环境因子对微小亚历山大藻Amtk-9生长与产毒的综合影响

微小亚历山大藻是产生麻痹性贝毒的主要生物之一。产毒藻株在不同培养条件下所产生的毒素总量有差异,因此研究环境因子对微小亚历山大藻生长与产毒的综合影响,找到微小亚历山大藻生长和产毒的适宜条件,对麻痹性贝毒在赤潮中是否造成贝类蓄毒有十分重要意义。本文设计了一个四因素三水平的正交实验,研究温度、盐度、营养盐、光照强度等环境因子对微小亚历山大藻Amtk-9生长与产毒的综合影响。结果表明:在实验范围内,微小亚历山大藻Amtk-9生长最佳条件为温度25℃,盐度30,培养基中氮含量为基础f/2培养液配方中氮磷含量的2倍,光照强度10000 lx。最佳产毒条件除了氮磷含量为基础f/2培养液配方中氮磷含量的3倍外,其它条件与生长的最佳条件相同。盐度、营养盐、光照这三个因素的不同水平对微小亚历山大藻Amtk-9指数生长期细胞比增长率、指数生长末期单位细胞含毒量均有极显著影响(F>F0.01)。温度对微小亚历山大藻Amtk-9的生长和产毒则无显著影响(F相似文献   

链状亚历山大藻暴露下紫贻贝体内麻痹性贝毒蓄积转化规律

本研究将紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)暴露于一株麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish toxins, PSTs)优势产毒藻——链状亚历山大藻(Alexandrium catenella, GY-H25株),模拟现场赤潮藻密度,探究了紫贻贝内脏团和可食组织中蓄积代谢及生物转化过程,并通过蓄积代谢动力学,重点比较了不同细胞密度GY-H25对紫贻贝体内毒素蓄积代谢和转化情况的影响。结果显示,GY-H25生长及产毒稳定,PSTs组分主要为N-磺酰胺甲酰基类毒素(C1和C2),单细胞最高产毒能力为2.96 pg STXeq/cell。暴露实验中,紫贻贝对PSTs有较强的蓄积作用,2种暴露浓度下PSTs含量变化趋势一致,实验结束时,2种暴露组紫贻贝内脏团中PSTs均超过欧盟国际限量标准(800 μg STXeq/kg),但可食组织则均低于限量标准;比较发现,高浓度组紫贻贝内脏团最高蓄积浓度达到6 815.36 μg STXeq/kg,且高浓度组暴露期间平均蓄积速率为17.89%,显著高于低浓度组13.06%的蓄积速率。另外,紫贻贝对PSTs表现出较强的生物转化能力,在对C1、C2和GTX5三者的转化研究中发现,快速代谢时期和平稳期C2→GTX5的转化为GTX5生成的主要途径,同时期C1的相关转化中C1→GTX5途径超过C2→C1,致使C1整体占比减少。综合评估紫贻贝中PSTs转化产物和毒性当量因子(toxic equivalency factor, TEF),发现紫贻贝对PSTs代谢转化进一步促使高毒性GTX5的生成和占比提升,总体终端毒性升高,这也可能是秦皇岛紫贻贝中PSTs风险严峻的主要原因之一。因此,本研究有助于科学评估紫贻贝中PSTs风险,为建立区域性风险监测技术提供科学基础。     

链状亚历山大藻的培养及麻痹性贝类毒素的提取和检测

为了研究麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning toxins,PSP)的来源和检测,对实验室分离培养的产麻痹性贝类毒素的链状亚历山大藻进行了研究。首先通过接种对数生长期藻细胞,培养8 d内就能达到最高细胞密度(2.4×10⁴ cells/mL)左右,再以0.05 mol/L的醋酸超声波破碎藻细胞提取粗毒素,结合小白鼠生物检测法,经高效液相色谱分析,本株藻主要含有C1/2、GTX4、GTX5和NEO,浓度分别为GTX5(0.827 5)>GTX4(0.339 2)>C2(0.252 6)>NEO(0.126 6)>C1(0.045 5)(单位:μmol/L),毒素粗提液经过Sephadex-G15凝胶层析柱处理,用小白鼠生物法和荧光分光光度法联合检测定位,收集到纯度较高的PSP,本论文工作为将来贝类毒素的研究提供资料。     

塔玛亚历山大藻产麻痹性贝类毒素能力的研究

为探究塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)产麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP)的能力,通过设置不同空间效应、盐度和营养素浓度对塔玛亚历山大藻进行培养,分析不同培养条件下塔玛亚历山大藻产麻痹性贝类毒素的能力.结果表明:1)塔玛亚历山大藻中至少含有1...     

营养环境对微小亚历山大藻C4生长和产毒的影响

为考察营养成分以及培养基础液再利用对一株微小亚历山大藻的生长和产毒的影响,采用单因素实验分别研究了氮(NaNO_3)、磷(NaH_2PO_4)、微量元素(FeCl_3、Na2EDTA、CuSO_4、Na_2MoO_4、ZnSO_4、CoCl_2、MnCl_2)、维生素(Vitamin B12、Vitamin H、Vitamin B1)、碳(NaHCO_3)的不同含量以及海水(培养基础液)利用方式(不循环与循环利用)对微小亚历山大藻C4生长、毒素含量(μmol/L)与毒素组成的影响。结果显示,氮、磷浓度对C4藻的毒素总含量(μmol/L)有显著影响,其他因素影响均不显著;氮、磷、碳及微量元素的浓度对GTX1/4(GTX1+GTX4)在总毒素(GTX1+GTX2+GTX3+GTX4)中所占比例均影响显著,而维生素浓度和海水循环利用对GTX1/4所占比例影响均不明显。氮浓度在0~883μmol/L范围内,毒素含量与氮浓度呈正相关关系,氮浓度进一步增加,毒素含量没有明显变化;磷浓度在0~145.2μmol/L范围内增加,毒素含量先增后降,最终保持稳定的趋势。最佳的产毒条件为氮883μmol/L,磷18.15μmol/L,微量元素为f/2海水培养基中微量元素的0.5倍,碳不添加。     

链状亚历山大藻抑制消减杂交文库的构建及分析

为了筛选链状亚历山大藻特异表达的发光相关基因,应用抑制消减杂交技术,构建了链状亚历山大藻特异表达的cDNA消减文库,共获得500个克隆,通过基因PCR初步筛选表明插入片段的大小主要集中在250～1000 bp,随机挑选10个阳性克隆进行双向测序和序列比对分析,有2个克隆基因片段与已知基因序列高度同源,分别为荧光素结合蛋白和羧化酶/加氧酶,另有8个克隆基因片段在GenBank中未查找到相应的同源基因,可能为未知新基因序列.这些基因的获得为进一步研究链状亚历山大藻特异表达基因,阐明其发光机理及建立特异甲藻的新型检测方法提供重要依据.     

磷浓度对２种有毒亚历山大藻生长和产毒力的影响

采用显微镜细胞计数和标准藻毒监测方法—小鼠生物法,研究了4种磷浓度0µmol•L-1、1.8µmol•L-1、3.6µmol•L-1和5.4µmol•L-1对有毒甲藻塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)和微小亚历山大藻(Alexandtium minutum)的生长和产毒力的影响。结果表明,磷浓度对两种甲藻的生长和产毒能力都有显著性影响(p<0.05)。3.6µmol•L-1磷浓度组的塔玛亚历山大藻密度显著高于其它3个磷浓度组,0µmol•L-1磷浓度组显著低于其它3个磷浓度组。微小亚力山大藻在1.8µmol•L-1、3.6µmol•L-1和5.4µmol•L-1磷浓度下生长没显著性差异(p>0.05)。但在0µmol•L-1磷浓度下生长缓慢,藻密度显著低于其它3个有磷组。0µmol•L-1磷浓度下塔玛亚历山大藻和微小亚历山大藻的产毒能力最高, 显著高于其它磷浓度组(p<0.05),分别为3 MU•10000cells-1和5.2MU•10000cells-1。其它磷浓度组两种有毒甲藻的产毒能力没有显著性差异(p>0.05)。     

微小亚历山大藻amtk-4共附生菌群多样性及其产毒新种Z1-D的sxtA1基因进化研究

藻菌关系是揭示赤潮生消与防控、赤潮毒素产生机制的关键,而产毒甲藻共附生菌群多样性及可培养菌株的获得是解析藻菌关系的前提。微小亚历山大藻(Alexandrium minutum)是全球性典型赤潮甲藻,其产生的麻痹性贝类毒素(PSP)危害巨大,但目前对其共附生菌群尚缺乏系统性研究。通过高通量测序首次解析了产毒微小亚历山大藻amtk-4共附生菌群的物种种类及相对丰度信息;分离获得可培养菌株并对筛选获得的产毒细菌新种Z1-D的毒素合成基因sxtA1进行了基因进化分析,结果表明,amtk-4共附生菌群包括85个OTU,其中包括10门、20纲、40目、59科及87属。其6个优势属包括Phycisphaeraceae科未知属(11.8%)、Muricauda属(10.3%)、腐螺旋菌科未鉴定属(9.1%)、Hyphomonadaceae科未鉴定属(8.9%)、Haliea属(5.7%)及红细菌科未鉴定属(5.1%)。amtk-4共附生菌群中未鉴定属比例高达53.4%。藻生长稳定期所分离获得的可培养细菌数量及种类最多。5株细菌中菌株Z1-D及Z1-4经分子鉴定分别为亚硫酸杆菌属(Sulfitobacter)及Mesorhizobium属新种。其中Z1-D发酵代谢产物含微量石房蛤毒素(STX),其基因片段orf-01498与蓝藻sxtA1基因高度同源,与产毒蓝藻间可能存在着基因共同进化。     

塔玛亚历山大藻毒素及其对中国对虾的急性毒性

利用美国分析化学家协会(Association of Official Analytical Chemists, AOAC)所推荐的小鼠生物法(mouse bioassay, MBA), 测定了塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense)(ATHK藻株)毒素粗提液的麻痹性贝毒(paralytic shellfish poisoning, PSP)毒性;采用浸浴方式, 研究了该藻株对中国对虾的急性毒性; 采用HE染色方法, 分别对有毒藻浸浴处理和毒素粗提液注射处理后96 h中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)的鳃和肝胰腺石蜡切片进行观察。结果表明, 该藻株麻痹性贝毒毒性为3.9×10^–5 MU/cell (相当于7.3 pg STX Equal/cell), 在同种藻株中属低毒藻株; 在96 h急性毒性实验中, 塔玛亚历山大藻对中国对虾的半致死浓度(LC₅₀)为1.0×10⁴ cells/mL, 安全浓度(SC)为1.0×10³ cells/mL; 石蜡切片观察发现, 塔玛亚历山大藻与毒素粗提液分别引起了鳃和肝胰腺组织出现细胞肿胀、空泡化等病理变化。以上研究结果提示, 塔玛亚历山大藻对中国对虾有急性致死作用。为了保证中国对虾的健康养殖, 养殖水体中的塔玛亚历山大藻浓度至少应该控制在1.0×10³ cells/mL以下; 鳃的病变直接导致对虾窒息死亡可能是塔玛亚历山大藻暴露后对虾急性致死作用的最重要原因;塔玛亚历山大藻所产的PSP毒素可引起虾体代谢和解毒的主要器官—肝胰腺的病变。     

初始密度对微小亚历山大藻生长及产麻痹性贝类毒素的影响

为研究微小亚历山大藻生长和产麻痹性贝类毒素(PSP)的规律,采用不同初始密度对微小亚历山大藻进行培养,综合采用显微镜计数、小鼠生物检测(MBA)、高效液相色谱—柱后衍生(HPLC-FLD)等方法分析微小亚历山大藻在不同接种密度条件下的生长和产毒特性.结果表明,随着初始密度增加微小亚历山大藻通过静止期的时间缩短,到达最大生长密度的时间提前,但是生长的最大细胞密度和平均比生长率却呈下降趋势,增值模型反应的情况与观测结果相一致,随着初始密度的增加,依赖于初始种群密度的参数(a)减少,环境容量(K)减少,种群瞬时增殖速度(r)下降.4种不同初始密度(0.05×104、0.10×104、0.15×104、0.30×104cells/mL)条件下,微小亚历山大藻细胞的毒性呈现先增大后减小趋势,在初始密度为0.1×104 cells/mL条件下,同一生长期内细胞毒性比其他3个密度条件下高.HPLC检测微小亚历山大藻含有的毒素为GTX1-4,含量分别为2.14、2.08、4.97、5.04 fmol/cell.综合考虑微小亚历山大藻在生长过程中的细胞最大密度、达到最大密度所用时间以及细胞毒性大小等因数,采用(0.10～0.15)×104 cells/mL接种密度培养微小亚历山大藻,能够达到较好的产毒效果.     

Development and application of fluorescence in situ hybridization (FISH) method for simple and rapid identification of the toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense and Alexandrium catenella in cultured and natural seawater

ABSTRACT:   The toxic dinoflagellates Alexandrium tamarense (Lebour) Balech and A. catenella (Whedon and Kofoid) Balech produce potent neurotoxins, such as saxitoxin and gonyautoxin and have been mainly responsible for paralytic shellfish poisoning (PSP) in Japan. To prevent a negative effect on the fishery industry, it is necessary to identify these toxic species precisely and rapidly before and during the bloom. In this paper, a rapid and simple protocol of a fluorescence in situ hybridization (FISH) method using ribosomal RNA (rRNA)-targeted probes has been established for identifying the cultured strains and natural cells of A. tamarense and A. catenella . Using the FISH method established in this study, it was possible to identify these toxic species species-specifically and rapidly, within 30 min. The procedure of detection constituted three steps: (i) fixation/dehydration; (ii) hybridization; and (iii) washing; this made the identification simple. Moreover, this method did not require either special techniques or equipment, and the cost for detection was low. The specificity, rapidity, and simplicity of the developed method suggest that it might be useful for routine monitoring of these toxic microalgae.     

微小亚历山大藻对近江牡蛎清滤率以及麻痹性贝类毒素(PSP)蓄积的影响

为获知牡蛎对有毒微小亚历山大藻(A. minutum)的滤食以及蓄积PSP毒素的规律性,本实验采用细胞毒性为93.42±2.55×10-6 MU/cell的A. minutum藻投喂牡蛎,以无毒扁藻投喂作对照,首先研究了0.5-3.0×103 cells/mL6个不同浓度的毒藻对牡蛎滤食的影响,然后投喂浓度为1.5×103 cells/mL的毒藻,分别研究15 h短期蓄积和5天长期蓄积对牡蛎体内毒素的影响及规律。结果表明,在0.5~1.5×103 cells/mL毒藻浓度范围内牡蛎清滤率较高,超过1.5×103 cells/mL时牡蛎清滤率显著下降(P<0.01),由此确定后期投喂毒藻的浓度“阀值”为1.5×103 cells/mL;短期蓄积实验牡蛎在0~6 h内将有毒藻滤食尽,其体内PSP毒素在6~12 h间达到最大值149.6±10.5 MU/100 g,随后开始下降。长期蓄积实验过程中,牡蛎的清滤率没有发生显著变化(P>0.01),在蓄积实验的第2天牡蛎体内PSP毒素水平超过国家限量标准(400 MU/100g),在5天实验结束时,牡蛎体内PSP毒素水平高达3069.2±178.2 MU/100 g,高于国家限量标准的7.7倍。实验结果作为PSP在牡蛎中蓄积及代谢的重要基础数据,为研究PSP的脱除及净化提供思路。     

Development of a quantification assay for the cysts of the toxic dinoflagellate <Emphasis Type="Italic">Alexandrium tamarense</Emphasis> using real-time polymerase chain reaction

ABSTRACT:   The cysts of toxic dinoflagellate Alexandrium tamarense are the seed population for the bloom responsible for paralytic shellfish poisoning (PSP). However, it is impossible to identify the Alexandrium spp. cyst on the basis of morphological features. In this study, we prepared A. tamarense cysts by sexual conjugation in laboratory conditions and developed an efficient DNA extraction method for polymerase chain reaction (PCR) assay. Using the A. tamarense cysts, we established the identification and quantification method showing the species specificity and the high sensistivity for A. tamarense cysts using real-time PCR. This assay was also able to detect and quantify the A. tamarense cysts accurately when mixed with excess cysts of A. catenella (Whedon and Kofoid) Balech prepared by conjugation experiment.     

Distribution and abundance of resting cysts of the toxic Alexandrium spp. (Dinophyceae) in sediments of the western Seto Inland Sea, Japan

Sediment samples were collected from 135 stations in the western part of the Seto Inland Sea (Iyo Nada, Suo Nada, Beppu Bay, Tokuyama Bay, Hiroshima Bay, Aki Nada, Hiuchi Nada and Bingo Nada) to determine the horizontal distribution and abundance of resting cysts of Alexandrium spp. ( A. tamarense  +  A. catenella ). Enumeration of the cysts was performed using the primuline-staining direct count method. Cysts of Alexandrium spp. were rarely found in Iyo Nada, Suo Nada and Beppu Bay, but were widely distributed in Tokuyama Bay, Hiroshima Bay, Aki Nada, Hiuchi Nada and Bingo Nada. Cyst concentrations ranged from not detected (ND) to 14, ND to 17, ND to 4, 93 to 8137, 8 to 4454, ND to 6, ND to 18 and 4–29 cysts/cm³ wet sediment in Iyo Nada, Suo Nada, Beppu Bay, Tokuyama Bay, Hiroshima Bay, Aki Nada, Hiuchi Nada and Bingo Nada, respectively. The majority of cysts occurred in Tokuyama Bay and Hiroshima Bay, where higher densities were observed in the inner bay and along the coastal margin. Relatively higher cyst concentrations were observed at stations with a higher mud content. The abundance of Alexandrium spp. cysts in western Seto Inland Sea is lower than in the eastern Seto Inland Sea, except for Tokuyama Bay and Hiroshima Bay. However, because sporadic blooms of Alexandrium have been observed, continuing monitoring is necessary to prevent paralytic shellfish poisoning outbreaks in this area.