多堆柄锈菌侵染不同抗性玉米的组织病理学研究

［目的］ 了解不同抗感玉米自交系对南方锈病的组织病理学反应,为今后筛选不同类型抗病自交系提供参考。［方法］ 采用曲利苯蓝透明染色法,以4个玉米自交系为材料,研究了玉米南方锈病致病菌—多堆柄锈菌在不同抗性材料上侵染过程的组织学特征。［结果］ 多堆柄锈菌侵入和定殖可以分为5个阶段：孢子萌发与芽管形成、附着胞形成、侵入细胞、胞内吸器产生、菌丝在细胞间扩展。在不同抗性的玉米材料上,病菌孢子萌发和芽管形成差别不明显,但侵入后病菌在不同抗性材料内的发育进程和发育程度具有显著差异。在抗病玉米材料上,病菌初生菌丝、吸器母细胞、次生菌丝的形成时间推迟,胞内吸器少,菌丝分枝少,菌丝生长缓慢。［结论］ 这些抗性特征与田间表现出的细胞过敏性坏死、叶片上夏孢子堆少的特征具有一致性。     

玉米多堆柄锈菌的初侵染源探讨

由玉米多堆柄锈菌(Puccinia polysora Underw)引起的玉米锈病,以前文献均称为玉米南方型锈病.我国台湾省在1976年首次报道,20世纪80年代后期大面积流行.1997～1999年在浙江省淳安县和1998年在河北省邯郸、沧州等地病害发生流行.关于玉米多堆锈菌的生活史和侵染循环,仅知有夏孢子和冬孢子阶段,夏孢子重复再侵染完成侵染循环.在台湾省全年都有发病,病害传播主要靠夏孢子不断产生和侵染,冬天如气温较低,可产生冬孢子.为了探讨浙江省及我国冬季玉米不能种植地区,该菌的越冬和初侵染源,于1998～2001年分别在浙江省杭州市郊浙江省农业科学院农场和淳安县重病区进行调查研究.     

多堆柄锈菌潜育期侵染量实时荧光定量PCR检测体系的建立

为快速及时诊断并定量监测玉米内多堆柄锈菌Puccinia polysora潜育期的侵染量,根据多堆柄锈菌的ITS序列和玉米Actin2基因序列,分别设计多堆柄锈菌特异性引物PpoF/PpoR和Taq Man探针PpoP以及玉米特异性引物ZmF/ZmR和Taq Man探针ZmP,对引物和探针的特异性和灵敏度进行测定,并用这2对引物和探针建立多堆柄锈菌潜育期的实时荧光定量PCR检测体系,定量监测接种后玉米叶片中多堆柄锈菌DNA量随时间的变化。结果表明,多堆柄锈菌和玉米的特异性引物和探针对各自靶标片段均具有良好的特异性,灵敏度分别为10^-3ng/μL和10^-2ng/μL;在接种后24 h,利用所建实时荧光定量PCR检测体系即可在玉米叶片中检测到多堆柄锈菌,且潜育期内多堆柄锈菌的侵染量随时间呈指数增长。表明所建实时荧光定量PCR检测体系可用于多堆柄锈菌潜育期侵染量的定量检测和监测。     

多堆柄锈菌孢子数量与病情以及气象因素的相关性分析

 为了解空气中引起玉米南方锈病病原菌多堆柄锈菌孢子数量与田间病情的关系以及气象因素对孢子和病情的影响,于2017年6 ~9月,在中国农业大学开封实验站,监测空气中多堆柄锈菌的孢子动态,并调查病情和记录气象数据,分别利用Pearson 和Spearman等级相关分析孢子数量与病情以及气象因素与孢子数量和病情的相关性,进一步利用多元逐步回归分析构建病害预测模型。结果表明,在调查日期内(8 月 5~26日),孢子数量呈现先升后降的趋势;孢子的空间分布和扩散方向与风向基本一致。8 d前和3 d前的孢子数量均与病情呈显著正相关(P＜0.01),相关系数分别为0.720和0.755。孢子浓度与温度(≥27℃)、日照时数呈显著负相关;8d 前的气象因素能够显著影响田间病情的发生。建立了玉米南方锈病病害预测模型:Y= 70.938+ 0.009 SC-2.180 MT(其中Y表示的是病情指数, SC表示孢子数量,MT表示日平均气温,R²为0.716),为病情预测提供指导。     

玉米南方型锈病夏孢子的侵染时期

玉米南方型锈病由多堆柄锈菌Puccinia polysora Underw引起,是浙江省20世纪以来发生较重的玉米病害[1-2],了解和掌握该病夏孢子的侵染时期,是最终控制其流行的关键所在.笔者采用夏孢子定点空中捕捉、不同恒温条件夏孢子发芽、玉米不同生育期感病性及田间病情消长动态观察等方法,研究了玉米南方型锈病的主要侵染期以及病情与温度、夏孢子数量、玉米感病生育期的吻合程度.     

青海云杉响应锈菌侵染转录组分析

为探究锈菌与青海云杉之间的互作机制,利用Illumina测序平台对青海云杉健康植株和发病植株进行转录组测序,以差异倍数(FC)≥2且错误发现率(FDR)<0.01为标准,共获得15408个差异表达基因,有10296个差异基因上调,5112个差异基因下调。GO注释中,DEGs显著富集到代谢过程、细胞过程、催化活性和结合等过程。KEGG注释中,DEGs显著富集到核糖体、植物与病原互作、内质网蛋白加工、信号转导等过程,通过分析相关通路发现,青海云杉响应锈菌侵染的分子机制受多基因网络系统的调控。为验证RNA-seq数据的可靠性,对10个DEGs进行RT-qPCR表达量检测,验证结果为,RT-qPCR和RNA-seq测得的基因表达趋势基本一致。这有助于深入研究候选基因在青海云杉响应锈菌侵染中的作用,同时也为开展青海云杉抗病功能基因组学研究奠定基础。     

珊瑚菜柄锈菌性孢子阶段的发现及北沙参锈病研究简报

 北沙参(植物名珊瑚菜Glehnia littoralis)为名贵药材,锈病是北沙参的重要病害,其病原为珊瑚菜柄锈菌Puccinia phellopteri Syd.。该菌虽早有记述,但迄今只见有冬、夏孢子阶段的报道,对其生活史及侵染循环尚不清楚。     

玉米南方型锈病发生规律与防治技术初步研究

采用田间调查和试验的方法,着重研究了玉米南方型锈病病菌多堆柄锈菌夏孢子发芽与环境条件的关系,玉米不同生育期的感病性和病害的初侵染来源,并探讨了控制该病为害的主要技术途径。     

玉米丝黑穗病原菌侵染的一些细胞学研究

 在玉米生育早期,以幼芽鞘为材料,对11个抗病性不同的自交系进行了研究。玉米丝黑穗病原菌[Sphacelotheca reiliana (Kühn) Clint var.zeae Pass]可在玉米幼芽鞘内表皮上生长和繁殖;其侵染菌丝可直接侵入表皮细胞或通过气孔进入寄主体内。菌丝的侵入诱导了芽鞘内表皮细胞的细胞壁、细胞质和细胞膜特性的异常变化;抗性不同的自交系对病原菌侵入的反应不同,揭示了在生育早期玉米芽鞘细胞就表现了其固有的抗病性。     

玉米南方锈病发生温度范围测定

玉米南方锈病由玉米多堆柄锈菌(Puccinia polysora Underw.)引起,主要分布在热带和亚热带地区,但随着全球气候变暖,其发生范围不断扩大,对玉米生产的影响也随之扩大。对于该病害发病温度范围的测定有助于病害发生范围的区划和病害预防工作的进行。试验将多堆柄锈菌接种到供试玉米材料‘郑单958’上,置于不同温度下的光照培养箱中培养并观察发病情况,从而确定出玉米南方锈病的发病温度范围以及发病最适温度范围。试验结果表明:玉米南方锈病的发病温度范围为15~31℃,最适温度范围为24~27℃。     

解淀粉芽胞杆菌HRH317对串珠镰孢菌菌丝形态和超微结构的影响

为明确新型生防菌解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens HRH317菌株对病原菌串珠镰孢菌Fusarium moniliforme的抑制作用,采用牛津杯法对HRH317菌株抑菌活性进行测定,并采用扫描电子显微镜、透射电子显微镜和荧光显微镜对经HRH317菌株发酵上清液处理后的串珠镰孢菌菌丝形态及超微结构进行观察。结果显示,HRH317菌株发酵上清液对串珠镰孢菌有很好的抑菌活性,抑菌圈平均直径可达33.31 mm。扫描电镜结果显示,HRH317菌株发酵上清液处理24 h时,串珠镰孢菌菌丝体出现断裂现象;处理72 h时,串珠镰孢菌菌丝体断裂较严重,多处裂解;处理96 h时,串珠镰孢菌菌丝体彻底瓦解,且无完整菌丝体。透射电镜结果显示,HRH317菌株发酵上清液处理72 h时,串珠镰孢菌菌丝体细胞形态扭曲变形,细胞内结构紊乱,遭破坏。荧光显微镜结果显示,经PI染料染色处理12 h时,串珠镰孢菌细胞有少数细胞被染成红色,细胞膜通透性受一定程度破坏;处理16 h时,串珠镰孢菌细胞大面积被染红;处理20 h时,串珠镰孢菌细胞被染色面积增大;处理24 h时,串珠镰孢菌细胞膜受破坏程度增加,细胞内大面积被染色。表明解淀粉芽胞杆菌HRH317菌株对串珠镰孢菌菌丝形态和超微结构有破坏作用,能抑制病原菌串珠镰孢菌菌丝体生长。     

中国西北地区禾谷类条锈菌群体的毒性结构分析

为明确中国西北地区大麦条锈菌群体的毒性结构及其与小麦条锈菌的交流程度,采用"Flor基因对基因"假说,对采自甘肃省的398份小麦条锈菌标样和采自甘肃、青海及四川省的67份大麦条锈菌标样进行毒性测定、致病类群及专化型分析,同时对侵染大麦的小麦条锈菌标样进行致病范围测定。结果表明,大麦条锈菌与小麦条锈菌对17个小麦条锈病近等基因系材料均致病,其中,小麦条锈菌对近等基因系的13个抗性基因的毒性频率在56.82%及以上,而大麦条锈菌仅对1个抗性基因的毒性频率达到56.82%以上。通过对2个条锈菌专化型群体进行致病类群分析,发现二者都含有贵农22、水源11、杂46及中四致病类群,表明大麦条锈菌与小麦条锈菌的毒性结构有较大差异,但2个专化型之间有毒性交流,贵农22类群在小麦条锈菌和大麦条锈菌专化型群体中均占第一位。利用100份甘肃省小麦条锈菌对大麦进行致病性测定,发现有10.00%的小麦条锈菌能够侵染西北地区的大麦主栽品种。     

小麦条锈病菌致病类型G22-83及流行小种CYR32和CYR33在四川省小麦品种(系)上寄生适合度的测定及分析

为了解致病类型G22-83及流行小种CYR32和CYR33对四川省近年小麦生产品种和后备品种的寄生适合度,在田间分别将致病类型G22-83、流行小种CYR32和CYR33接种于四川省109个小麦品种(系),采用综合病情指数法测定3个供试菌株的相对寄生适合度。结果显示,致病类型G22-83、流行小种CYR32和CYR33的平均寄生适合度分别为0.1930、0.0560和0.0379,且前者显著高于后两者;流行小种CYR32和CYR33的平均相对寄生适合度有差异,但是差异不显著。致病类型G22-83、流行小种CYR32和CYR33在四川省109个小麦品种(系)上相对寄生适合度的中位数分别为0.0626、0.0000和0.0000,前者在四川省109个小麦品种(系)上相对寄生适合度的平均水平和波动程度均高于后两者。致病类型G22-83在四川省小麦生产品种和后备品种上的寄生适合度较高,在今后一段时间内可能成为该地区小麦条锈菌的优势菌系。     

基于毒性表型与微卫星标记的云南省条锈病菌群体遗传分析

为明确云南省条锈菌群体结构和遗传多样性水平,利用19个中国鉴别寄主和11对微卫星(simple sequence repeat,SSR)标记引物对采自云南省大理、曲靖、文山、昭通4个市的88个菌系进行了毒性表型分析和分子基因型分析。毒性表型分析结果表明,云南省条锈菌群体Nei’s基因多样性指数为0.17,Kosman指数为0.22,云南省条锈菌群体毒性结构复杂;菌系以Hybrid 46类群(77.3%)和贵农22类群(17.0%)为主,并且均不能侵染鉴别寄主中四和Triticum spelta album。分子基因型分析结果表明,云南省条锈菌整体上香农信息指数为0.63,分子遗传多样性比较丰富;大理市菌系香农信息指数为0.64,分子遗传多样性最丰富;文山市菌系香农信息指数为0.35,分子遗传多样性最低。聚类分析结果表明,云南省西部大理市菌系明显不同于云南省东部曲靖市、昭通市、文山市的菌系,昭通市菌系和曲靖市菌系毒性结构和基因型结构基本相同,表明云南省东、西部条锈菌群体遗传分化程度较高,是2个相对独立的流行区域。     

西藏小麦条锈菌群体结构与遗传多样性

为查明西藏小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici群体结构和遗传多样性,采用中国鉴别寄主和近等基因系鉴别寄主,以及竞争性等位基因特异性PCR-单核苷酸多态性（kompetitive al-lele specific PCR-single nucleotide polymorphism,KASP-SNP）分子标记对2017年采自西藏的150个小麦条锈菌菌系分别进行表型分析和基因型分析。表型分析结果显示,中国鉴别寄主将150个菌系区分为 12 个已知小种、6 个已知致病类型和 13 个未知致病类型,所有菌系均不能侵染中四和Triticum spelta album鉴别寄主。近等基因系鉴别寄主将150个菌系区分为88个毒性类型,这些毒性类型均不侵染携带抗性基因Yr5、Yr10或Yr15的品种。基因型分析结果显示,26对引物将150个菌系划分为73个基因型,表明西藏小麦条锈菌群体基因型丰富。基因流分析结果表明,波密县与洛扎县小麦条锈菌亚群体之间的基因流N_m最高,达5.86,米林县西部与波密县、洛扎县、巴宜县、米林县东部条锈菌亚群体之间的N_m较低,分别为0.25、0.34、0.42和0.67,表明西藏不同地区条锈菌群体之间基因交流强度差异较大。说明西藏作为我国小麦条锈病的独立流行区,条锈菌群体毒性结构复杂,遗传多样性高。     

云南小麦条锈菌群体对18个抗条锈近等基因系的毒性分析

为监测云南省小麦条锈菌群体毒性及小麦抗条锈基因的有效性动态,2016年采用18个抗条锈近等基因系鉴别寄主对云南省9个州市的136个小麦条锈菌株进行毒性分析,并按八进制法对小种进行命名。结果表明,云南省小麦条锈菌群体毒性丰富,共鉴定出64个小种类型,其中居于前2位的小种是550273和550073,出现频率分别为28.68%和11.76%,是本年度优势小种;其它小种出现频率均在4.41%以下,为次要小种。条锈菌群体对Yr5、Yr10、Yr15、Yr32四个抗条锈基因的毒力频率均为0,对Yr24、Yr Tr1、Yr8、Yr17四个抗条锈基因的毒力频率在0.74%~11.76%之间,表明这8个基因是云南省当前有效的抗条锈基因;对Yr27的毒力频率为52.94%,对Yr1、Yr6、Yr7、Yr9、Yr43、Yr44、Yr SP、Yr Exp2、Yr Tye九个抗条锈基因的毒力频率为77.94%~91.91%,表明这10个抗条锈基因的抗性已减缓或丧失,说明这些基因在云南省已失效。     

小麦条锈菌细胞质效应子Hasp8抑制植物基础免疫

为明确小麦条锈菌Puccinia striiformis f. sp. tritici效应子Hasp8的功能,以小麦条锈菌CYR31侵染水源11小麦叶片的cDNA为模板,通过PCR技术扩增获得Hasp8基因的完整编码区序列,采用qRTPCR技术测定Hasp8基因的表达情况,利用农杆菌介导马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)瞬时表达体系在烟草上验证Hasp8基因是否能够抑制由Bax蛋白诱导的细胞坏死,将Hasp8基因构建到pCAMBIA1302载体用于在烟草上瞬时表达Hasp8进行亚细胞定位以明确该效应蛋白的作用空间;并将Hasp8基因构建到p EDV6载体上用于荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens介导的瞬时表达系统以明确该效应蛋白是否能够抑制病原相关分子模式引发的免疫反应和效应蛋白诱导的免疫反应。结果表明,Hasp8基因编码117个氨基酸,N端含22 aa的信号肽;qRT-PCR结果显示,Hasp8基因在小麦条锈菌CYR31侵染小麦水源11的早期上调表达。烟草瞬时表达Hasp8基因能够抑制由Bax诱导的细胞坏死;烟草上亚细胞定位发现效应子Hasp8...     

Two class III chitin synthases specifically localized in appressoria and haustoria of Puccinia graminis f. sp. tritici

Rust fungi like Puccinia graminis f. sp. tritici are known to change their cell wall properties upon entering the plant tissue. Immunohistochemistry revealed the cellular localization of two class III chitin synthase isoforms in rust mycelia developing on and in the host plant. Isoform IIIa is restricted to fungal infection structures growing on the surface of the plant, such as germ tubes and, predominantly, appressoria. Isoform IIIb is found exclusively in haustoria developed inside the plant. Thus, the rust fungus uses at least two chitin synthase isoforms with specialized functions in the differentiation of infection structures during the biotrophic plant-pathogen-interaction.     

橡胶树白粉菌Oidium heveae侵染寄主拟南芥的筛选

为筛选出橡胶树白粉菌Oidium heveae Steimnann新的寄主载体,通过接种野生型拟南芥Col-0、突变体Sr1-4D及eds1,观察了橡胶树白粉菌侵染不同拟南芥突变体的过程,PCR扩增测序法验证相关致病基因,构建橡胶树白粉菌-拟南芥互作体系。结果表明,在Col-0、Sr1-4D叶片上面,橡胶树白粉菌产生部分菌丝后停止生长,不能形成典型的橡胶树白粉病症状;但能成功侵染eds1叶片,在叶片的正、背面有银白色辐射状菌丝,后期在病斑上出现一层粉层,表现橡胶树白粉病的典型症状。组织染色和显微观察结果显示,在突变体eds1叶片上橡胶树白粉菌完成了侵染过程。PCR扩增测序结果表明接种后突变体eds1叶片上及组织中病菌均为橡胶树白粉菌;使用橡胶树白粉菌3个致病相关基因作为靶标,验证了eds1和橡胶树上白粉菌基因组中的3个致病相关基因相似度均达到99%~100%。表明橡胶树白粉菌可侵染拟南芥突变体eds1。