甘蔗蔗糖转运蛋白SoSUT5基因克隆、表达及功能鉴定

[目的]克隆甘蔗蔗糖转运蛋白基因SoSUT5,分析其表达特性,并通过转化酵母突变体验证其功能,为研究SUT5基因的功能提供理论依据.[方法]以甘蔗品种桂糖28(GT28)未成熟茎cDNA为模板,采用RT-PCR从甘蔗中克隆SoSUT5基因,并进行生物信息学分析及构建系统发育进化树.采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测SoSUT5基因在甘蔗不同组织的表达情况,同时构建酵母表达载体并转化酵母突变体SUSY7/ura3进行基因功能验证.[结果]克隆获得的SoSUT5基因为1605 bp,编码534个氨基酸,GenBank登录号KF808328.SoSUT5蛋白的分子量和理论等电点(pI)分别为56.40 kD和8.36,具有12个跨膜结构,属于易化扩散载体(MFS)家族成员,也属于蔗糖/H+共转运体家族(GPH)成员.该蛋白具有保守的SUT蛋白功能域,是SUT5亚家族成员.在甘蔗生理成熟期,从成熟茎、花序、成熟芽和根中均能检测到SoSUT5基因表达,以在花序中的表达量最高,根次之,但在+1叶中检测不到.转pDR196空载体的酵母突变体SUSY7/ura3在以蔗糖为唯一碳源的MD培养基上不能生长,但转pDR-SoSUT5重组质粒的酵母突变体SUSY7/ura3能正常生长,说明SoSUT5蛋白具有蔗糖转运活性.[结论]SoSUT5基因编码蛋白具有转运蔗糖的生物学功能,在甘蔗蔗糖运输和积累过程中发挥调控作用.     

甘蔗转化酶抑制子(SoInvInh1)基因克隆和表达分析

采用cDNA末端快速克隆(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,以甘蔗未成熟茎cDNA为模板克隆转化酶抑制子,命名为SoInvInh1,GenBank登录号KF575175。SoInvInh1基因的cDNA序列全长为678bp,3′-UTR长146bp。开放阅读框长531bp,编码176个氨基酸,预测分子质量和等电点分别为18.09ku和8.52。SoInvInh1不含内含子序列。预测该蛋白N端具有1个信号肽和跨膜结构,19—172位氨基酸是PMEI蛋白的保守结构域。不同物种间InvInh蛋白氨基酸序列同源性较低,但都具有4个保守的Cys位点。荧光定量PCR分析表明在甘蔗茎、叶、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh1基因表达。在甘蔗生长的不同时期,SoInvInh1在叶中表达无明显规律。而在工艺成熟期和生理成熟前期SoInvInh1整体上表现为幼茎中基因表达量高,而老茎中基因表达量低,表明茎中该基因可能与酸性转化酶活性相关。     

甘蔗光合系统Ⅰ psaD基因的克隆和表达分析

采用RACE-PCR方法,以甘蔗心叶为材料克隆了甘蔗PSⅠ反应中心亚基Ⅱ基因全长,命名为SopsaD,GenBank登录号JX866950。该基因cDNA序列全长为904bp,编码200个氨基酸多肽,预测其分子质量和等电点分别为21.85ku和10.5,其中N端的1~44aa是叶绿体转运肽序列,62~199aa是保守的Pfam:PasD结构域。SopsaD与玉米(EU953246)、水稻(AY224449)、大麦(M98254)和短柄草(XM003564060)psaD基因核苷酸同源性分别为85%、85%、84%和81%,氨基酸序列的同源性分别为92%、88%、87%和85%。荧光定量PCR表明甘蔗在叶、花序、芽、茎和根中都能检测到SopsaD基因表达,其中在叶中表达量最高,其次是花序中,而在根中的表达量最低。甘蔗在工艺成熟期和生理成熟期SopsaD基因整体上表现为功能叶中基因表达量高,而老叶中基因表达量低,证实该基因参与光合作用反应。     

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因ScTRXh2的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXⅠ类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为ScTRXh2(登录号:KF921298).该基因全长752 bp,开放阅读框长381 bp,5'非翻译区长57 bp,3'非翻译区长314 bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性.实时定量PCR检测显示,该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽.在H2O2和PEG逆境胁迫下,甘蔗ScTRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期(3 h)略微下调,早中期(6 h或12 h)表达量明显上调,中后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达.甘蔗ScTRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期(12 h)表达量显著上调,后期(24、48、72 h)显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与H2O2和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期(3 h)基因表达显著下调.上述结果提示,甘蔗ScTRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异.     

甘蔗可溶性酸性转化酶（SoSAI1）基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因（SoSAI1）全长cDNA序列和5?侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol•L-1 NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5?侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。     

应答非生物胁迫的甘蔗硫氧还蛋白基因 ScTRXh2 的克隆

从甘蔗蔗茎cDNA文库中获得1个TRXI类第3亚组成员的硫氧还蛋白家族基因全长cDNA序列,命名为＆TRXh2（登录号：KF921298）．该基因全长752bp,开放阅读框长381bp,5’非翻译区长57bp,3’非翻译区长314bp,编码126个氨基酸残基,氨基酸序列与拟南芥TRXs具有高度同源性．实时定量PCR检测显示。该基因在甘蔗中为组成型表达,叶片和蔗茎中的表达量显著高于根和芽．在H：02和PEG逆境胁迫下,甘蔗＆TRXh2基因的应答模式基本相同,呈现初期（3h）略微下调,早中期（6h或12h）表达量明显上调,中后期（24、48、72h）显著下调并维持基本稳定的低水平表达．甘蔗＆TRXh2基因对NaCl胁迫的应答较快,虽然也呈现中期（12h）表达量显著上调,后期（24、48、72h）显著下调并维持基本稳定的低水平表达,但表达模式与也02和PEG胁迫应答有明显不同,表现在胁迫初期（3h）基因表达显著下调．上述结果提示,甘蔗Sc—TRXh2基因积极应答非生物逆境H2O2、PEG和NaCl的胁迫,在应答的基因表达谱模式上存在一些差异．     

甘蔗B12D基因全长cDNA克隆与表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)茎全长cDNA文库进行大规模测序,获得了B12D基因的全长cDNA序列,命名为ScB12D(GenBank Accession number:KF714497)。生物信息学分析表明,该基因全长771 bp,编码87氨基酸(ORF,104~367 bp);该基因编码的蛋白无信号肽,为亲水性非分泌型蛋白;有1个B12D家族保守结构域,二级结构为无规则卷曲;基因定位于质膜,参与能量代谢。同时,甘蔗ScB12D基因在不同物种间具有一定的保守性,在近缘植物中具有高度的保守性,与单子叶禾本科植物玉米、粟米、高粱及水稻的同源性超过90%,与双子叶甘薯和山茶的同源性在70%左右。荧光定量PCR表达分析结果表明,甘蔗ScB12D基因在根、蔗芽、茎(包括蔗皮和蔗髓)、叶片和叶鞘等组织中组成型表达,其中在叶鞘和根中表达量较高;在生物胁迫黑穗病胁迫下,该基因的表达量在所有时间段均呈下调趋势;在非生物胁迫时,该基因的表达受NaCl胁迫后表达量最高,在ABA胁迫下表达量次之,推测该基因的表达可能与甘蔗响应生物和非生物胁迫的机制有关。     

甘蔗转化酶抑制子SoInvInh2基因克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗转化酶抑制子(Invertase inhibitor)基因(SoInvInh2)的c DNA全长序列,分析基因表达模式和生物信息学特性,为该基因功能的进一步鉴定提供依据。【方法】基于同源序列克隆InvInh2基因5'序列,采用Tail-PCR技术扩增基因3'序列。采用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位和系统进化等进行分析。采用荧光定量PCR(qRT-PCR)分析SoInv Inh2基因在甘蔗不同生育期的组织表达特性。【结果】从甘蔗GT28幼茎中克隆到的一个新的转化酶抑制子基因,命名为SoInv Inh2,GenBank登录号KF575170。该基因的c DNA序列全长为927 bp,开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸。SoInvInh2基因不含内含子序列。SoInvInh2蛋白有4个不对称的α-螺旋和4个保守的Cys位点,属于InvI/PMEI家族成员。在甘蔗叶、茎、花序和花序轴中都能检测到SoInvInh2基因表达。在甘蔗不同生育期,So Inv Inh2基因在不同成熟度的叶和茎中的表达模式无明显规律。【结论】成功克隆到甘蔗SoInvInh2基因,并进行相关生物信息学分析,为该基因的进一步功能研究奠定了基础。     

甘蔗各家族SPS基因表达特性分析

[目的]通过时空表达特性分析,初步推测甘蔗各家族蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因在甘蔗蔗糖积累途径中的功能,为研究甘蔗各家族sPs基因的生物学功能奠定基础.[方法]采用荧光定量PCR分析甘蔗4个家族SPS基因在高、中、低糖甘蔗品种未成熟叶片、成熟叶片和茎中的时空表达特性.[结果]在甘蔗伸长期、蔗糖积累前期和蔗糖积累后期,SofSPSDⅢ基因在所有甘蔗品种的未成熟叶片、成熟叶片和茎中均高水平稳定表达,相对表达量在5.3~8.1;SofSPSB基因在成熟叶片中几乎不表达,而以茎中表达量最高.在伸长期,SofSPSC和SofSPSA基因表达较强,相对表达量分别为7.3~14.2和1.5~4.4;在蔗糖积累前期,SofSPSC基因表达稍有降低,但仍处于较高水平,相对表达量达为4.6~8.9,而SofSPSA基因表达加强,相对表达量达3.8~6.9;在蔗糖积累后期,SofSPSC基因在成熟叶片中的表达量比蔗糖积累前期下降4.0~7.2倍,且均比未成熟叶和茎中下降约6.0倍,而SofSPSA基因在不同组织中的表达量比蔗糖积累前期下降1.8~5.7倍.各家族SPS基因在不同糖分甘蔗品种间的表达趋势一致.[结论]甘蔗D家族SPS基因维持甘蔗蔗 糖合成的基本功能,通过调控C、A家族SPS基因的表达来调控蔗糖合成的强度,B家族SPS基因不参与甘蔗源叶中蔗糖合成而参与蔗糖的积累与利用.     

杉木磷转运蛋白ClPht1;2基因克隆与表达特性分析

磷酸转运蛋白PHT1家族是介导植物磷素吸收与转运分配的重要基因家族。从第3代杉木优良无性系洋061中克隆获得1个杉木磷转运蛋白ClPht1;2,并对不同程度磷胁迫下ClPht1;2的时空表达进行分析,为了解杉木磷转运蛋白基因结构和功能表达奠定基础。以转录组测序获得的ClPht1;2核心序列为基础,以杉木洋061无性系根系cDNA克隆为模板,利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆目的基因的全长,采用实时荧光定量PCR技术,检测了杉木洋061无性系在不同组织中ClPht1;2的表达,以及磷饥饿诱导3、10、25 d下ClPht1;2在根中的表达量变化。克隆得到1个杉木PHT1家族基因ClPht1;2(GeneBank登录号:MK450598)。ClPht1;2编码氨基酸序列与日本柳杉磷转运蛋白家族基因编码氨基酸序列相似性为93%,与马尾松、油茶、毛果杨等植物磷转运蛋白家族基因的编码氨基酸序列比对,结果相似性均72%。ClPht1;2基因序列编码区长1 565 bp,编码511个氨基酸,蛋白理论分子量60.024 ku,为疏水蛋白,不具有信号肽,潜在磷酸化位点42个。ClPht1;2所编码蛋白质由12个跨膜结构组成,其中11个为确定跨膜域,多肽链中α螺旋占42.65%,无规则卷曲占42.11%,延伸链占15.25%。ClPht1;2在杉木洋061无性系的根、茎、叶中均有表达,在叶片中的表达量最高,在根中的表达量最低。与正常磷供应相比,根系ClPht1;2的表达水平在低磷胁迫10 d时显著增加,到25 d时下降至正常磷供应时的表达水平;ClPht1;2在无磷胁迫处理3 d时表达量降低,在10 d时表达量显著提高,在25 d时表达量又低于正常供磷水平。ClPht1;2基因具有PHT1基因家族特征结构,在杉木不同组织中均有表达,在杉木根中的表达受低磷胁迫诱导,在叶中的表达量受低磷胁迫诱导不明显,可能为杉木体内低亲和的磷转运蛋白,参与杉木地上部和根中磷的运输和分配。     

青花菜P450CYP79F1全长克隆、表达及其与不同器官中莱菔硫烷含量的相关性分析

【目的】克隆青花菜细胞色素家族P450CYP79F1,分析其序列特征,阐明其在不同发育时期器官中的表达情况及其与莱菔硫烷含量的关系,为进一步揭示莱菔硫烷合成机理提供科学依据,为青花菜品种改良和新品种选育奠定基础。【方法】通过5′和3ˊ端RACE克隆技术获得青花菜CYP79F1全长序列,利用DNAMAN 6.0进行基因拼接、氨基酸序列分析和蛋白二级结构预测,结合在线分析程序和软件进行基因和编码蛋白生物信息学分析;利用荧光定量PCR技术研究CYP79F1在不同发育器官中的表达情况;结合HPLC方法测定各相应时期器官中莱菔硫烷含量,包括青花菜发育时期的根、茎、叶,成熟花球,抽薹期花蕾（顶端蕾、成熟蕾、开花前1 d的蕾和花）和种子;对CYP79F1表达量与和莱菔硫烷含量进行相关性分析。【结果】获得了CYP79F1全长序列,GenBank登录号为MG012890,该基因全长2 014 bp,包含一个1 620 bp的开放读码框（ORF）,编码540个氨基酸;编码的蛋白与甘蓝、白菜、芥蓝和油菜等同源蛋白的相似性均在95%以上;生物信息学分析表明该基因编码的酶蛋白有2个信号肽和2个跨膜结构域,为亲水性稳定蛋白,Wolf Psort预测其亚细胞定位于细胞质中;CYP79F1在根和茎中的表达量较高,叶中表达量最低,在花器官发育时期,自顶端蕾到花发育过程中呈现逐渐降低的表达趋势,种子中该基因表达量与花处于同一水平。Pearson相关性分析显示,青花菜发育时期的根、茎、叶、成熟花球、抽薹期花蕾和种子中莱菔硫烷含量与CYP79F1表达量无显著相关关系,但抽薹期花蕾自顶端花蕾到花中莱菔硫烷生成量与CYP79F1表达量呈显著正相关关系（R=0.96,P<0.05）,CYP79F1在调控莱菔硫烷的生成方面起重要作用,尤其是在生殖器官花蕾的发育过程中,能够显著上调莱菔硫烷的生成量。【结论】CYP79F1在青花菜不同发育器官中对莱菔硫烷的生成发挥着重要调控作用,可能与青花菜不同器官中莱菔硫烷含量多样性密切相关。     

花生长链酰基辅酶A合成酶6基因(LACS6)的克隆、鉴定与组织表达

长链酰基辅酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase:LACS)是油脂代谢的重要催化酶。为揭示花生脂肪酸代谢机理,采用RT-PCR技术,首次从花生Arachis hypogaea L.克隆到LACS6(GenBank登录号:KU301860),分析该基因的结构组成,预测编码氨基酸与其他植物的同源性,采用Real-Time PCR技术对LACS6的组织表达进行研究。结果显示,花生LACS6基因全长2 116bp,包含2 088bp的ORF,编码695个氨基酸,有23个外显子和22个内含子。氨基酸序列比对显示花生LACS6有真核生物酰基辅酶A合成酶保守结构域,并含有保守的激活位点和绑定位点。同源性分析发现花生LACS6与鹰嘴豆、绿豆、大豆、梅等13种物种的氨基酸一致性在79%~87%,进化树分析显示,花生LACS6与鹰嘴豆等豆科植物亲缘较近。实时荧光PCR分析表明,花生LACS6在花生根、茎、叶、子房柄、仁和花等组织均有表达,且差异明显。子房柄和花的表达量极高,与根、茎、叶和仁等组织有极显著差异,花生LACS6组织的表达量大小排序为花子房柄叶仁茎根。本研究结果为揭示花生脂肪酸代谢和品质改良提供理论依据。     

施肥量与种植密度对桂糖29号产量及构成因素的影响

[目的]确定甘蔗新品种“桂糖29号”最佳施肥量与种植密度,为生产上推广种植该品种提供依据.[方法]采用施肥量与种植密度两因素裂区试验,施肥量为主区,设3个施用复合肥水平,分别为2250、3750、5250 kg/ha,种植密度为副区,设7.5、9.0、10.5、12.0万芽/ha 4个水平,调查各处理甘蔗总苗数、有效茎数、株高、茎径、蔗糖分、产量等性状,分析不同施肥量与种植密度对产量及构成因素的影响.[结果]施肥量2250 kg/ha、种植密度9.0万芽/ha处理的产量最高,为95.34 t/ha;施肥量3750 kg/ha、密度7.5万芽/ha处理的株高最高,为209 cm,显著高于施肥量5250 kg/ha、密度10.5万芽/ha处理(193 cm);各处理间产量、分蘖率、茎径、蔗糖分差异均不显著;产量与单位面积内有效茎数呈正相关.[结论]桂糖29号适宜施肥量为N 260 kg/ha、P2O5 130 kg/ha、K2O 150 kg/ha(N∶P2O5∶K2O=12∶6∶7),最适种植密度为9.0万芽/ha.     

杉木蔗糖转运蛋白SUT基因的克隆和功能分析

蔗糖转运蛋白又称蔗糖-质子共转运蛋白,简称SUT(sucrose transporter)或者SUC(sucrose carriers),主要担负植物光合产物——蔗糖的跨膜运输与分配调控,在植物体内完成使蔗糖从“源”到“库”的运输。采用CTAB法提取杉木总RNA,通过RT-PCR得到cDNA,设计基因特异性引物,从1年生无性系杉木幼苗嫩叶中克隆SUT基因,并利用生物信息学方法分析SUT的基本结构、进化关系、理化性质。结果表明,在电泳图上总RNA的结构完整,28 S的亮度约为18 S的2倍;A260/A280为2.20,A260/A230为2.31;杉木SUT基因编码区全长为1 782 bp,共编码593个氨基酸,是具有SUT基因家族的典型12个跨膜区;通过系统进化树的分析发现,杉木SUT与无油樟SUT的亲缘性较高,SUT蛋白属于疏水性蛋白。     

甘蔗茎分枝：稀有的形态分离

虽然在甘蔗同节上出现多芽现象已被报道,但是却未曾发现同节多芽能独立生长成蔗茎的现象。文章阐述了2008～2009年度在甘蔗品种CoS 96268宿根蔗大田观察到的一株甘蔗植株上发生的独特的形态分离现象。在该株甘蔗地上部的第7、8节上均有2个芽,但第8节出现溢痕,将该节间分成不等的两部分;该分离部分在第9节间更为明显,并独立生长成两条蔗茎（分枝）,每条蔗茎均具有正常的节间形态。     

甘蔗脱毒健康种苗蔗糖磷酸合成酶基因差异表达分析

[目的]探究甘蔗脱毒健康种苗中蔗糖磷酸合成酶(SPS)基因表达对产量和糖分积累影响的作用机理,为提高甘蔗产量和蔗糖含量提供理论参考.[方法]以甘蔗品种新台糖22号的脱毒健康种苗和未脱毒种苗(CK)为供试材料,分别在苗期、分蘖期、拔节期和成熟期进行混合取样,包括未成熟叶、成熟叶、幼茎和成熟茎,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测分析对不同类型SPS基因(SPSA、SPSB、SPSC、SPSD1和SPSD2)在不同生长时期不同组织中的表达情况.[结果]不同类型SPS基因在甘蔗脱毒健康种苗不同部位均有表达,SPSD1和SPSD2基因在未成熟叶和成熟叶中表达量差异明显,且与CK间也存在明显差异,SPSA、SPSB、SPSD1和SPSD2基因在脱毒健康种苗1~3茎节中的表达量高于CK.在拔节期10~23茎节中,SPSA基因在脱毒健康种苗中的表达量较CK低,SPSB基因的表达量较CK高,SPSD1和SPSD2基因的表达量与CK无明显差异.在成熟期10~37茎节中,SPSB基因在脱毒健康种苗中的表达量较CK低,SPSA、SPSD1和SPSD2基因的表达量与CK无明显差异.总体上,随茎秆节间成熟度的增加,SPSA、SPSB、SPSD1和SPSD2基因在脱毒健康种苗中的表达量与CK差异逐渐减小.[结论]不同类型SPS基因在甘蔗脱毒健康种苗不同生长时期不同组织中均差异表达,推测甘蔗脱毒处理能促进叶片和未成熟茎节中SPS基因的表达,有利于提高甘蔗产量和蔗糖含量.     

滞绿突变对大豆叶片蔗糖代谢相关基因表达的影响

为研究大豆滞绿突变对叶片衰老过程中蔗糖代谢相关基因表达产生的影响，以晋大滞绿1号及其亲本晋大74号为试验材料，测定了大豆开花后至成熟期间叶片可溶性糖含量的变化趋势，并对比了不同基因型大豆品种叶片衰老过程中蔗糖代谢相关基因的表达差异。结果表明:1)花后至成熟期间，2个供试大豆品种可溶性总糖含量均呈波动升高然后降低的变化趋势。花后14至42天，晋大滞绿1号可溶性总糖含量高于晋大74号；2)花后29至42天，晋大滞绿1号蔗糖磷酸合成酶基因SPS4，转化酶基因CInv、CWInv2以及蔗糖合酶基因SS1、SS2-2表达水平显著高于非滞绿品种晋大74号；己糖激酶和果糖激酶基因Hxk和Frk表达量也高于非滞绿品种晋大74号；3)除 SUT4-1外，其余6个蔗糖转运体基因SUTs的表达模式具有明显的品种特异性。花后29至42天，晋大滞绿1号叶片SUTs表达水平较高。综上，滞绿突变对于大豆蔗糖代谢相关基因的表达产生了明显的影响，特别是在鼓粒初期和中期等大豆籽粒形成的关键时期，滞绿品种晋大滞绿1号蔗糖代谢相关基因的表达更加活跃。