高体革鯻线粒体DNA16S rRNA和COI基因片段的克隆和序列分析（摘要）

[目的]为高体革鯻的遗传资源、物种间的亲缘关系和系统进化等研究提供一定的生物学依据。[方法]采用PCR扩增和序列测定等技术,对高体革鯻线粒体DNA16S rRNA和COI基因片段进行初步研究。[结果]经PCR扩增和测序,分别得到16SrRNA和COI基因片段的碱基序列,其中16SrRNA基因片段的大小为791bp,碱基A、T、G、C的含量分别为31.6%、21.4%、20.4%和26.7%;COI基因片段的大小为631bp,碱基A、T、G、C含量分别为27.7%、23.6%、29.8%和18.9%。在这2个基因片段中,GC含量均低于AT含量,AT/GC分别为1.13和1.05。[结论]通过对高体革鯻16SrRNA和COI2个基因片段遗传特征的研究,发现其种内变异比较低,在3个样本中16SrRNA基因片段序列完全一样,COI基因片段也完全一样,说明高体革鯻的这2个基因都非常保守。     

基于线粒体COI和16S rRNA基因序列的虹鳟DNA条形码研究

通过对虹鳟（Oncorhynchus mykiss）线粒体COI和16S rRNA基因片段PCR扩增,经纯化、克隆、测序后,对基因序列进行分析,进一步对虹鳟进行物种分子鉴定。测序结果表明：COI基因序列长为686 bp,其中A,T,C,G含量分别为23.03%,29.15%,29.01%,18.80%;16S rRNA基因序列长为607 bp,其中A,T,C,G含量分别为27.84%,21.58%,25.21%,25.37%。将得到的基因序列通过GenBank和BOLD两数据库进行比对,GenBank中没有虹鳟的线粒体16S rRNA基因序列,比对结果为0,COI基因比对结果为99%,而在BOLD中的比对结果为100%,鉴定结果为虹鳟。生产实践中可通过此方法提供一种基因标签对虹鳟幼鱼、鱼糜制品和三文鱼片等进行种类鉴定。     

8个地理种群红条毛肤石鳖COI基因的遗传多样性分析

[目的]分析我国8个沿海潮间带红条毛肤石鳖地理种群的COI基因的遗传多样性。[方法]利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增8个地区80个红条毛肤石鳖样品的COI基因。使用DNASP5.10.01、MEGA7.0等软件对所得序列进行分析,得到片段碱基含量、遗传距离以及遗传多样性参数等数据,并通过构建系统发育树的方式,结合遗传多样性数据分析结果。[结果]获得的COI基因片段长度为659 bp,COI基因位于线粒体编码区中,平均A、T、C、G的碱基含量分别20.4%、41.7%、14.9%和23.0%,存在明显的AT偏向,结合Acanthochitona crinita为外群系统发育树的结果来看,中国沿海地区红条毛肤石鳖种群分成2个明显的聚群,将它们定义为北方群体和南方群体,遗传距离为0.000 66～0.087 85。单倍型遗传多样性数据显示,多样性数值较高,但核苷酸多样性较低。[结论]红条毛肤石鳖北方群体的遗传多样性与南方群体存在差异,2个群体应该分别采取相应措施来保护遗传多样性。     

巨魾线粒体12SrRNA 和16SrRNA 基因克隆及多态性分析

运用酚-氯仿方法提取12尾采集于云南省境内河口县的巨魾DNA,利用GenBank中鮡科种类设计特异性引物进行PCR扩增和克隆,利用DNAMAN软件进行序列比对以及采用软件MEGA 4.0来分析巨魾的碱基含量、遗传距离和系统进化树.结果显示:(1)得到954bp的12S rRNA基因序列和535bp的16S rRNA基因序列各12条;(2)12尾巨魾的12S rRNA基因、16S rRNA基因以及12S rRNA基因和16S rRNA的合并基因序列的相似性分别为99.89%,99.95%,99.89%;(3)12尾巨魾的12S rRNA,16S rRNA均表现出A+T碱基含量高于G+C碱基含量;(4)12尾巨魾的平均遗传距离为0.002,转换比颠换的平均值为3.065;(5)利用Neighbor-Joining(NJ)法构建的系统进化树表明魾属单独成一支,支持率达到99%,这一结果与传统的形态学分类基本相似.     

梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段的比较分析

运用PCR技术,扩增了梭鱼和鲻鱼线粒体16S rRNA和COⅠ基因片段,并比较分析了其种间的序列差异。获得16S rRNA基因的540～560 bp碱基序列,出现26个碱基的插入与缺失位点;获得COⅠ基因的602～604 bp碱基序列,出现2个插入缺失位点;16S rRNA和COⅠ基因的序列中G平均含量最低,且（A＋T）含量高于（G＋C）含量,与其他鱼类中的16S rRNA和COⅠ基因片段研究结果相一致。在16S rRNA基因片段中,梭鱼出现1种单倍型,鲻鱼为2种单倍型;在COⅠ基因片段中,梭鱼样品中检测到3个单倍型,鲻鱼样品中检测到5个单倍型。以Takifugu poecilonotus为外群,构建的NJ系统发育树,基于16S rRNA和COⅠ基因序列获得的NJ系统树基本一致,鲻鱼和梭鱼种内个体分别聚为一支,显示16S rRNA和COⅠ基因适合于梭鱼和鲻鱼的物种鉴定。     

中华豆蟹与太平大眼蟹ITS区比较研究

[目的]为蟹类的分子进化研究积累资料。[方法]采用酚-氯仿抽提法从中华豆蟹和太平大眼蟹的肌肉组织中提取总基因组DNA,对其ITS基因片段进行PCR扩增和测序,同时对其序列同源性、碱基组成和变异情况进行初步研究。[结果]中华豆蟹与太平大眼蟹ITS序列片段分别为739和769 bp,存在明显长度差异。中华豆蟹的AT含量和GC含量分别为49%和51%,而太平大眼蟹分别为40.79%和59.3%。4种碱基(A、T、G、C)在2种蟹中ITS序列的平均含量基本相当。中华豆蟹与太平大眼蟹ITS序列片段共有777位点,其中变异位点346个,碱基转换与颠换比约为0.8。颠换数大于转换数,表现为较高的颠换偏岐。[结论]中华豆蟹和太平大眼蟹间的平均遗传距离为0.603。     

广西钦州湾牡蛎线粒体COI基因片段变异分析

采用PCR方法扩增66个广西钦州湾牡蛎个体的线粒体细胞色素氧化酶I亚基基因(COI)片段,纯化后经测序分析,得到535 bp的碱基序列,其中A、T、G、C、A T和C G含量分别为23.8%、37.5%、20.5%、18.2%、60.5%和39.5%。比较它们与香港牡蛎和有明巨牡蛎COI序列的差异,钦州湾白肉牡蛎与香港牡蛎COI序列完全相同,而红肉牡蛎与有明巨牡蛎序列相同。DNAStar软件对比分析发现30个突变位点,其中16个位点为转换,14个位点为颠换。MEGA4软件构建NJ系统进化树显示白肉牡蛎和红肉牡蛎分为不同的2支。据此初步认为广西钦州湾牡蛎可能为2个不同的种群,COI基因片段可作为分析牡蛎种群遗传和系统发育的分子标记。     

基于16S和COⅠ基因探讨岩扇贝在扇贝科中的分类地位

采用PCR扩增和序列测定等技术,对岩扇贝(Crassadoma gigantea)线粒体DNA 16S rRNA和COⅠ基因片段进行初步研究,得到16S rRNA基因片段的大小在613.0～634.0 bp之间,A、T(U)、G、C的平均含量分别为26.5%、29.7%、24.5%、19.3%;COⅠ基因片段的大小为660 bp,碱基A、T、G、C的平均含量分别为17.2%、40.3%、27.2%、15.3%。16S基因在岩扇贝中偏好使用GUU、UUG、AUU、ACG、UAU、CAA、GAG、UUU、UCU、GAU、GGU、GAG、AGG和GGA等25个密码子。COⅠ系统进化树表明,与岩扇贝亲缘关系最近的是柿孔扇贝(Azumapecten farreri),其次是冰岛扇贝(Chlamys islandica)。16S系统进化树亲缘关系由近到远依次是北美扇贝(Patinopecten caurinus)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、Chlamys islandica。     

亚东鲑线粒体COI与 COⅡ基因遗传多样性分析

[目的]分析亚东鲑线粒体COI与COⅡ基因遗传多样性。[方法]分别从西藏亚东河与亚东鲑养殖站采集野生与养殖亚东鲑各15尾样品,对其线粒体DNACOI、COⅡ基因全序列进行PCR扩增、测序比对。[结果]序列长度分别为631、634bp。序列分析结果显示：30条亚东鲑线粒体DNACOI、COⅡ序列分别检测到1种、3种单倍型,均无碱基插入、缺失,COⅡ序列有2个位点出现碱基替换;COI、COil序列T、C、A和G碱基平均含量分别为29．5％、28．97％,30．6％、28．47％,22．5％、27．03％和17．4％、15．53％,其中A＋T的含量（52．O％、56．0％）均显著高于G＋c含量（48．O％、44．0％）,均表现出明显的碱基偏倚;COI、COⅡ单倍型多态性（h）与核苷酸多态性（＂iT）值分别为0、0．80与0、0．0001;根据Kimura双参数模型构建基于线粒体COI、COU序列的系统进化树,两亚东鲑鱼遗传距离分别为0、0．0024。【结论】西藏亚东鲑的遗传多样性水平较低,且养殖和野生群体无遗传分化。     

5个罗非鱼品种(系)线粒体DNA 16S rRNA和Cyt b基因片段序列分析

对3个尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)品系(埃及、无锡、吉富)和奥利亚罗非鱼(Oreochromis au-reus)以及杂交种奥吉(奥利亚♀×吉富♂)的线粒体16SrRNA和细胞色素b(Cytb)的部分序列进行了PCR扩增和序列测定,并分析了其序列差异。结果表明:PCR产物纯化后测序,16S rRNA扩增产物得到长度为596bp的基因片段,其碱基组成G+C平均含量为47.5%,序列比对分析显示变异位点13个,没有碱基的插入/缺失变异,转换/颠换比率为3.33;Cytb扩增产物测序得到659bp的同源片段,其碱基组成G+C含量平均为45.2%,无插入/缺失变异,变异位点共2个,都为转换,2处变异都发生在密码子第3位上,编码的氨基酸未发生变异。序列分析表明,尼罗罗非鱼3品系的序列完全相同,奥利亚的序列则与奥吉相同。这表明在罗非鱼线粒体DNA中,16S rRNA进化速率相对较快,而Cytb基因则高度保守,不适于研究罗非鱼种内和种间的亲缘关系和种类鉴别标记。     

中国近海13种对虾分子系统演化和近似种问题的研究

对中国沿海13种对虾科动物的16SrRNA基因（约371bp）和细胞色素氧化基因I（COI）部分序列（约385bp）进行了分析,并采用“最大简约法”、“最小进化法”和“最大似然法”构建了分子系统树。结果表明：在COI基因序列中,有113个位点存在变异（约为总位点数的31．8％）,高于16SrRNA基因序列的44个变异位点（约为总位点数的11．9％）;构建的分子系统树显示,所构建的NJ、ME和MP树的拓朴结构较为相似,但斑节对虾、日本对虾和缘沟对虾在3个树中相聚位置不同。中国沿海对虾科6属13种,形成3个明显的分支,这3支分别隶属新对虾属、仿对虾属和原对虾属。对虾属、新对虾属、仿对虾属的种间关系与分子系统发育分析结果与传统分类学相一致。16SrRNA序列可能更适用于对虾属以上阶元的遗传多样性分析;COI序列更适合对虾科种间和群体遗传多样性的研究。     

山药内生菌的分离及菌种鉴定研究

[目的和方法]分别采用5种培养基对山药根根中的内生菌进行分离,得到了10株内生菌,通过形态学分析其为4种微生物,16S rRNA比对分析确定其分属为欧文氏菌属(Erwinia)和芽孢杆菌属(Bacillus),未发现放线菌和真菌.[结果]表明山药内生菌极为单调.其中,能在山药浸出液培养基中大量产生多糖的菌株SS2的16S rRNA与模式菌株Erwinia pyrifoliae Ep1/96~T 最大同源性为97.1;.[结论]极有可能为新种.     

两种鲷属鱼类线粒体COI基因片段序列的比较

利用通用引物成功扩增了黄鳍鲷和黑鲷的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因序列。通过序列测定，得到581bp的基因片段，碱基A、T、G、C平均含量分别为25．8％、32．6％、18．0％和23．6％，序列中的A＋T含量明显高于G＋C含量，与其他鱼类的C01基因片段研究结果相一致。通过序列分析发现黄鳍鲷和黑鲷两序列共存在14处碱基变异，其中在第19～139bp之间检测到13个变异位点，是变异频率较高的区段，可以考虑作为鲷属或者种群鉴别的分子标记。与黄鲷、真鲷、三长棘真鲷等鱼类比较，无插入和缺失位点，转换明显高于颠换。序列差异比较结果显示，真鲷与黄鳍鲷的序列差异在这5种鱼类中最大，达到了18．2％，黄鳍鲷和黑鲷的筹异最小（2．4％）。两个序列已提交到GenBank数据库中．序列臀录号为DQ185608和DQ185609.     

拜城盐山免培养放线菌多样性研究

[目的]研究新疆拜城盐山高盐环境中的放线菌多样性,为今后的开发和利用奠定基础.[方法]应用基于16SrRNA基因序列的免培养技术和系统发育分析方法对拜城盐山样品中的放线菌多样性进行研究.采用SDS- CTAB方法提取样品中的总DNA,利用特异性引物扩增样品DNA中的放线菌16S rRNA基因,并构建放线菌16S rRNA基因克隆文库;通过比较酶切图谱,挑选克隆文库中的代表克隆,进行序列测定和BLAST比对分析.[结果]构建的放线菌克隆文库共包含216个放线菌克隆.克隆序列经过BLAST比对分析,放线菌亚纲中的克隆有171个,占总克隆数的79.2;.酸微菌亚纲45个克隆,占总克隆数的20.8;,与GenBank中已知的微球菌16S rRNA基因序列最大相似度小于92;,是酸微菌亚纲中新的类群.优势放线菌为放线菌亚纲棒杆菌亚目诺卡氏菌科( Nocardiaceae)的红球菌属(Rhodococcus),占克隆总数的51.9;.有24.5;的序列与已有效发表菌株的序列相似性小于97;,部分序列形成了几个独立的进化分支,可能代表着放线菌新的类群.[结论]拜城盐山存在着较为丰富的放线菌种类,并且潜藏着新类型的放线菌资源.     

斑鳢内脏白点病病原的分离鉴定

从患内脏白点病的斑鳢Channa maculata肝、脾、肾组织中分离并筛选出一株致病菌GC1,对该病菌的形态学及生理生化特性进行了测定,结果均符合舒氏气单胞菌Aeromonas schubertii的特性。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,得到该菌的部分16S rRNA基因序列,长约1 502 bp。将所测序列与GenBank中序列进行Blast比对并构建系统进化树,结果表明,该序列与舒氏气单胞菌的同源性高达99%。人工感染试验证明,该菌株具有极强的致病力,LD50为104.5CFU/mL。29种药物筛选结果显示：该菌对菌必治、先锋必、头孢氨苄、头孢噻吩、先锋V、萘啶酸、四环素、氧氟沙星、氟罗沙星等18种药物高度敏感;对阿莫西林、红霉素、克拉霉素等7种药物中度敏感;对青霉素G、杆菌肽、苯唑青霉素等不敏感。     

齿突斜纹蟹线粒体DNA中12S rRNA基因序列的研究

于１９９６年８月在日本东京水产大学坂田试验场海岸岩礁地带采集齿突斜纹触（Ｐｌａｇｕｓｉａ ｄｅｎｔｉｐｅｓ）样品,参考果蝇（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｙａｋｕｂａ）线粒体ＤＮＡ中１２ＳｒＲＮＡ基因片段序列进行了其引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定。得到齿突斜纹触线粒体ＤＮＡ中１２ＳｒＲＮＡ基因片段的碱基序列为４４７ｂｐ,其中腺嘌呤（Ａ）、胸腺嘧啶（Ｔ）、鸟嘌呤（Ｇ）、胞嘧啶（Ｃ）含量分别为１６０ｂｐ（３５     

两种鲷属鱼类线粒体COI基因片段序列的比较

利用通用引物成功扩增了黄鳍鲷和黑鲷的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因序列。通过序列测定，得到581bp的基因片段，碱基A、T、G、C平均含量分别为25．8％、32．6％、18．0％和23．6％，序列中的A＋T含量明显高于G＋C含量，与其他鱼类的C01基因片段研究结果相一致。通过序列分析发现黄鳍鲷和黑鲷两序列共存在14处碱基变异，其中在第19～139bp之间检测到13个变异位点，是变异频率较高的区段，可以考虑作为鲷属或者种群鉴别的分子标记。与黄鲷、真鲷、三长棘真鲷等鱼类比较，无插入和缺失位点，转换明显高于颠换。序列差异比较结果显示，真鲷与黄鳍鲷的序列差异在这5种鱼类中最大，达到了18．2％，黄鳍鲷和黑鲷的筹异最小（2．4％）。两个序列已提交到GenBank数据库中．序列臀录号为DQ185608和DQ185609.     

20种溪蟹线粒体COI基因比较分析及系统发育研究

【目的】比较分析20种溪蟹的线粒体COI基因序列,并基于COI基因序列构建溪蟹科系统发育进化树分析不同种类间的亲缘关系,探究COI基因作为分子标记在溪蟹物种鉴定中的适用性,同时为溪蟹科的物种鉴定及系统发育研究提供理论依据。【方法】测定2种龙溪蟹属（Longpotamon）代表种的线粒体COI基因全序列,结合GenBank中已公布的18种溪蟹科COI基因全序列,利用MEGA X计算其碱基组成、保守位点和遗传距离,采用MatGAT 2.02进行多序列相似性比较分析,并以PhyloSuite构建贝叶斯树（BI）和最大似然树（ML）,探究溪蟹科物种内部的亲缘关系。【结果】20种溪蟹的COI基因序列全长1534~1539 bp,连续编码511~512个氨基酸残基,所有物种均以ATG为起始密码子;碱基含量略有不同,分别为35.9%~40.7%（T）、16.4%~20.2%（C）、26.8%~28.9%（A）和14.7%~17.2%（G）,呈明显的AT偏向性。COI基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列比较分析结果显示分别有577和98个变异位点,表明密码子存在简并性。20种溪蟹的线粒体COI基因遗传距离、序列相似性及系统发育进化分析结果均显示,长安龙溪蟹（Longpotamon changanense）与龙溪蟹未定种（Longpotamon sp.）的亲缘关系最近。虽然采用不同方法基于不同数据集构建的系统发育进化树在拓扑结构上有所不同,但所有树型均显示龙溪蟹属（Longpotamon）的小龙溪蟹（L.parvum）并未与该属其他物种聚类在一起,华溪蟹属（Sinolapotamon）、近溪蟹属（Potamiscus）和小石蟹属（Tenuilapotamon）物种也散布在系统发育进化树不同分支中,暗示这些物种在分类鉴定上为非单系群,还需进一步研究确定。【结论】20种溪蟹的线粒体COI基因序列平均种间遗传距离为0.173,均具有区别于其他种类的特异位点,即线粒体COI基因序列可作为溪蟹科物种鉴定的分子标记。