副猪嗜血杆菌毒力与非毒力菌株菌体蛋白的比较蛋白质组学分析

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是猪群上呼吸道的一种共栖菌群,在一定的条件下能侵入机体并导致严重的全身性疾病,区分出正常栖生菌株和致病性菌株是确诊该病的关键.为了筛选副猪嗜血杆菌毒力株与非毒力株之间的差异蛋白,本研究通过比较蛋白质组学分析临床分离的毒力菌株14A7-2和非毒力菌株20A3-2之间2-DE图谱的差异,提取两个菌株的菌体蛋白进行双向电泳分离,Imagemaster 2D Platinum 7.0软件分析处理凝胶图像,MALDI-TOF/MS鉴定差异蛋白.在副猪嗜血杆菌毒力菌株中检测到596±10个蛋白质点而在非毒力菌株中检测到568±10个蛋白点,其中表达量差异达5倍以上及毒力菌株或非毒力菌株特有的蛋白点共有80个.选取毒力菌株或非毒力菌株特有的44个差异蛋白点进行质谱鉴定,成功鉴定42个蛋白点,对应37种蛋白.其中,毒力菌株特有蛋白27种,非毒力菌株特有蛋白5种,在毒力菌株特有蛋白中鉴定出潜在毒力因子铁摄取调节蛋白、触发因子、3-脱氢奎尼酸脱水酶等.研究结果为进一步研究副猪嗜血杆菌的毒力因子和致病机理以及鉴别诊断不同毒力株新技术提供新信息.     

广东地区副猪嗜血杆菌KRG血清分型及基因分型多态性分析

本研究对保存的2007～2008年广东地区发病猪群中分离的48株副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)进行了分析.用琼脂扩散进行血清分型,结果表明48株临床分离菌株鉴定出7个血清型,其中以5型为主,占总菌株的23.68%.采用肠杆菌基因间重复序列-PCR(Enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR)法进行基因分型分析,结果显示,48株不同来源副猪嗜血杆菌菌株基因型呈现多态性分布;分析得到31个基因型PHYLIP-3.68软件对31个基因型的电泳图谱进行基因分型及遗传关系的分析,结果得到8个群,其中B为优势群,占总菌株数的66.67%.表明广东地区的副猪嗜血杆菌的基因型和血清型十分丰富,ERIC-PCR技术可成为其分子流行病学研究的有效手段.     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失毒素1激活基因C(ApxIC)同时嵌合副猪嗜血杆菌外膜蛋白P2基因(ompP2)复合突变株的构建

猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)以及副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是引起猪发病的2种病菌。本研究以APP血清5型分离株(SW1)为基础材料,通过构建重组转移载体pBOSKΔIC-1和pBOSKΔIC/ompP2,构成卡那霉素抗性基因(Kanr)和枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)的果聚蔗糖酶基因(sacB)的正负双向筛选表达盒,并筛选获得SW1株缺失毒素I的激活基因C(ApxIC),同时嵌合Hps外膜蛋白P2基因(ompP2)的复合突变株SW1ΔApxIC/ompP2。该突变株经鉴定,与SW1亲本株相比,其缺失了大小为475bp的apxIC基因,同时嵌合有大小为1107bp的Hps ompP2基因,其基本生长特性与亲本株(SW1)没有显著区别;同时在体外,连续传代10代之后缺失的apxIC基因不会发生回复突变,嵌入的ompP2基因仍能够稳定遗传。本研究成功构建了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌缺失apxIC基因并嵌合有Hps ompP2基因复合突变株,为今后研究APP和Hps新型二联疫苗打下基础。     

副猪嗜血杆菌CDT毒素的生物学功能分析

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)是一种常见的猪(Susscrofa domestica)致病菌,其细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)被认为是一种重要的毒力因子,为进一步明确CDT的一些生物学及免疫学特性,本研究经体外组装获得了高纯度的CDT三聚体完整毒素,研究三聚体蛋白对Marc145及仔猪外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBLC)的毒性作用,明确CDT三个亚基的特异性抗体对其细胞毒性的阻断作用.原核表达的3个CDT亚基经过共折叠形成了稳定的三聚体蛋白,能诱导Marc 145细胞产生典型的细胞病变.CdtB及CdtC的兔抗血清对CDT完整毒素具有中和作用,且CdtC的兔抗血清可以更有效地阻断CDT的细胞毒性作用,最大中和效价为1:16,而CdtA亚基的兔抗血清无中和作用.CDT可以抑制丝裂原活化的仔猪PBLC增殖作用.致病菌株及非致病菌株分泌蛋白中CDT的滴度一致,均为l:512.本研究结果表明,副猪嗜血杆菌CDT具有明显的免疫抑制作用,可能对于该菌在宿主体内定殖以及引起宿主系统感染至关重要,但并非造成不同菌株致病力显著差异的原因.本研究为揭示副猪嗜血杆菌的致病机理提供了重要信息.     

水稻钙依赖型蛋白激酶0sCPK9基因RNAi表达载体的构建及遗传转化

水稻钙依赖型蛋白激酶（CDPKs）是一个响应逆境胁迫并在植物发育过程中起重要作用的蛋白激酶。我们采用RT—PCR从水稻品种日本晴（Oryza sativa L．CV．Nipponbare）中克隆了OsCPK9基因靠近翻译起始位点下游的一段280bp的特异基因片段。将该片段以正、反向分别连接到来源于小麦TAK14基因的548bp内含子片段（NCBIaccessionnumber：AF325198）两侧,从而获得pSK．OsCPK9-RNAi的中间表达载体。进而将其克隆到植物双元表达载体pCAMBIA1301中,构建shRNAi表达载体pCAMBIA．05CPK9一RNAi。经酶切和测序鉴定正确后,利用农杆菌介导转化水稻。通过抗性筛选和标记基因hyg和gus进行PCR鉴定,筛选到20株转基因水稻植株,实时荧光定量PCR分析显示,部分转基因植株OsCPK9的表达受到显著抑制。     

猪APOA5和APOC3基因mRNA的表达差异及与肌内脂肪沉积的相关性分析

为了探究载脂蛋白A5（apolipoprotein A5,APOA5）基因和载脂蛋白C3（apolipoprotein C3,APOC3）基因组织表达差异及其与肌内脂肪（intramuscular fat,IMF）沉积的相关性,本研究利用荧光定量PCR方法分析APOA5和APOC3基因mRNA在可乐猪和江口萝卜猪7个组织中的相对表达量及其与IMF沉积的相关性。研究结果表明：APOA5和APOC3基因在可乐猪和江口萝卜猪的7个组织中均有不同程度表达,在肝脏中表达量最高,在皮下脂肪和背最长肌中表达量次之;APOA5基因在可乐猪多数组织中的表达量显著低于江口萝卜猪（p〈0.05）,而APOC3基因未呈现类似规律性;可乐猪中,除心脏外,其它组织均表现为APOC3基因mRNA表达量高于APOA5,江口萝卜猪心脏、肝脏、脾脏、小肠和背最长肌中同样呈现上述表达差异。相关及回归分析表明,IMF沉积量与可乐猪APOC3 mRNA表达丰度呈线性正相关（p〈0.05）。根据研究结果,可以推测APOA5和APOC3基因与IMF沉积有一定关联性。     

阿蒂擎天乙烯利催花条件下抑制差减文库构建与分析

本研究以阿蒂擎天(Cuzmania Attila)植株为材料,利用400μL/L 乙烯利灌心,处理0、1 h、6 h和24 h,分别提取总RNA,纯化获得mRNA,以处理0 h的材料为驱动,运用抑制差减杂交技术进行正向差减杂交,获得3个差异表达基因文库.随机挑取3个文库中的1063个白斑,利用菌落PCR方法,筛选到990个阳性克隆,全部进行了序列测定与分析,结果表明,其中有518个基因序列,205个片段与GenBank中已知基因高度同源,313个片段未发现同源基因.利用地高辛标记对部分序列进行反向Northern斑点杂交分析,发现乙烯处理1~6h,诱导表达的基因数量最多     

牛乳铁蛋白对断奶仔猪抗菌肽PMAP-37 mRNA 表达的影响

本研究通过体内试验（饲养试验）和体外试验探讨了牛乳铁蛋白（bLF）对抗菌肽PMAP-37 基因表达的影响。在饲养试验中，72 头36 日龄杜长嘉(♂杜洛克×♀长嘉) 断奶仔猪, 按体重相近原则随机分成3 个处理组, 每个组设3 个重复, 每个重复8 头猪(公母各半)。对照组(处理1) 饲喂不添加bLF 的饲粮, 处理2、处理3 分别饲喂添加含0.125% bLF 和0.25% bLF 的饲粮。在体外实验中，分离培养猪骨髓细胞后，添加不同浓度的bLF（10、100、1000 µg/ml）分别培养3h 和6h，每个处理组3个重复，对照组用培养液替代。根据已报道的猪抗菌肽PMAP-37 和看家基因18S rRNA基因序列, 分别设计PMAP-37 和18S rRNA 的引物, 探讨了PCR 体系中适宜的MgCl2 浓度和循环次数。以此构建一优化的半定量RT-PCR 法。以18S rRNA 为内标，研究日粮中添加不同浓度bLF 和骨髓细胞中添加不同浓度bLF 对仔猪抗菌肽PMAP-37 基因表达的影响。结果显示，与对照组相比，日粮中添加0.125% bLF和0.25% bLF组分别使PMAP-37 基因的表达提高了109.62%（P<0.01）和69.23%（P<0.05）；在骨髓细胞中分别添加10、100、1000 µg/mL bLF在3h 和6h 诱导后对PMAP-37 基因的表达有所提高，但统计结果差异不显著。以上结果表明，bLF在体内和体外对抗菌肽PMAP-37基因表达均有影响。     

大梅与梅山猪背最长肌正反消减文库的构建及序列分析

为从基因差异表达的角度研究杂种优势的分子机理,构建了差减效率均为210倍的大梅与梅山猪背最长肌正反消减文库。在大梅(被消减)-梅山库中挑选了610个有效克隆,经斑点杂交筛选出48个阳性克隆,测序后经Blastn网上比对揭示了37个基因,其中28个EST是已报道基因的cDNA片段,9个在NCBI数据库中没有同源序列。在梅山(被消减)-大梅挑选了580个有效克隆,经斑点杂交筛选出45个阳性克隆,测序后经Blastn网上比对揭示了34个基因,其中26个EST是已报道基因的cDNA片段,8个在NCBI数据库中没有同源序列。     

根癌农杆菌介导的向日葵遗传转化体系的建立

采用携带gus和hpt基因双元表达载体pCAMBIA1301的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105对向日葵（Helianthus annuus）品种新葵杂6号的茎尖分生组织进行遗传转化,以共培养后7 d外植体的gus基因纯合表达频率为指标测定转化率.结果表明,潮霉素适宜的筛选浓度为10mg/L,根癌农杆菌侵染浓度OD600=0.8,果胶酶（0.05%）与纤维素酶（0.1%）共同消化外植体30 min,共培养温度24℃,共培养培养基中添加乙酰丁香酮（ACS）100μmol/L,向日葵茎尖gus基因纯合表达率高达32.8%.对抗性苗进行PCR和Southern blot检测,初步证明T-DNA上的hpt基因已整合向日葵的基因组中.     

干旱胁迫下新源1号新疆野苹果抑制性差减文库的构建与初步分析

为分离和鉴定新疆野苹果(Malus sieversii Roem.)根组织干旱胁迫条件下差异表达的基因,以苗龄为3个月的新源1号新疆野苹果水培苗为材料,应用20%PEG 6000溶液处理模拟干旱胁迫,利用抑制性差减杂交(SSH)的方法构建了新疆野苹果根组织干旱胁迫诱导表达差减文库(正库)和抑制表达差减文库(反库).正库和反库随机各挑菌500个,菌落PCR显示插入片段在250~1000 bp之间.测序鉴定后共得到268个有效UniESTs.经Blastx和Blastn等生物信息学方法分析表明全部的UniESTs按可能的生物学功能可被分为16个大类,包括新陈代谢、能量、转录、蛋白质合成、蛋白质修饰降解、DNA加工、细胞信号转导等.     

DIG和碱性磷酸酶标记cDNA探针检测番木瓜PRSV的比较

利用地高辛(DIG)标记和碱性磷酸酶直接标记的cDNA探针核酸分子杂交及RT－PCR方法对番木瓜环斑病毒(PRSV)进行了检测。根据Genebank发表的PRSV中国Sm株系的外壳蛋白基因序列，设计特异引物，以美中红（Carica papaya L. cv. Meizhonghong ）带病样品的RNA为模板进行RT-PCR扩增反应,将其目的cDNA片段克隆到pGEM-T easy 质粒载体上，并测序。以重组质粒作模板，用PCR－DIG标记方法制备cDNA探针，另一种非放射性探针是经凝胶电泳分离、纯化cDNA片段，用碱性磷酸酶直接进行标记。结果表明，(1)美中红No.2序列与中国优势株系Sm的同源性为94.7%；(2) DIG标记的三种cDNA探针（861bp，455bp和215bp）对样品的总RNA检测结果是一致的, 且861bp的探针杂交斑点最为清晰，上述核酸杂交结果与RT－PCR检测结果相符, 核酸分子杂交检测的灵敏度和特异性能满足常规检测的需要；(3)碱性磷酸酶直接标记861bp的cDNA探针可进行PRSV的斑点杂交检测，而455bp的cDNA片段用碱性磷酸酶直接标记时，不能获得有效的杂交结果；(4)本试验还用DIG标记探针对叶脉进行了印迹杂交检测,结果与RT－PCR检测结果相符。     

低温胁迫下高羊茅抑制消减文库的构建与分析

采用抑制消减杂交(SSH)技术构建了高羊茅"猎狗5号"低温下的正向差减cDNA文库,并从基因表达水平研究了低温诱导对高羊茅抗寒性的影响.通过Reversenorthern杂交法筛选,挑选出36个低温处理下差异表达基因,并对这些基因进行测序.将测序结果在基因组数据库(NCBI)中进行检索比对,最后获得34个差异表达的基因,其中33个基因功能已知,主要与植物信号转导、光合作用、糖代谢、物质运输以及抗逆性相关.     

一个水稻与稻瘟病毒菌（Magnaporthe grisea）互作相关新基因的克隆

以水稻抗瘟性近等基因系H7R和H7S为材料，采用PCR－差别筛选（PCR－based differential screening）的方法分离和克隆了一个受稻瘟病菌诱导表达的基因，RIM9b。Northern杂交显示该克隆为受稻瘟病菌诱导的早期反应基因（片段）。其转录丰度在诱导12h达到最高峰。Southern杂交结果表明该基因以单拷贝存在于水稻基因组中。序列分析表明克隆包含一个558bp的开放阅读框，其序列与GenBank中数据无同源性。     

地高辛(DIG)和碱性磷酸酶标记cDNA探针检测PRSV

根据GenBank发表的PRSV(番木瓜环斑病毒)中国Sm株系的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,以美中红(Caricapapaya L.cv.Meizhonghong)带病样品的RNA为模板进行RT-PCR扩增,将其目的cDNA片段克隆到pGEM-Teasy质粒载体上。以重组质粒作模板,用PCR-DIG标记方法制备cDNA探针,另一种非放射性探针是经凝胶电泳分离、纯化cDNA片段,用碱性磷酸酶直接进行标记。利用地高辛(DIG)标记和碱性磷酸酶直接标记的cDNA探针核酸分子杂交及RT-PCR方法对PRSV进行了检测。结果表明,(1)测序结果表明美中红No.2序列与中国优势株系Sm的同源性为94.7%;(2)DIG标记的3种cDNA探针(861,455和215bp)对样品的总RNA检测结果一致,且861bp的探针杂交斑点最为清晰,上述核酸杂交结果与RT-PCR检测结果相符,核酸分子杂交检测的灵敏度和特异性能满足常规检测的需要;(3)碱性磷酸酶直接标记861bp的cDNA探针可进行PRSV的斑点杂交检测,可获得有效的杂交结果;(4)DIG标记探针对叶脉进行了印迹杂交检测,结果与RT-PCR检测结果相符。     

西农萨能奶山羊gBTN1A1基因的筛选、克隆及序列分析

利用抑制消减杂交技术研究同一只西农萨能奶山羊泌乳中期和末期的乳腺组织差异表达基因,以泌乳中期乳腺cD-NA为测试组,末期乳腺cDNA为驱动组,构建消减文库,得到山羊(Capra hircus)嗜乳脂蛋白基因的部分序列。根据牛(Bos)和绵羊(Ovisaries L.)基因组序列进行电子拼接,并设计引物,得到山羊嗜乳脂蛋白基因的CDs区全序列,应用RT-PCR技术从山羊乳腺组织总RNA中扩增克隆了山羊嗜乳脂蛋白基因CDs区,命名为gBTN1A1,并登录GenBank(EF102891)。gBTN1A1基因开放读码框由1581个碱基组成,编码526个氨基酸,前26个氨基酸为推定的信号肽区域。gBTN1A1基因核苷酸序列与牛(NM-174508)、人(NM-001732)和鼠(AK145168)的同源性分别为97%、88%和84%,氨基酸序列的同源性分别为96%、84%和70%。其二级结构、跨膜区域及信号肽分析均与牛、人和鼠的BTN1A1基因相似。     

温度胁迫对幼体大海马基因转录表达的影响

为探究大海马幼体在高温和低温胁迫条件下基因表达水平的变化规律,采用Illumina平台的PE150测序功能对大海马幼体肝脏进行了转录组测序。对照组、高温胁迫组和低温胁迫组测序数据组装后获得22 513个单基因簇(Unigene),N50为2 223 bp,平均长度为1 122.71 bp。与对照组相比,高温胁迫组共获得14 009个差异表达基因,其中5 543个差异表达基因上调,8 466个差异表达基因下调;低温胁迫组共获得20 030个差异基因,14 016个差异表达基因上调,6 014个差异表达基因下调。差异表达基因经KEGG数据库富集发现,高/低温胁迫均导致大海马体内抗氧化途径相关基因表达(HSP70、HSP90、SOD等)发生显著改变;另外,高温胁迫还造成大海马免疫系统相关基因(PIK3R、Akt、IL-10、TLR等)以及细胞凋亡相关基因(CYCS、CASP9、CASP3等)表达显著改变;低温胁迫造成DNA损伤修复(MSH、DDB2、XRCC2、RAD52、Ogg1、PMS2等)、脂肪酸代谢(StARD7、ApoA4、CYP51、Fadsd6等)和细胞凋亡(P21、P53、BAX等)相关基因显著上调。选择HSP70、Fadsd 6与IL-10等13个差异基因验证,RT-qPCR结果与RNA-Seq测序结果基本一致。本研究结果为深入探究大海马温度应激的调控机制奠定了一定的理论基础,而且有助于预防极端温度对大海马造成损伤。     

Evaluation of Wheat Polyphenol Oxidase Genes

Polyphenol oxidases (PPOs) present in mature wheat (Triticum aestivum L.) kernels have been implicated in the undesirable darkening of cereal products such as Asian noodles. To accelerate the functional characterization of wheat PPOs and allow the identification of those PPO genes that are primarily involved in food biochemistry, several basic local alignment search tool (BLAST) searches of expressed sequence tag (EST) databases were performed using a known wheat PPO sequence as a search argument; identified ESTs were resequenced and aligned. Results from this study suggest the presence of at least six PPO genes in hexaploid wheat, falling into two clusters with three similar sequences each. Based on the tissues used for cDNA library preparation, three genes (all members of one cluster) are expressed during kernel development and may therefore influence cereal product quality; the remaining three genes (belonging to the second cluster) were isolated from nonkernel cDNA libraries and may not be expressed at high levels during grain development. Discovery of these genes represents an essential first step in the functional characterization of wheat PPOs.     

DNA colony hybridization method using synthetic oligonucleotides to detect enterotoxigenic Escherichia coli: collaborative study

The genes that encode several of the enterotoxins produced by Escherichia coli have been cloned by recombinant DNA techniques. When the nucleotide sequence of these genes is determined, defined sequence oligonucleotides that include a part of these genes may be synthesized. A 22-base DNA hybridization probe was produced for each of 2 heat-stable E. coli enterotoxin (ST) genes: STH, from strains originally isolated from humans; and STP, from strains first found in pigs. For this study, 32P end-labeled DNA probes, sonicated calf thymus DNA, and 3 known and 20 unknown (10 ST-positive and 10 ST-negative) strains were sent to each of 23 collaborators. Cultures were spotted onto an agar-based medium and grown into colonies, which were transferred by blotting to cellulose filters, lysed by alkali and steam, and used for DNA colony hybridization with the ST DNA probes. Strains containing an ST gene were recognized as dark spots on an autoradiogram. Of the 460 samples analyzed, 440 (95.7%) were correctly classified by the collaborators. The method has been adopted official first action.