野生和养殖丁肠道微生物菌群的比较分析

鱼类肠道菌群的结构和功能对其生长发育起重要作用。丁■是我国新疆地区特有的经济养殖鱼类，为评估野生丁■和养殖丁■肠道微生物菌群的结构和差异，以野生丁■和养殖丁■作为研究对象，采用Illumina Miseq高通量测序方法对其肠道16S rRNA基因的V3～V4区进行测序，比较两种环境条件下丁■肠道微生物菌群结构的丰度变化和差异。试验结果显示，丁■肠道微生物的优势菌群主要为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门。但在两种环境下，其肠道菌群结构存在明显差异：在门水平下，梭菌门和酸菌门在养殖丁■中的丰度显著低于野生丁■(P<0.05);在属水平下，乳酸杆菌属和不动杆菌属在养殖丁■中的丰度高于野生丁■,而支原体和黄杆菌属则显著低于野生丁■(P<0.01);在种水平下，洛菲不动杆菌在养殖丁■中的含量显著高于野生丁■(P<0.01),而未分类的黄杆菌则显著低于野生丁■(P<0.05)。试验结果表明，由于饲养环境的改变，野生丁■和养殖丁■肠道菌群的组成及丰度出现显著变化。该结果可为后续丁■肠道微生物的研究和养殖管理提供基础数据和参考。     

健康和患病中华鲟皮肤黏膜层微生物菌群结构特征

为探究中华鲟(Acipenser sinensis)皮肤黏膜层微生物菌群结构和其骨板褪色症之间的关系, 本研究通过 Illumina 高通量测序, 分析健康和患病中华鲟背骨板皮肤、躯干部皮肤微生物菌群结构特征。结果显示: 4 种来源皮肤黏膜层共有 3406 个 OTU。与健康组相比, 疾病组背骨板皮肤 OTUs 数量下降 84%, 躯干部皮肤 OTUs 数量下降 55%。在门分类水平, 健康组背骨板皮肤和躯干部皮肤的优势菌门组成较为相似, 均以变形菌门(Proteobacteria)、 厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为主, 三者占比超过 75%; 拟杆菌门在疾病组背骨板皮肤和躯干部皮肤高度富集, 前者相对丰度由 11.15%升高至 67.99%, 后者相对丰度由 20.28%升高至 53.48%。在属分类水平, 黄杆菌属(Flavobacterium)在疾病组背骨板皮肤和躯干部皮肤中相对丰度分别为42.83%和 21.78%, 均高于健康组样品 (4.20%和 16.92%); 金黄杆菌属(Chryseobacterium)在疾病组背骨板皮肤和躯干部皮肤中相对丰度分别为 23.34%和 27.65%, 均高于健康组样品(0.33%和 2.16%)。多样性分析显示, 健康组和疾病组皮肤黏膜层之间的 Chao 指数和 Shannon 指数具有显著差异(P＜0.01)。显著性差异分析显示, 黄杆菌属、金黄杆菌属、食酸菌属(Acidovorax)和氢噬胞菌属(Hydrogenophaga) 4 个菌属在疾病组中显著上调(P＜0.05)。本研究表明, 与健康组相比, 疾病组中华鲟背骨板皮肤和躯干部皮肤 OTUs 数量均明显降低, 丰富度和多样性均显著下降(P＜0.01)。拟杆菌门的黄杆菌属和金黄杆菌属在疾病组皮肤黏膜层高度富集, 可能是此次疾病的主要致病菌。     

尼罗罗非鱼肠道及养殖环境中菌群结构与链球菌病的相关性

为研究尼罗罗非鱼肠道和池塘养殖环境中菌群结构变化与链球菌病暴发的相关性,实验采用16S r DNA高通量测序方法对比分析发病和健康池塘水体、底泥和尼罗罗非鱼肠道菌群的结构特征。结果显示,底泥中微生物多样性最高,水体和肠道中微生物多样性次之;肠道菌群与水体中菌群的相似性较高,而与底泥中菌群相似性较低;发病组的尼罗罗非鱼肠道和池塘底泥中微生物的多样性均低于健康组,而发病组池塘水体中微生物多样性高于健康组。OTU聚类分析发现,发病与健康尼罗罗非鱼肠道微生物差异极显著,大部分健康尼罗罗非鱼肠道微生物样品单独聚为一支。菌群结构组成分析结果表明,虽然发病组和健康组水体或底泥中优势菌群结构组成的差异较小,但在非优势菌群中存在一定差异,发病组水体中变形菌门和梭杆菌门的比例显著高于健康组水体,疣微菌门和浮霉菌门的丰度显著低于健康组水体;发病组池塘底泥中厌氧粘细菌属、甲烷丝菌属和枝芽孢菌属等具有降解有机质和生态修复功能,菌群的丰度显著低于健康组底泥,而具有致病能力的曼氏杆菌属丰度却显著高于健康组底泥。发病组尼罗罗非鱼肠道菌群中链球菌属、分枝杆菌属和曼氏杆菌属等致病菌群的丰度显著高于健康组尼罗罗非鱼肠道,而乳球菌属、鲸杆菌属和红球菌属等益生菌的丰度显著低于健康尼罗罗非鱼肠道。无乳链球菌普遍存在于发病和健康养殖环境,以及尼罗罗非鱼肠道中,无乳链球菌的丰度在发病和健康养殖环境之间无显著差异,但其在发病尼罗罗非鱼肠道中的丰度要显著高于健康组。研究表明,尼罗罗非鱼链球菌病发病池塘水体和底泥中有益菌丰度降低和致病菌丰度的升高反映其养殖环境出现恶化,尼罗罗非鱼链球菌病的暴发与肠道微生态平衡破坏后无乳链球菌丰度增加密切相关,但肠道中无乳链球菌丰度的剧增与养殖水体和底泥中该病原菌的丰度水平之间并无直接关联。     

养殖花鲈（Lateolabrax maculatus）肠道菌群的多样性分析

为探究养殖花鲈(Lateolabrax maculatus)肠道菌群的结构特征,采用Illumina Hiseq2500高通量测序技术,对福建宁德三都澳网箱养殖花鲈的肠道内容物及肠壁菌群16S r DNA V3-V4区进行测序。肠道内容物和肠壁样品分别获得456和293个OTUs(operational taxonomic units),分属22个门120个属。花鲈肠道菌群以厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和梭杆菌门(Fusobacteria)细菌为主要优势菌群,分别占其肠道菌群数量的47.2%、25.8%、14.4%和10.3%。在属分类水平上,发光杆菌属(Photobacterium)、梭菌属(Clostridium)及鲸杆菌属(Cetobacterium)等属细菌是主要类别。对养殖花鲈的肠道内容物与肠壁菌群进行比较分析显示,肠壁菌群多样性略高于肠道内容物。肠道内容物中,发光杆菌属、梭菌属及鲸杆菌属等是主要菌属,其中鲸杆菌属和梭菌属分别占肠道内容物菌群总菌数的17.8%和12.5%,为主要标志性差异种类;在肠壁样品的菌群中,乳球菌属(Lactococcus)、真杆菌属(Eubacterium)、Lachnoclostridium、弓形菌属(Arcobacter)和Flavonifractor为丰度较高的菌属,其中格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)为主要标志性物种,占肠壁菌群总数的5.6%。在花鲈肠壁上定殖着格氏乳球菌(L. garvieae)和美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae subsp. damselae)等条件致病菌,因此,在养殖中需要注重饵料及环境的管理,避免致病菌大量增殖引起暴发性鱼病。     

健康和患病卵形鲳鲹肠道菌群结构的差异

为研究病害发生后卵形鲳鲹肠道菌群结构的差异及其与养殖环境的关系,分析不同样品中的菌群组成和细菌多样性。实验采用Illumina HiSeq高通量测序技术和生物信息学分析手段,分别构建了健康鱼水样、患病鱼水样、健康鱼肠道、患病鱼肠道和饵料颗粒5个样品中菌群的16S rRNA基因测序文库。研究表明,与健康鱼肠道细菌组成相比,患病鱼肠道中螺旋体门相对丰度显著升高,厚壁菌门和拟杆菌门相对丰度显著降低;患病后肠道中的细菌种类仅为健康鱼肠道细菌种类总数的54.94%;健康卵形鲳鲹肠道菌群中有73.46%的可操作分类单元(OTUs)与水体样品中OTUs一致,有70.58%与饲料样品一致,而患病后分别只有17.98%和38.95%的OTUs与水体和饲料样品一致。健康卵形鲳鲹肠道中黑海弧菌的相对丰度为17.19%,患病后该菌的相对丰度大幅提高,达到78.90%;健康鱼肠道中鳆发光杆菌占比54.53%,患病鱼肠道中不含鳆发光杆菌。健康和患病鱼肠道菌群种类组成类似,但存在一定差异,病害的发生会导致肠道细菌多样性显著降低。健康鱼肠道菌群与养殖环境和颗粒饲料中菌群组成关系密切,而患病后鱼肠道细菌多样性受环境中菌群的影响较小。黑海弧菌在患病鱼肠道中的大量增殖可能是引起其患病的重要原因。     

许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道微生物群结构特征

采集常规饲养的健康许氏平鲉1日龄仔鱼,9、20日龄稚鱼,54、95日龄幼鱼,运用Illumina MiSeq PE300平台,对其肠道微生物的16S rDNA V3~V4可变区进行高通量测序,共获得1039个运算分类单位、667个属。在丰度高于1%的菌属水平上,野生鱼肠道菌群丰度的平均值(86%)远高于幼鱼时期的平均值(73.5%)。不动杆菌属为仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道中最优势菌属(丰度为26.2%~45.3%);短芽孢杆菌属次之。结合共有菌属分析获得11个核心菌群,芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、不动杆菌属、根瘤菌属等的丰度随仔鱼、稚鱼、幼鱼生长先升后降,均在54日龄时丰度最高;弧菌属则呈现相反的趋势(0.37%~12.41%),54日龄时丰度最低。仔鱼、稚鱼、幼鱼与野生个体肠道仅有14个共有菌属,短芽孢杆菌属、Massilia的最小丰度值分别是野生个体肠道中最大丰度值的9倍和32倍,差异明显。本研究揭示了许氏平鲉仔鱼、稚鱼、幼鱼肠道菌群结构特征及其发生、发育的过程,为苗种繁育阶段肠道生理健康调控提供理论依据。     

健康和患病凡纳滨对虾幼虾消化道菌群结构的比较

凡纳滨对虾养殖过程中,早期阶段是病害易感阶段,而消化道菌群结构与对虾健康关系密切。因此,探讨幼虾的消化道菌群尤其是弧菌类细菌与对虾发病的关系对病害有效防治具有重要意义。本实验采用Illumina测序研究了凡纳滨对虾健康和患病幼虾的消化道细菌群落结构,并基于纯培养和16S r DNA,rec A和pyr H基因序列比对,分析了幼虾消化道中弧菌的主要种类组成。结果发现,健康幼虾消化道中α-变形菌纲和厚壁菌门丰度较高,而患病幼虾中γ-变形菌纲、拟杆菌门、放线菌门和β-变形菌纲较高,其中放线菌门丰度差异显著。基于科水平的响应比分析,发现患病幼虾消化道中动性球菌科和噬菌弧菌科的丰度显著降低,而弧菌科的丰度显著升高。相似度分析发现,驱动群落变异的OTU主要来源于弧菌属、海洋杆状菌属、冷杆菌属、假交替单胞菌属以及未分类至属的红杆菌科和微杆菌科。健康幼虾消化道弧菌组成以锡那罗亚州弧菌为主,而患病幼虾消化道弧菌组成以坎氏弧菌为主。尽管健康和患病幼虾消化道内细菌群落结构整体差异不显著,但一些重要类群丰度变化显著,其特征与已知的生态功能一致。     

不同养殖模式黄鳝胃肠道微生物群落结构分析

为探究不同养殖模式下黄鳝(Monopterus albus)胃肠道微生物的群落结构，本实验采用16S rRNA高通量测序技术研究虾塘散养、蟹塘散养、网箱投喂鱼浆和网箱投喂水蚯蚓4种养殖模式下黄鳝胃肠道微生物的组成和群落结构。Alpha多样性分析和Venn图结果显示，网箱投喂水蚯蚓组黄鳝胃肠道微生物多样性和丰度均较高，而蟹塘散养组最低。除蟹塘散养组黄鳝肠道的优势菌为变形菌门，其余3种养殖模式黄鳝胃肠道优势菌群均为厚壁菌门，推测黄鳝胃肠道微生物的核心菌群为厚壁菌门。在属水平上，网箱投喂水蚯蚓养殖模式中黄鳝胃的优势菌群为粪杆菌属(Faecalibacterium)与嗜黏蛋白阿克曼菌属(Akkermansia),其余3种养殖模式中黄鳝胃的优势菌群都为韦荣球菌属(Veillonella);而虾塘散养组黄鳝肠道的优势菌群为瘤胃球菌属(Ruminococcus),其余3种养殖模式的优势菌群中都有双歧杆菌属(Bifidobacterium)。结果表明：网箱投喂水蚯蚓组黄鳝胃肠道微生物多样性和丰度均较高，且益生菌群占比高，潜在致病菌较少，是比较健康的养殖模式。     

夏季仿刺参养殖池塘水体菌群地域性特征及其影响因素

2018年8月,在全年不投喂饲料及益生菌且面积约0.1 km~2的泥质底质的辽宁长海、营口,河北乐亭和山东乳山典型岸基半开放仿刺参养殖池塘中,设置4个采样点,采集距水面和离池底各30 cm处水样,利用高通量测序技术和生物信息学分析手段,构建4个地区典型仿刺参养殖池塘水体菌群16S rRNA基因测序文库,解析仿刺参养殖池塘水体菌群地域性差异和共性,并查明影响水体细菌群落构成的主导环境因子。试验结果显示,不同地区仿刺参养殖池塘水体优势菌门为变形菌门和拟杆菌门,二者相对丰度占比68.64%～89.34%。变形菌门均为第一优势菌门,相对丰度占比51.10%～71.98%。在属水平上,不同地区水体优势菌属主要为玫瑰变色菌属、远洋杆菌属、Kiloniella和棕囊藻杆菌属。其中,长海、乐亭和乳山水体第一优势菌属均为玫瑰变色菌属,相对丰度占比分别为18.68%、24.65%和24.46%;营口地区水体第一优势菌属为Kiloniella,相对丰度占比23.07%。仿刺参养殖池塘水体菌群存在显著地域性差异(P0.05)。其中,乐亭与乳山水体菌群结构相似度最高首先聚为一类,其次与长海聚为一类,营口地区则单独聚为一类。营口仿刺参养殖池塘水体差异菌群主要为放线菌门和浮霉菌门细菌。尽管不同地区水体细菌组分比例不同,但共有菌属甚多。环境因子中,影响水体菌群的主导环境因子为化学需氧量和总有机碳,其次为磷酸盐、总磷和温度。本试验结果将为仿刺参养殖池塘水体微生态调控提供参考。     

池塘和工厂化养殖牙鲆肠道菌群结构的比较分析

为研究池塘和工厂化养殖条件下牙鲆肠道菌群结构差异及其与饵料、水环境、底质等的关系,采用MiSeq高通量测序技术和生物信息学分析手段,构建了牙鲆(Paralichthys olivaceus)肠道、养殖水体、饵料和池塘底泥等7个样品的16s rRNA基因测序文库,分析了不同样品中菌群组成和生物多样性。结果表明：池塘养殖牙鲆肠道（B1）中以厚壁菌门（30.49%）、变形菌门（19.16%）和梭杆菌门（11.11%）为主,其中芽孢杆菌属（27.66%）占绝对优势,弧菌属（0.16%）丰度最小;工厂化养殖牙鲆肠道（B5）中以变形菌门（44.31%）、厚壁菌门（11.57%）和放线菌门（4.79%）为主,其中不动杆菌属（10.37%）丰度最大,弧菌属（4.05%）相对B1中丰度较高。牙鲆肠道优势菌群主要与营养代谢调节相关,同时有益微生物和有害微生物也是肠道菌群的重要组成部分。差异性和系统进化分析表明两种养殖条件下牙鲆肠道菌群结构与饵料中菌群关系密切,此外受养殖水环境中菌群影响较大。研究结果将为今后牙鲆养殖专用高效微生态制剂的研制和养殖环境微生态调控技术构建提供理论依据。     

两种疾病发生对养殖半滑舌鳎肠道菌群结构的影响分析

为研究疾病发生情况下鱼类肠道菌群的结构变化,运用高通量测序方法分别对感染腹水病和皮肤溃疡病的工厂化养殖半滑舌鳎病鱼及同一养殖系统中健康鱼的肠道菌群结构进行了对比分析。结果发现,养殖半滑舌鳎肠道中的细菌种类要明显少于环境中的细菌种类,仅为养殖池进水和颗粒饲料中细菌种类总数的14.3%~44.7%。在疾病发生后,病鱼肠道中的细菌种类数量仅是同一养殖系统中健康鱼肠道细菌种类数量的45.8%和64.5%,病鱼肠道中细菌多样性下降非常明显。进一步分析肠道菌群结构的组成发现,虽然发病鱼和健康鱼肠道中超过60%的细菌种类不相同,但优势菌群的结构组成差异不明显,丰度最高的前10种细菌种类基本相同,其比例超过肠道相对总菌量的80%。不同疾病的发生对半滑舌鳎肠道菌群结构的影响也不同,腹水病会造成肠道中优势菌株的种类和相对丰度都发生比较明显的改变,而皮肤溃疡病发生前后肠道菌群结构组成几乎没有变化。研究表明,养殖半滑舌鳎的肠道菌群结构相对比较保守,而且并不是所有的疾病种类都会引起肠道菌群结构发生改变。     

大鲵源致病性弗氏柠檬酸杆菌的分离、鉴定和药物敏感性

为鉴定患病大鲵(Andrias davidianus)病原菌,从大鲵肠、胃、脾脏中分离得到菌株int1705,分离菌株经形态特征观察、生理生化特性测定、16S rRNA和aspC管家基因序列测定及系统发育学分析,鉴定为弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)。经人工感染,结果显示:菌株int1705能使健康大鲵发病并致死,半致死浓度(LD50)为3.16×10 6 CFU/mL,且发病症状与自然发病相似。药敏试验结果显示,菌株int1705对多粘菌素B、头孢他啶、诺氟沙星、氧氟沙星、复方新诺明等10种药物敏感。     

大鲵人工繁殖技术初步研究

利用长200m、宽5．2m、高4．5m的山洞,在6m^2和0．48m^2的养殖池中用石板材和鹅卵石搭设人工洞穴,以人工养殖的Ⅴ-Ⅶ龄的子二代大鲵作为亲体开展人工繁殖研究。亲鲵培育水温19．0～20．5℃,pH7．2—7．3,DO5．8～7．4mg／L,光照〈300Lux;催产选择在7月上旬进行。激素选用LRH-A2＋HCG,剂量LRH—A2 10-20ug／kg＋HCG1000～2000IU／kg,雌雄同剂量。一次性腹腔注射;受精卵孵化温度18～18．5℃,pH7．2～7．3,DO6．0—8．0mg／L,光照〈100Lux。2010年7月催产雌鲵26尾,雄鲵24尾,催产后第4d,4尾雌鲵产卵3800粒,获受精卵962粒,受精率25．32％。受精卵经35—38d的孵化,共孵出稚鲵172尾,孵化率为17．88％。     

应用高通量测序技术分析大菱鲆幼鱼肠道及其养殖环境的微生物群落结构

采用基于Illumina测序平台的高通量测序技术,对大菱鲆(Scophthalmus maximus)幼鱼肠道及其养殖水体、生物饵料中细菌种类及丰度进行研究。测序结果显示,养殖水体、生物饵料和大菱鲆幼鱼肠道等19个样品共获得有效序列547621条,可聚类于3771个可分类操作单元(OTUs),归属于养殖水体、生物饵料、健康幼鱼和发病幼鱼的操作分类单元(OTU)个数分别为3038、1090、87和777,其中,健康幼鱼与生物饵料、健康幼鱼与养殖水体特有的OTU个数分别为57和0,发病幼鱼与生物饵料、发病幼鱼与养殖水体特有的OTU个数分别为481和31。表明幼鱼肠道微生物多样性与生物饵料密切相关。根据细菌注释结果,拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)在大菱鲆幼鱼肠道中占优势地位,其中,健康幼鱼肠道微生物共聚类为8个门,发病幼鱼的肠道微生物可聚类为19个门。与健康幼鱼相比,发病幼鱼肠道门水平上的3种主要优势菌群落结构出现失衡。此外,对各样品中丰度最高的100位OTU分析显示,幼鱼肠道优势菌种类与生物饵料中的优势菌种类密切相关,而每个发病幼鱼肠道优势菌种类具有一定的独立性。本研究旨在为大菱鲆健康养殖和微生态调控提供实验依据。     

大鲵尿液性激素水平季节变化及其与繁殖的关系

2004-2005年检测和分析了大鲵(Andrias davidianus)尿液中睾酮(TT)和雌二醇(E2)水平的季节性变化、性激素水平季节性变化规律及其与繁殖的关系.结果表明,雌二醇含量呈年度周期性变化,表现为生殖季节前逐渐达到顶峰,繁殖期过后逐渐降低至正常值,呈抛物线变化;7月8日达到峰值,最小值出现在3月初.当雌性个体雌二醇水平高于946.45 pg/mL,雄性个体睾酮含量高于0.2954 ng/mL,适时催产可促使雌鲵产卵和雄鲵排精,且精卵质量好;低于此值,一般不能产卵或排精.     

贵定王寨河浮游藻类调查及水质评价

对贵定野生大鲵自然生态保护区内王寨河6个断面不同季节浮游藻类的种类、密度进行了调查,并采用Margalef和Shannon-wiener多样性指数进行了水质评价.结果表明,王寨河春季有浮游藻类5门83种,秋季有4门66种.王寨河水质总体上清洁,有利于大鲵(Andrias davidianus)野生种群的栖息生存.     

大鲵成熟精、卵的形态学观察及受精卵孵化中的形态变化

本文通过连续９年观察中国大鲵成熟精子,连续１０年观察中国大鲵成熟卵子的形态后加以概括描述。正常精子呈尖椒状,全长约１９０μｍ,头部约占全长的２５％,头尾部之间无明显颈部。中国大鲵产出的卵为念珠状长链型带形卵,卵球含三层膜,卵有单胞卵也有多胞卵,卵的形态多样。受精卵孵化过程吸水增大,第五天吸足平衡,吸水率达１８５％;胶带也吸水增大,第四天基本吸足,吸水率达１５０％。     

大鲵引进与地下室人工养殖试验研究

2009年11月山东省成功引进大鲵(Andrias davidianus),开晨了大鲵地下室人工养殖试验.其结果表明:放养1 100尾,平均体重5.43 g、体长8.5 cm,经过2年饲养,平均体重1.146 kg、平均体长50.12 cm,成活率98.7％,总重1 244.6 kg,最大个体为2.3 kg.大鲵在海拔108m地区人工养殖的成功,对野生种群修复、保护及开发将起到积极的重要作用.