奶牛瘤胃上皮细胞分离培养与鉴定

在体外分离培养奶牛瘤胃上皮细胞,可为奶牛瘤胃生理功能和吸收机制研究和永生化奶牛瘤胃上皮细胞奠定基础。通过胰蛋白酶消化法从奶牛瘤胃组织中分离出瘤胃上皮细胞,并通过免疫细胞化学的方法检测细胞角蛋白,CCK-8检测细胞生长曲线,β-半乳糖苷酶染色鉴定细胞的衰老以及细胞染色体核型分析来鉴定瘤胃上皮细胞。结果表明:1)利用胰蛋白酶消化法可以稳定的培养出瘤胃上皮细胞并且能够在体外传代大约5代;2)通过在显微镜下进行细胞形态的观察呈单层"岛屿状";3)在荧光显微镜下细胞角蛋白抗原能够发出绿色荧光;4)奶牛瘤胃上皮细胞传至第5代,β-半乳糖苷酶被染成蓝色,同时,细胞出现衰老和停滞生长;5)染色体核型分析表明奶牛瘤胃上皮细胞的染色体数为60条。研究发现通过酶消化奶牛瘤胃组织能够获得奶牛瘤胃上皮细胞,但只能传至5代。     

山羊小肠上皮细胞分离培养与鉴定

为研究山羊小肠上皮细胞营养吸收调控及其与肠道微生物之间的关系,提供原代细胞培养模型,采用组织块接种来获得山羊小肠上皮细胞,利用有限稀释法来克隆山羊小肠上皮细胞,并通过细胞形态学以及细胞角蛋白18、波形蛋白、肌间线蛋白和细胞生长曲线来鉴定山羊小肠上皮细胞。结果表明:1)采用组织块接种能够分离纯化得到山羊小肠上皮细胞并稳定传至大约10代;2)RT-PCR检测发现山羊小肠上皮细胞不能够表达波形蛋白和肌间线蛋白;3)在正置显微镜下观察到山羊小肠上皮细胞能够产生细胞角蛋白18绿色荧光。研究发现,培养至第8代的山羊小肠上皮细胞仍然保持着上皮细胞的特征,至10代山羊小肠上皮细胞质变大,细胞几乎无法增殖,细胞开始凋亡。综上所述,采用组织块接种能够获得山羊小肠上皮细胞并正常传至第10代,可为研究山羊小肠上皮细胞营养物质吸收和调控机理提供细胞素材。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

[目的]探讨在生化培养箱中进行奶牛乳腺上皮细胞原代培养的可行性。[方法]采用组织块法,在体外进行乳腺上皮细胞的分离培养,探索其在生化培养箱中合适的培养条件。用倒置显微镜观察、细胞爬片吉姆萨染色和角蛋白免疫组织化学染色的方法对培养细胞进行形态学观察和鉴定。[结果]通过倒置显微镜观察发现,上皮细胞呈多角形,长满后呈上皮细胞特有铺路石样。细胞染色可见上皮细胞胞体较大,胞核深蓝色,圆形或椭圆形,核仁清晰可见,一般为2-4个。免疫组化鉴定结果显示,培养的细胞表达上皮细胞特异的角蛋白14和18。[结论]原代奶牛乳腺上皮细胞可以在生化培养箱中成功培养。     

鸽小肠上皮细胞的分离培养与鉴定

本试验旨在建立鸽小肠上皮细胞体外分离培养和鉴定的方法体系,为研究鸽小肠上皮细胞的营养转运吸收、细胞增殖代谢等机制提供原代细胞模型.采用胶原酶消化法和组织块贴壁法分离鸽小肠上皮细胞,并通过相差消化法对其纯化,最后运用免疫荧光分析和基因表达分析鉴定鸽小肠上皮细胞.结果表明,2种方法均可成功分离培养鸽小肠上皮细胞,细胞呈铺路...     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养(英文)

[Objective] To investigate the feasibility of the primary culture of bovine mammary epithelial cells in biochemical incubator. [Method] In vitro, bovine mammary epithelial cells were isolated and cultured by the tissue explant method in order to investigate the optimal culture conditions. The morphology observation and identification of the cultured cells were performed by inverted microscope observation, Giemsa staining and cytokeratin immunohistochemistry. [Result] Observed with inverted microscope, most of the bovine mammary epithelial cells were polygonal and displayed typical slabstone-like appearance. As it can be seen from cell staining results, the cell body was big and the nucleus was stained dark blue and was round or oval in shape, with clearly visible nucleoli, generally 2-4 nucleoli. The tissue-specific expression of cytokeratin 14 and cytokeratin 18 genes in mammary epithelial cells was identified by cytokeratin immunohistochemistry. [Conclusion] Primary bovine mammary epithelial cells were successfully cultured in biochemical incubator.     

仔猪小肠黏膜上皮细胞体外分离培养及鉴定

 【目的】阐明产肠毒素大肠杆菌F18（ETEC F18）引发仔猪腹泻的机理,针对其候选基因FUT1 的CDS区第307位点处的突变（G→A）,建立3个仔猪小肠黏膜上皮细胞系（GG、GA和AA）。【方法】首先以胎鼠和仔猪为试验材料,确定小肠上皮细胞的最佳分离方法。采用XI型胶原酶和I型中性蛋白酶的联酶混合液,将胎鼠小肠组织机械剪碎后用联酶进行消化和直接将联酶灌注到仔猪小肠腔内消化的两种方法进行比较。针对仔猪小肠黏膜上皮细胞体外培养过程中成纤维细胞污染难以消除的问题,本研究采用局部画圈法逐步去除成纤维细胞。最后,用电镜和CK18免疫荧光染色对纯化后的原代仔猪小肠黏膜上皮细胞进行鉴定。【结果】两种小肠上皮细胞分离效率对比表明,后一种消化方式更为有效。进而取出生12 h内未吃初乳的大白仔猪,剖腹剪取其小肠段,使用联酶混合液灌注消化分离得到形态完整、容易贴壁生长的小肠绒毛细胞团。电镜和CK18免疫荧光染色结果均显示,小肠黏膜上皮细胞纯度达90%以上。经纯化处理,最后获得了FUT1基因型为GG和GA的两种小肠黏膜上皮细胞。仔猪原代小肠黏膜上皮细胞培养周期显示,7代前细胞生长状况良好,形态为典型的上皮细胞样,单层细胞呈铺路石排列,培养至第9代,细胞出现生长停滞、胞体空泡化等现象。【结论】最终获得了FUT1基因型为GG和GA的仔猪原代小肠黏膜上皮细胞。建立了仔猪小肠黏膜上皮细胞分离及培养方法,为后续的细胞建系工作奠定了良好的基础。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

1材料与方法 1．1材料 1．1．1乳腺组织。从屠宰场选取健康的泌乳期奶牛,无菌手术切取乳腺实质组织,置于DMEM／F12完全培养液（含10％胎牛血清、100IU／ml青霉素和链霉素）中,尽快运回实验室。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

兔小肠上皮细胞体外分离培养

选用新生未哺乳仔兔,应用胶原酶Ⅳ消化法对小肠上皮进行分离培养,得到兔小肠上皮细胞后,联合应用相差消化法和相差贴壁法对兔小肠上皮细胞进行纯化。通过形态学观察及细胞免疫组织化学方法对所得到的纯化兔小肠上皮细胞进行鉴定。结果表明：应用胶原酶Ⅳ消化法得到的兔小肠上皮细胞生长状况良好,纯化后得到95％以上纯度的兔小肠上皮细胞,纯...     

氟化物对体外培养猪小肠上皮细胞的影响

[目的]研究氟对体外小肠上皮细胞的影响。[方法]以小肠上皮细胞为研究对象,对猪小肠上皮细胞进行分离后,添加2.5、5.0、10.02、0.0μg/ml的氟进行培养,测定小肠上皮细胞的增殖率和碱性磷酸酶的活性。[结果]当氟添加量<10.0μg/ml时,细胞的增殖、碱性磷酸酶活性与对照组之间无显著差异;而高氟组(20.0μg/ml)小肠上皮细胞的增殖、碱性磷酸酶活性则受到显著抑制,并且小肠上皮细胞的形态由多角形变为圆形,细胞核溶解,大部分细胞死亡。[结论]该研究为进一步研究氟对体外小肠上皮细胞的危害机理奠定了基础。     

草鱼肠道粘膜细胞的分离与原代培养

以强化培育后草鱼的肠道粘膜为试验材料,采用不同消化法和离心转速梯度分离肠道粘膜细胞团,分别试验不同培养液与不同CO2浓度组合、胎牛血清浓度及细胞接种浓度时细胞生长效果,并且观察草鱼原代肠道粘膜细胞生长过程,同时采用3种细胞形态观察法、MTT检测法及相关酶活力系统评价细胞培养效果。结果表明:采用机械刮取消化法,分离转速为400 r/min,在使用M199培养液、6%CO2、15%胎牛血清、接种浓度为2×103(个/孔)条件下可批量复制草鱼原代肠道粘膜上皮细胞;细胞增殖过程符合动物原代肠道粘膜上皮细胞生长分化规律,采用荧光倒置显微镜与Giemsa染色法相结合、MTT检测法、AKP酶活力及LDH/MTT OD值可系统评价细胞培养效果。     

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。     

仔猪肠黏膜上皮细胞体外培养及其对小檗碱适应性的研究

为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。     

苜蓿黄酮对脂多糖刺激下乳成分合成相关基因表达的影响

为探索苜蓿黄酮对脂多糖(LPS)刺激下乳成分合成相关基因表达的影响,采用体外细胞培养技术,将奶牛乳腺上皮细胞分成4个组:1)基础培养基(Con);2)基础培养基中加入1μg/mL的LPS(L);3)基础培养基中加入1μg/mL的LPS和75μg/mL苜蓿黄酮(L+F);4)基础培养基中加入75μg/mL苜蓿黄酮(F)。细胞在37℃,5%CO2的培养箱中培养12h后,对其乳成分合成相关基因的表达进行测定。结果表明:1)相对于对照组,L组和L+F组的酪氨酸激酶(JAK2)表达显著降低(P0.01),信号转导子和转录激活子(STAT5)和真核起始因子4E(eIF4E)表达显著升高(P0.05)。L+F组真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4EBP1)的表达显著高于F组(P0.01),核糖体S6蛋白激酶1(S6K1)的表达显著高于L组和对照组(P0.05)。2)F组胆固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)的表达显著低于L组(P0.05),过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)的表达则相反;F组脂肪酸转运蛋白1(FATP1)和脂肪酸转运蛋白4(FATP4)的表达显著低于L和L+F组(P0.01),脂肪酸结合蛋白3(FABP3)和乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)的表达则相反;对照组硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)的表达显著高于其他各组(P0.01)。3)L+F组葡萄糖转运蛋白1(Glut1)(P0.05)、葡萄糖转运蛋白4(Glut4)(P0.05)和葡萄糖转运蛋白8(Glut8)(P0.01)的表达显著高于对照组,F组己糖激酶2(HK2)的表达显著低于L组和L+F组(P0.05),而β-1,4-半乳糖基转移酶(β-1,4-Gal T)的表达最低。因此,在无LPS刺激下,添加苜蓿黄酮可能会抑制乳脂合成;在LPS刺激下,添加苜蓿黄酮可能会促进乳蛋白和乳糖的合成。     

丙酸对山羊小肠上皮细胞糖异生途径关键基因表达的影响

为探究丙酸对山羊小肠上皮细胞(GIEC)糖异生途径关键基因表达是否有影响,试验分为2个部分:第1部分分为4个处理组,分别添加0、0.75、1.50和3.00mmol/L丙酸培养GIEC,6h后收集细胞提取总RNA;第2个部分分为2个处理组,分别添加0和3.00mmol/L丙酸培养GIEC,培养3、6、12和24h时,收集细胞提取总RNA。通过qRT-PCR对糖异生途径关键基因的mRNA表达量进行测定。结果表明,0.75和1.50mmol/L丙酸对PC、FBP1和PGC1A的mRNA表达量无显著影响(P0.05);1.50mmol/L丙酸可显著增加PCK2的mRNA表达量(P0.05);3.00mmol/L丙酸可显著增加PCK2和PGC1A的mRNA表达量(P0.05),还可上调PC和FBP1 mRNA表达量但无差异(P0.05)。与未处理组相比,3.00mmol/L丙酸在6h时可极显著上调PCK2和PGC1A的mRNA表达量(P0.01),还可增加PC和FBP1的mRNA表达量(P0.05);在12～24h对糖异生途径关键基因没有影响(P0.05)。综上,丙酸可以在山羊小肠细胞中诱导糖异生途径关键基因PCK2、PC、FBP1和PGC1A的mRNA表达,并且PCK2在山羊小肠上皮细胞糖异生途径中发挥关键作用。     

11S通过NF-κB信号通路引起猪小肠上皮细胞损伤

通过体外培养猪小肠上皮细胞(IPEC-J2),研究大豆球蛋白(11S)对猪小肠上皮细胞的影响。将IPEC-J2细胞分为6组[A(对照组)、B、C、D、E和F],各组中分别添加0、1、5、10、5、5 mg·mL^-1的11S,并且在E组和F组分别添加1 μmol·L^-1吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC)和1 μmol·mL^-1 Nω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)。分别于8、16、24 h,用CCK-8法检测细胞存活率,用ELISA法检测细胞一氧化氮(NO)、二胺氧化酶(DAO)、5-羟色胺(5-HT)、白细胞介素6(IL-6)和白细胞介素10(IL-10)含量,用western blot法检测细胞p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量,用qPCR法检测细胞NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量。结果表明:11S可以降低猪小肠上皮细胞存活率,添加PDTC和L-NAME可以提高小肠上皮细胞存活率;11S可促进NO、DAO、5-HT和IL-6的分泌,降低IL-10的分泌,增加p-NF-κB p65、iNOS、COX-2的蛋白表达量及NF-κB p65、IKKβ、iNOS、IKKα、COX-2 mRNA的相对表达量,添加PDTC和L-NAME可抑制11S的作用。综上,11S可引起猪小肠上皮细胞损伤,随着11S浓度的增大,损伤程度增加,PDTC和L-NAME可以降低11S对细胞的损伤。     

体外培养的牛乳腺上皮细胞形态研究

通过有效的细胞培养方法获得了牛乳腺上皮细胞系,并系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分裂、分化、凋亡等一系列形态变化。结果发现,原代培养的乳腺上皮细胞大多数呈卵圆形,细胞之间连接成片,单层生长,如鹅卵石铺过路面,乳腺上皮细胞和成纤维细胞混生时分区生长,界线明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状聚集生长,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;在含雌激素的培养液中,细胞出现双核或多核现象,但仍表现一定的接触抑制现象。多次传代后的乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,通过光镜观察,部分细胞仍保持较快的分裂增殖能力;部分细胞渐渐分化,出现长形细胞、三角形细胞。上皮细胞增殖分化可形成圆顶型结构,乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。