件的建立提供了依据.     

一株江苏新型鸭肝炎病毒的鉴定

对江苏地区分离到的1株疑似鸭肝炎病毒毒株（JS株）进行传代繁殖、雏鸭回归试验和理化性能测定,结果表明,该毒株能在鸭胚上进行传代繁殖,E1～E6代鸭胚毒的ELD50为10438·02 mL－1 ～10617·02 mL－1;攻毒的雏鸭可产生与I型鸭肝炎病毒相同的症状和病变;3,7,14日龄易感雏鸭的LD50分别为1055·02 mL－1,10517·02 mL－1,10383·02 mL－1;病毒对氯仿、乙醚和胰酶不敏感,对酸（pH 30）稳定,对热不稳定。进一步进行交叉中和试验、交叉被动保护试验和VP1基因序列分析,结果显示,该毒株的抗原性与经典1型DHV差异显著;VP1序列与多株1型DHV的同源性在693%～933%;从进化关系来看,与韩国株的亲缘性最近。JS株属于我国流行的新型鸭肝炎病毒（命名为N\|DHV\|JS株）。     

七彩山鸡新城疫病毒的分离鉴定与免疫保护试验

用SPF鸡胚从疑似七彩山鸡新城疫病鸡群中分离到一株病毒,进行HA及HI试验以及病毒中试验。结果表明,血凝作用可被NDV阳性血清所抑制,而不能被AIV（H9亚型）、EDS76所抑制,经ND标准阳性血清处理的病料接种的鸡胚未见死亡,证明分离毒为NDV。动物回归试验表明,分离毒肌肉注射非免疫七彩山鸡能使之发病、死亡,出现与自然病例一致的症状与病变,但肌注SPF鸡只感染,不出现临床症状。其生物学特性NHAT为快、HOT为8min、ICPI为1．73、IVPI为1．45、MDT为44h。表明该七彩山鸡NDV分离株与鸡F48E9株在生物学特性上表现出不同的特性。用分离毒株制成油乳剂灭活疫苗,分别以分离毒株和Lasota株的灭活苗免疫广西麻鸡和七彩山鸡,进行疫苗免疫效果比较和交叉免疫保护试验。结果表明,分离毒株灭活苗免疫组鸡各个时期所产生的HI抗体效价和Lasota灭活苗免疫纽鸡的抗体效价相差不明显,各组的升降规律也基本一致;Lasota灭活苗免疫七彩山鸡对分离毒株的攻击只能80％保护。而其他各免疫组的无论是对分离毒株还是F48E9株的攻击均能100％保护。说明NDV不同毒株之间的毒力和抗原性存在一定的差异。     

鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱,旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代,以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株（命名为VC2）的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐渐提高的趋势,ELD50由第20代的10^-5.3/0.1mL提高到第120代的10^-5.8/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】本研究通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。     

八株禽副粘病毒Ⅰ型的生物学特性和免疫原性

为了解禽副粘病毒Ⅰ型不同毒株的某些生物学特性,测定了分离于三黄鸡、乌骨鸡、孔雀、鹅、鸭等不同宿主的7株禽副粘病毒的血凝特性、血凝解脱时间、鸡胚半数致死量、脑内致病指数、静脉致病指数,并与新城疫病毒强毒株F48E8进行了比较。结果显示,7株禽副粘病毒的毒力除分离自鸭的1株Y01属于弱毒株外,其余6株的毒力均与F48E8相当。为筛选具有优良免疫原性的禽副粘病毒Ⅰ型病毒株,用包括F48E8在内的8株病毒分别制备油乳剂灭活疫苗,免疫40日龄SPF鸡,用21 d后的血清进行交叉血凝抑制试验,用免疫鸡进行交叉攻毒试验。由交叉血凝抑制价计算出的“优势”标准(D)和交叉攻毒保护结果得知,8株禽副粘病毒的免疫原性有很大差异,SHJ00对8株禽副粘病毒的D值均大于、等于1.0,有较高的攻毒保护率,免疫原性最佳;F48E8、SHJ02、E01、KQ02、Y03、Y01依次降低;WG J02对其它7株病毒的D值均小于1.0,攻毒保护率最低,免疫原性最差。这一结果为研制对该病有效的疫苗打下了基础。     

鸭病毒性肝炎高免卵黄抗体研制与应用

用鸭肝炎病毒(DHV)地方分离毒株HB98株经鸡胚连续传53～62代适应鸡胚的鸭肝炎病毒作为种毒,制备成弱毒疫苗和灭活疫苗分别免疫伊莎产蛋鸡,经3次免疫后,收获卵黄,测定病毒中和效价可达103以上,经30万只雏鸭临床应用,对未发病的雏鸭预防保护率达90％以上,发病鸭群治疗保护率达80％以上.     

鸭病毒性肝炎病原分离鉴定与防治研究

从三门峡某鸭场疑似鸭病毒性肝炎的发病或病死肉雏鸭的肝脏中分离到 1株病毒 ,经电镜观察、雏鸭保护试验、鸭胚中和试验鉴定为血清 型鸭病毒性肝炎病毒。从而证明引起雏鸭大量发病和死亡的主要原因为鸭病毒性肝炎所致。用鸭病毒性肝炎标准毒株多次强化免疫家兔 ,获得兔抗鸭病毒性肝炎高免血清 ,用此高免血清给发病雏鸭紧急注射 ,获得了满意的治疗效果     

伪狂犬病病毒(PRV)不同毒株抗原相关性研究

为了解PRV不同毒株之间的抗原性差异,评价弱毒FB株预防新型PRV的潜力,以4株PRV(FA、FB、Bartha-K61和FJ2012)毒株及其高免血清为材料,应用交叉中和试验测定PRV不同毒株的抗原性差异,通过FB免疫猪攻毒试验评价弱毒FB株对新型PRV的保护潜力。结果表明:中和抗体测定表明兔抗FB株、FA株、Bartha-K61株和FJ2012株高免血清的中和效价分别为1∶54、1∶91、1∶91和1∶215。交叉中和试验显示FB株与FA株、FB株与FJ2012株、FA株与FJ2012株的抗原相关性(R值)均大于0.8,Bartha-K61株与FA株、FB株、FJ2012株的R值均小于0.4,表明FB株与FJ2012株的抗原相关性高于Bartha-K61株与FJ2012株。仔猪免疫攻毒试验显示FB免疫猪能抵抗新型PRV(FJ2012株)的攻毒,保护率100%。提示PRV弱毒FB株有望成为预防新型猪伪狂犬病毒(FJ2012株)的疫苗候选株。     

鸭病毒性肝炎多价卵黄抗体的研制

选取4株不同地区分离的适应鸡胚的鸭肝炎病毒作为疫苗株制备灭活苗,免疫试验鸡制备卵黄抗体。鸡胚中和试验表明,第三次免疫后15天,抗体中和效价(PD50)都在29以上,卵黄抗体保护雏鸭试验显示,本试验制备的卵黄抗体有着显著的预防效果,并大大提高攻毒后雏鸭的存活率。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT—PCR检测方法的建立

参考GenBank中Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHV-I）的基因序列,应用Primer Premier5．0软件设计了一对引物,建立了适合DHV—I快速检测的RT—PCR检测方法。以该方法对实验室分离并保存的DHV强毒株Z10株的RNA为模板进行RT—PCR扩增,得到了预期大小为699bp的目的片段。将扩增所得的DNA片段进行克隆测序,测序结果与GenBank中的DHV-I的相应基因序列比对分析,同源性均达90％以上．表明为DHV—I的基因序列,对NDV,IBDV,DPV和GPV等常见病毒扩增结果为阴性。该方法敏感性检测结果表明．最低RNA模板检出量为24pg。表明所建立的RT—PCR检测技术具有特异、快速和敏感的特点,可用于Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒的快速诊断。     

11株巨型艾美耳球虫的免疫原性分析

用平均增重和病变记分或卵囊减少率等为试验指标,对11株巨型艾美耳球虫的免疫原性进行了分析。结果显示,各虫株每鸡免疫感染100个卵囊后,不仅对攻击1×105个同源株卵囊均产生大于70%的病变记分降低率,而且使每鸡攻击1×104个同源株卵囊时的卵囊产量均减少97.42%以上,在各虫株间无显著差异。各虫株对异源株的交叉免疫力程度不一致,美国株对国内10个虫株的卵囊减少率为20.09%~82.44%,仅3株大于75%,而国内10个虫株对美国株的卵囊减少率为27.43%~95.26%,有5株大于75%;扬州株、南通株、凤阳株、龙岩株、广州株和上海株间的相互卵囊减少率为-1.72%~96.67%,其中南通株对扬州株、凤阳株、龙岩株、广州株和上海株的卵囊减少率均大于75%,上海株对扬州株、南通株、凤阳株与广州株的卵囊减少率为-1.72%~57.69%。     

一株韩国新型DHV的分离及RT-PCR鉴定

从山东省某疑似鸭肝炎发病区分离到1株病毒JFX08,血清中和试验结果表明该分离毒与传统的Ⅰ型鸭肝炎病毒无交叉保护,分离毒回归3日龄雏鸭,可复制出鸭肝炎的典型症状和病理变化。根据已公布的韩国新型(基因C型)DHV的序列设计合成一对引物,进行RT-PCR扩增,得到大小约414 bp的目的条带;测序分析发现,分离毒与传统Ⅰ型DHV之间的相似性较低,而与韩国新型DHV之间的相似性高达93.2%～94.0%;进化分析结果表明,该分离毒与韩国新型DHV的遗传距离最近,属基因C型DHV。     

鸡新城疫强度株的分离鉴定与免疫保护试验

从河北省保定地区发病鸡群中分离到2株有血凝性的分离物,其血凝作用可被NDV阳性血清所抑制,而不能被AIV(H9亚型)、EDS 76所抑制,表明2株分离物均为新城疫病毒。对2株NDV的毒力指数(MDT、IC-PI、IVPI)测定结果显示:MDT分别为40.8 h和53.7 h,ICPI分别为1.96和1.86,IVPI分别为2.89和2.72,表明2株NDV均为新城疫强毒株。采用分离的HBW株制成油乳剂灭活疫苗,分别以HBW株和LaSota株的灭活苗免疫试验鸡,进行疫苗免疫效果比较和交叉免疫保护试验。结果显示:(1)分离株灭活苗免疫组鸡各个时期所产生的HI抗体效价和Lasota灭活苗免疫组鸡的抗体效价相差不明显,2组的升降规律也基本一致。(2)分离株灭活苗免疫组鸡(HI抗体效价为6log2以上时)对相同剂量F48E9标准毒株和2个分离株的攻击可给予100%的保护,Lasota灭活苗免疫组鸡(HI抗体效价为6log2以上时)对相同剂量F48E9标准毒株和2个分离株的攻击不能给予100%的保护。说明NDV不同基因型毒株间的毒力和抗原性有一定的差异。     

鼋摩氏摩根氏菌的鉴定及致病性

本研究旨在寻找引起鼋(Pelochelys bibroni)体表溃烂的致病因子。从北京地区自然患病的鼋体表分离到致病菌株YB0428,采用生理生化鉴定结合16S rRNA基因序列的系统发育学分析确定该菌株的系统发育地位。同时采用琼脂扩散法对抗菌类药物的敏感性进行测定。菌株YB0428与Morganella morganii HX081027的16SrRNA基因序列相似性达94%;结合形态特征与生理生化测定结果,该菌为革兰阴性杆菌,氧化酶阴性;V-P试验反应阴性;柠檬酸盐试验阴性;吲哚阳性;脲酶阳性;鸟氨酸脱羧;不产生赖氨酸和精氨酸双水解酶。在37种抗菌类药物对该菌的抑菌试验中,奈替米星、羧苄西林、哌拉西林等10种药物的抑菌效果较好。确定该菌株在分类上属于摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)。为进一步防治鼋细菌性病害提供了科学依据。     

一株副乳房链球菌的分离鉴定及生物学分析

从四川省某大型养殖场病死猪肺脏分离到一株副乳房链球菌,观察该菌株的生长特性、染色特性,进行生化鉴定、药敏鉴定、毒力试验以及16S rRNA基因序列进化树分析。结果显示：该分离株的16S rRNA序列与副乳房链球菌的同源性为99%。分离株在TSA琼脂培养基上呈光滑圆形,半透明的菌落,在血琼脂上呈β溶血;对小鼠的致病性试验测得LD50为206×107 cfu·只-1;药敏试验表明,其对头孢类药物较为敏感,对喹诺酮类、四环素类以及氨基糖苷类不敏感。该研究为该菌的临床诊断、疾病预防、选药治疗等奠定了基础。     

氯嘧磺隆降解真菌的分离和鉴定

从田间多年施用氯嘧磺隆的土壤中,驯化分离得到1株能够以氯嘧磺隆为唯一碳源和能源生长的真菌,命名为F31。该菌株在麦芽汁平板培养基上形成的菌落为乳白色,奶油状、表面光滑;经电镜观察,细胞长卵形,长5~7μm,宽3~4.5μm。糖类发酵试验表明,该菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖,不能发酵淀粉、乳糖;同化碳源试验表明,该菌株能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乙酸钠,不能利用淀粉;同化氮源试验表明,该菌株不能利用硝酸钾,能利用硫酸铵、尿素。根据其形态特征、生理生化特性、18SrRNA序列分析,初步鉴定F31为酿酒酵母(Saccharomy cescerevisiae)。     

乳杆菌的分离及鉴定

从健康学龄儿童的新鲜粪便样品中分离得到6株乳杆菌,并对其进行属和种的鉴定。首先通过形态学观察及H2O2酶、糖发酵等生理生化试验对所分得菌株进行初步鉴定,然后利用16S rDNA序列同源性分析方法,对所分得菌株进行16S rDNA基因扩增与测序,测序结果与GenBank中该属内菌株的16S rDNA基因序列进行同源性分析,从而准确鉴定所分得菌株,并申请各菌株的GenBank登录号。经鉴定,其中1株为卷曲乳杆菌,2株为植物乳杆菌,1株为发酵乳杆菌,1株为黏液乳杆菌,1株为唾液乳杆菌。     

一株产多不饱和脂肪酸海洋细菌的筛选及鉴定

[目的]对一株产多不饱和脂肪酸(PUFA)的海洋细菌进行筛选及鉴定。[方法]以东海海域采集的鲭鱼、鮟鱇鱼、小黄鱼和虾的肠道为样品,从中筛选产PUFA的海洋细菌,并对其进行生理生化试验和16S rDNA序列分析。[结果]试验共筛选出8株菌株,其中P4菌株的PUFA产率较高。常规生理生化试验和16S rDNA序列分析结果显示,P4菌株是芽孢杆菌属的一个种。[结论]P4菌株具有高产PUFA性质,可用于脂肪酸的提取和开发利用。     

巨龙竹组培苗污染优势内生菌的分离与鉴定

【目的】对引起巨龙竹组培苗污染的优势内生菌进行分离与鉴定,为后期巨龙竹组织培养基的优化及预防巨龙竹组织培养过程中内生菌污染提供科学依据。【方法】采用NA培养基分离纯化菌株, 然后通过菌体的形态结构观察、生理生化试验及16S rDNA序列同源性分析,对引起巨龙竹组培苗污染的优势内生菌进行鉴定。【结果】引起巨龙竹组培苗污染的优势内生菌为SWFU03菌株,其形态特征及生理生化试验结果与芽孢杆菌属（Bacillus）坚强芽孢杆菌（Bacillus firmus）的生理生化特征基本相同;16S rDNA序列分析结果表明,菌株SWFU03与坚强芽孢杆菌（GQ903389.1）在同一系统发育分支,其同源性为99.11%。【结论】引起巨龙竹组培苗污染的优势内生菌菌株SWFU03为坚强芽孢杆菌。