悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

为进一步研究悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliate嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术,本研究克隆了悬铃木方翅网蝽的非典型气味受体基因CcilOrco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的半翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至pEASY-Blunt载体并测序。将克隆获得悬铃木方翅网蝽非典型气味受体Orco的cDNA序列命名为CcilOrco(GenBank登录号:MF564288),序列分析结果显示,CcilOrco开放阅读框长1 419bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25kD,等电点为6.22,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的半翅目昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。qPCR结果显示CcilOrco主要在雌雄成虫触角中高表达。     

华北大黑鳃金龟气味受体OrCo基因的克隆及序列分析

嗅觉受体OrCo(olfactory receptor coreceptor)在不同昆虫体内高度保守,克隆华北大黑鳃金龟[Holotrichiaoblita(Falderman)]OrCo基因可以为进一步探索受体在气味识别过程中所起的作用和功能提供基础。本研究利用RT-PCR和RACE方法,克隆获得华北大黑鳃金龟OrCo受体基因cDNA全长序列。将该基因命名为Hobl/Or-Co。序列分析结果显示,Hobl/OrCo全长共1 598bp,开放阅读框全长1 434bp,编码477个氨基酸,序列中有7个跨膜区和高度保守的C端区域。Hobl/OrCo基因的氨基酸序列与近缘种铅灰齿爪鳃金龟嗅觉受体的同源性高达95.39%,与已经报道的其他昆虫的嗅觉受体同源性在76%以上,特别是在C端几乎完全一致。     

茶翅蝽非典型气味受体基因的克隆及其生物信息学特征和组织特异性表达分析

为明确茶翅蝽Halyomorpha halys的非典型气味受体（odorant receptor co-receptor,Orco）基因的生物信息学特征和组织特异性表达谱,采用Trizol法提取茶翅蝽成虫触角的总RNA,利用RTPCR技术克隆其Orco基因,使用生物信息学软件对茶翅蝽Orco蛋白进行跨膜区域预测、结构分析和系统发育分析,并采用实时荧光定量PCR技术测定Orco的组织表达谱。结果表明,克隆获得茶翅蝽Orco基因并命名为Hhal Orco,该基因的开放阅读框全长1 428 bp,编码475个氨基酸。Hhal Orco蛋白的二级结构中,α螺旋占34.11%,无规则卷曲占36.84%,延伸链占29.05%;其分子质量为53.49 kD,等电点为6.16,无信号肽,是非分泌蛋白;有7个跨膜区,是疏水性蛋白,疏水性系数的平均值为0.297;预测的Hhal Orco蛋白为对称亚基构成的同源四聚体。系统进化分析发现,Hhal Orco与同为半翅目的荔蝽Tessaratoma papillosa亲缘关系最近。qPCR检测结果显示,Hhal Orco基因主要在雌雄成虫的触角中表达,在成虫的头、胸、腹、足中仅有微量表达。     

梨小食心虫气味受体GmolOR10基因克隆及表达谱分析

为研究梨小食心虫Grapholita molesta Busck嗅觉通讯分子机制,本研究应用RT-PCR克隆获得了梨小食心虫气味受体基因GmolOR10的完整开放阅读框,并对其序列结构进行了相关生物信息学分析,最后采用实时荧光定量PCR对GmolOR10在梨小食心虫成虫不同组织(触角、头、胸、腹、足、翅)与不同发育阶段的表达模式进行了定量分析。结果表明,GmolOR10编码区长1 194 bp,编码397个氨基酸,等电点和相对分子量分别为8.57和46.14 kD,有7个跨膜结构域。多序列比对与系统发育树结果显示GmolOR10与卷蛾科苹果蠹蛾Cydia pomonella CpomOR18和山毛榉卷叶蛾Cydia fagiglandana CfagOR18的氨基酸序列一致性较高,分别为84.38%和83.38%。GmolOR10在雄成虫触角中表达量较高,极显著高于雌虫触角(P<0.01),在雌、雄成虫头部也有较高的表达量,在成虫其他组织表达量很低。不同发育阶段的表达谱显示,GmolOR10在梨小食心虫的不同发育阶段均有表达,在成虫期的表达量最高(在雌雄成虫中的表达量均呈现出随着...     

草地贪夜蛾CRAL_TRIO结构域基因家族的基因组鉴定及其表达特征分析

为明确重大入侵性害虫草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda CRAL_TRIO结构域基因的功能,利用同源比对法鉴定该害虫基因组中的CRAL_TRIO结构域基因,利用系统进化树和基因染色体定位探究其进化关系,使用数字基因表达谱分析其在不同发育阶段的表达情况,并采用反转录PCR技术分析19个CRAL_TRIO结构域基因在雌雄成虫不同组织中的表达特征。结果显示,从草地贪夜蛾基因组中鉴定到46个CRAL_TRIO结构域基因,所编码的氨基酸序列存在典型CRAL_TRIO结构域,且该结构域中有8个保守的氨基酸位点。系统进化树和基因染色体定位分析表明,多数草地贪夜蛾CRAL_TRIO结构域基因通过基因复制进化而来。基因表达谱分析发现,草地贪夜蛾CRAL_TRIO结构域基因在不同发育阶段的表达可聚为2组,其中一组在幼虫前期高表达,另一组在6龄幼虫期、蛹期和成虫期高表达。挑选验证的CRAL_TRIO结构域基因大部分在触角和脑中高表达,有2个基因在触角中特异性表达,部分在复眼中具有较高的表达量,表明这些CRAL_TRIO结构域基因在草地贪夜蛾嗅觉和视觉行为调控中起重要作用。     

豌豆蚜特异性扩张分支气味受体基因的克隆及表达分析

豌豆蚜Acyrthosiphon pisum气味受体家族存在明显扩张现象,推测在豌豆蚜寄主适应过程中起着重要作用。本研究旨在克隆豌豆蚜特异性扩张分支上的气味受体基因,明确这些气味受体基因在不同组织中的表达水平。通过PCR技术克隆特异性扩张分支上气味受体基因的全长序列,采用实时荧光定量RT-qPCR技术测定这些基因在触角及足中的表达水平。克隆获得豌豆蚜特异性扩张分支中4个气味受体基因全长序列(GenBank登录号：OL739156-OL739159),分别编码374～376个氨基酸,序列相似性较高,为68.09%～83.11%,均具有7个跨膜结构域。荧光定量RT-qPCR结果显示ApisOR6、ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在豌豆蚜成虫触角及足中均有表达,其中ApisOR8、ApisOR13和ApisOR14基因在触角中偏好表达,ApisOR13基因在触角中的表达量最高。本研究为解析豌豆蚜特异性扩张气味受体的功能提供了分子基础。     

中红侧沟茧蜂嗅觉受体MmedOr2基因的克隆及组织表达谱

嗅觉在天敌昆虫寻找寄主、躲避敌害、交配、转移等行为中发挥关键作用。嗅觉受体是昆虫嗅觉系统中一类重要的功能蛋白。本文选取从中红侧沟茧蜂触角cDNA文库鉴定一个嗅觉受体基因MmedOr2序列片段,采用RACE技术克隆获得中红侧沟茧蜂嗅觉受体基因MmedOr2的全长序列。通过实时荧光定量PCR解析了该基因在中红侧沟茧蜂不同发育阶段、不同组织部位以及交配前后的转录表达谱。结果表明, MmedOr2在触角中特异性表达,且在雌蜂触角中表达量显著高于雄蜂触角。雌、雄蜂羽化后分别在第3 d和第4 d MmedOr2表达量达到最高,该基因转录表达量达到最高后逐渐下降。另外,交配后雌蜂MmedOr2表达量显著下降。根据以上研究结果,我们推测 MmedOr2可能是性信息素受体,在中红侧沟茧蜂寻找配偶等行为中发挥功能。     

入侵害虫松树蜂嗅觉共受体SnocOrco基因的鉴定及其表达模式分析

为探究我国重大入侵害虫松树蜂Sirex noctilio的嗅觉分子机制,通过RT-PCR技术克隆松树蜂嗅觉共受体SnocOrco基因的cDNA全长序列,并进行生物信息学分析,且采用qPCR技术明确SnocOrco在组织中的特异性表达谱和时空表达特性。结果表明,SnocOrco基因（GenBank登录号：MK748989）开放阅读框全长1 446 bp,编码481个氨基酸,氨基酸序列具有7个跨膜螺旋结构和1个高度保守结构功能域Pfam：7tm_6。SnocOrco属于稳定的疏水性膜蛋白,同源性比对和系统发育分析结果显示,氨基酸序列与膜翅目、鳞翅目、鞘翅目和双翅目其它昆虫的Orco都具有很高的同源性,其中与麦茎蜂Cephus cinctus的CcinOrco同源性最高,达到87.14%,在系统发育树中聚为一支。qPCR结果显示,SnocOrco主要在雌、雄成虫触角中高表达,约为外生殖器中表达量的6 000倍和4 000倍,且在雌成虫中的表达量高于雄成虫中的表达量;在2~7日龄成虫触角中SnocOrco的相对表达量在2日龄时达到最高,之后随着日龄的增加呈下降趋势;昼夜节律显示,SnocOrco相对表达量从9：00—15：00呈先上升后下降的趋势,在11：00时达到最高。表明SnocOrco基因在松树蜂两性交流中起着重要作用。     

甜菜夜蛾中肠碱性磷酸酶alp2基因的克隆、表达及功能分析

为探究甜菜夜蛾Spodoptera exigua中肠碱性磷酸酶(alkaline phosphatase protein 2,ALP2)是否为Cry1Ac杀虫蛋白的受体,采用同源克隆和RACE技术克隆了编码alp2基因的完整c DNA序列,利用荧光定量PCR比较了甜菜夜蛾幼虫中肠不同龄期ALP2表达量的差异,利用Ligand blot方法检测了中肠ALP2与Cry1Ac杀虫蛋白的结合。结果表明,alp2基因序列全长1 629 bp(Gen Bank序列号为KP420013),编码542个氨基酸,预测在氨基酸序列N端包含1个由21个氨基酸组成的信号肽,在C端存在1个GPI修饰的锚定位点,且在整个氨基酸序列中存在多个糖基化修饰位点。在整个甜菜夜蛾幼虫期均有ALP2表达,但不同龄期的表达量差异显著,1龄幼虫期表达量最低,4龄幼虫期最高。Ligand blot方法检测结果表明原核表达的ALP2片段与活化的Cry1Ac杀虫蛋白可以结合。研究表明,甜菜夜蛾中肠的ALP2可能是Cry1Ac的受体之一。     

黄翅绢丝野螟气味受体基因GcaeOR10的鉴定及组织表达分析

为明确黄翅绢丝野螟Glyphodes caesalis气味受体基因GcaeOR10(GenBank登录号MW701397)的生物信息学特征及组织表达谱,使用生物信息学软件对其进行序列分析,并通过实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qPCR)技术检测其在黄翅绢丝野螟成虫不同组织中的表达量。结果显示,黄翅绢丝野螟GcaeOR10基因开放阅读框（open reading frame,ORF）全长为1 200 bp,编码399个氨基酸残基,预测其编码的蛋白质分子量为45.67 kD,等电点为8.65,无信号肽,具有昆虫气味受体家族7个跨膜蛋白（7 transmembrane proteins,7tm-6）超家族的保守结构域,存在26个潜在的磷酸化位点,含有7个跨膜结构域,且N端位于细胞膜内,C端位于细胞膜外。黄翅绢丝野螟GcaeOR10与桑螟Glyphodes pyloalis的GpylOR17亲缘关系最近,其次与松蛀螟Conogethes pinicolalis的CpinOR39、CpinOR36和桃蛀螟Conogethes p...     

禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的克隆、分子特性和表达分析

为探究禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi (Linnaeus)水通道蛋白基因RpAQP1的序列特征及其在不同龄期的表达,利用RT-PCR和RACE技术克隆了RpAQP1基因的cDNA全序列,采用生物信息学软件分析了RpAQP1编码蛋白的特性,利用qRT-PCR分析了RpAQP1在不同龄期的表达量。结果显示:禾谷缢管蚜水通道蛋白基因RpAQP1的cDNA全长为1 216 bp,其750 bp的开放阅读框编码250个氨基酸,蛋白分子量为27.36 kD。RpAQP1属于水通道蛋白亚家族DRIP(果蝇内嵌蛋白Drosophila integral protein)的一员,具有6个跨膜区,2个保守的NPA结构单元和1个压缩区域Ar/R;qRT-PCR结果显示,RpAQP1在整个发育历期均有表达,其在2龄若蚜中表达水平最高,是成蚜表达量的1.432倍;在4龄若蚜中表达量最低,为成蚜表达量的0.444倍,显著低于其它龄期,而其余各龄期RpAQP1表达量无显著差异。     

小菜蛾Toll-6基因的克隆及功能分析

为探究Toll-6基因在小菜蛾Plutella xylostella先天免疫中的功能,对克隆鉴定的Toll-6基因序列进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR检测Toll-6基因的时空表达模式及微生物侵染响应模式,体外验证其在微生物结合、病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）结合和细菌凝集等方面的功能。结果表明：Toll-6基因全长2 313 bp,编码770个氨基酸,预测Toll-6蛋白具有富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats,LRR）胞外区、跨膜区和Toll/白介素-1受体同源（Toll/interleukin-1 receptor homologous,TIR）胞内等典型Toll受体家族特征;Toll-6基因在不同发育阶段及不同组织中均有表达,其中成虫期表达量最高,4龄幼虫期次之,在4龄幼虫中肠表达量最高;此外,苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis菌株Bt8010侵染小菜蛾4龄幼虫6 h后,Toll-6基因表达被显著抑制,而黏质沙雷氏菌Serratia marcesc...     

棉铃虫类肌钙蛋白基因的克隆、原核表达纯化及其时空表达谱分析

为探索棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)类肌钙蛋白基因HaCal的生理功能及其所编码蛋白的生物特性,采用PCR方法克隆了HaCal的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,借助在线软件对其进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达和纯化其编码的蛋白,并通过实时荧光定量PCR技术分析其在棉铃虫不同发育龄期和组织中的表达量。结果显示,HaCal的ORF序列长度为564 bp,编码187个氨基酸,理论分子量为20.52 kD,理论等电点为7.64。其保守结构域与Calponin家族一致,但不含跨膜区和信号肽,系亲水性蛋白。原核表达结果显示,融合蛋白大小与理论值一致,纯化获得了纯度较高的目的蛋白。HaCal在棉铃虫幼虫不同发育阶段和不同组织中均有表达,在6龄幼虫体内表达量最高,是1龄幼虫的2.34倍;在5龄幼虫中肠中表达量最高,是头部的257.14倍。表明棉铃虫类肌钙蛋白基因HaCal可能与棉铃虫的生长发育过程密切相关。     

粘虫生物钟timeless基因的克隆及时空和昼夜表达分析

为明确生物钟timeless基因对粘虫Mythimna separata迁飞、交配等周期性活动的调节作用,利用PCR技术克隆了粘虫timeless基因,命名为Mstim,采用生物信息方法分析其序列特征,使用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同发育阶段、组织及昼夜的表达特征。结果表明,Mstim的c DNA全长为3 132 bp,编码1 043个氨基酸,其预测的蛋白质Ms TIM分子量为117 k D,等电点5.14,具有timeless保守的PIS、NLS等结构域,与甜菜夜蛾Spodoptera exigua及棉铃虫Helicoverpa armigera的氨基酸序列相似性高达97%。荧光定量PCR结果显示成虫期的Mstim表达量最高,卵期和蛹期次之,6龄幼虫的表达量最低;在雌、雄蛾中均以触角及头部中的表达量较高,飞行肌、足及生殖腺中的表达量较低。粘虫雌、雄蛾触角中Mstim的昼夜表达模式相似,均为光期表达量低于暗期,光期5 h的表达量最低,光期末期逐渐升高,至暗期后3 h达到最高值,暗期末期表达量开始下降。说明Mstim基因在粘虫中的表达不仅具有发育时期和组织的时空特异性,而且表现出明显的昼夜特性,推测其可能参与粘虫生长发育和迁飞与生殖等行为、生理节律的调节。