抗玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备及ELISA检测试剂盒的研制

制备并鉴定抗玉米赤霉烯酮(ZEN)单克隆抗体杂交瘤细胞株,研制检测谷物中ZEN的ELISA检测试剂盒。将ZEN肟化成ZEN-6-CMO,ZEN-6-CMO在DCC与NHS作用下与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)偶联合成完全抗原。以ZEN-6-CMO-BSA为抗原,免疫BALB/c小鼠,用ELISA筛选并建立分泌抗ZEN抗体的杂交瘤细胞株。测定单抗免疫球蛋白亚类、单抗效价及特异性。在ZEN单克隆抗体(Z9C3)的基础上,用间接竞争ELISA研究试剂盒的各项指标。试验结果表明:建立了2株稳定分泌抗ZEN抗体的杂交瘤细胞株(Z9C3和Z7E6),该细胞株所分泌的单隆抗体Ig亚类均为IgG1,ELISA检测结果表明:抗ZEN抗体可与ZEN发生特异性反应,IC50为3ng/mL和1.3ng/mL,该抗体与玉米赤霉醇(ZEL)的交叉反应分别为15.9%和9.8%。试剂盒最低检出质量浓度为0.5ng/mL,标准曲线的线性范围为0.5～50ng/mL;对玉米和小麦的平均添加回收率分别是92.5%和91.7%,变异系数分别是8.5%和10.5%。     

盐酸克伦特罗单克隆抗体的制备及检测方法的初步建立

选择一种新型载体阳离子化牛血清白蛋白（CBSA）与半抗原盐酸克伦特罗（CL）进行偶联．鉴定后作为免疫原免疫Balb／C小鼠，同时以卵清白蛋白（OVA）与CL偶联制备筛选抗原。应用杂交瘤细胞融合技术筛选后获得了1株稳定分泌抗CL单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2H5。抗体的亚类为IgM，腹水及细胞上清间接ELISA效价分别为1：20480和1：320，通过竞争阻断实验证明其具有良好的特异性及敏感性，将半抗原经酶标后应用竞争ELISA方法初步建立了CL的检测方法，检测限可达1ng／mL，为进一步制备CL残留检测试剂盒打下了基础。     

洛克沙胂完全抗原的制备及其单克隆抗体的研制

本研究以洛克沙胂(ROX)的结构类似物3-氨基-4-羟基苯胂酸(HAPA)为小分子半抗原,采用碳二亚胺法,分别将其与载体蛋白——牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原HAPA-BSA和检测抗原HAPA-OVA。经紫外光谱扫描及聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后,以20μg/只剂量的HAPA-BSA免疫BALB/c小鼠;选择血清效价高、敏感性强的小鼠,取脾脏进行细胞融合,制备杂交瘤细胞株。利用间接ELISA法筛选得到1株可以稳定分泌抗ROX单克隆抗体的细胞株,命名为G12;间接ELISA法测定其细胞上清效价为1:512,间接竞争ELISA测定其半数抑制浓度IC_(50)为3.147 ng/μL。经小鼠体内诱生腹水,辛酸-硫酸铵法纯化获得纯度较高的单克隆抗体,间接ELISA测定其效价为1:102 400,IC_(50)为1.433 ng/μL,且具有良好的特异性。本试验成功合成了ROX人工抗原,并制备了可以分泌高敏感性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,为ROX免疫学快速检测方法的建立奠定了基础。     

牛γ-干扰素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

建立牛结核病的γ-干扰素(BovIFN-γ)免疫学检测方法。本研究利用rBovIFN-γ抗原免疫Balb/c小鼠,经5次免疫后,通过淋巴细胞杂交瘤技术及间接ELISA筛选制备抗BovIFN-γ的单克隆抗体,在McAb及多克隆抗体的基础上建立双抗体夹心ELISA,并进一步优化ELISA反应条件。结果表明,获得一株能稳定分泌抗BovIFN-γ McAb的杂交瘤细胞株A12E9,分泌单克隆抗体腹水效价为1∶107,属于IgG1亚类,具有良好的特异性;所建立的双抗体夹心ELISA方法,BovIFN-γ最低检测限为40 ng/mL,与其他蛋白不发生交叉反应,表现出良好的特异性。该方法为建立牛结核病的γ-干扰素诊断方法奠定了基础。     

雌二醇单克隆抗体制备及间接竞争ELISA检测方法的建立

为建立敏感、特异、快速的雌二醇（estradiol,E₂）残留免疫检测方法,本研究利用雌二醇人工抗原（E₂-BSA）免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备特异性雌二醇单克隆抗体,利用高效价、高特异性单克隆抗体建立间接竞争ELISA（icELISA）方法。结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗雌二醇抗体的杂交瘤细胞株（3H3）,抗体效价可达1∶320 000,利用3H3腹水抗体优化间接竞争icELISA反应条件,检测抗体的敏感度,IC₅₀为1.636 ng/mL,IC₂₀~IC₈₀线性范围为0.202~13.281 ng/mL。雌二醇腹水抗体与雌三醇、乙炔雌二醇的交叉反应率分别达0.31%和0.25%,而与雌酮、戊酸雌二醇、苯甲酸雌二醇、炔雌醚、己烯雌酚、壬基酚的交叉反应率均<0.1%。结果表明,利用本研究制备的单克隆抗体建立雌二醇间接竞争ELISA检测方法,可满足食品中雌二醇残留高灵敏度的检测要求。     

抗黄曲霉毒素M1单克隆抗体的制备及定量ELISA方法的建立

采用黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白偶联物免疫8周龄BALB/c小鼠,4次免疫后,使小鼠产生免疫应答.取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合、筛选,最终获得1株能稳定分泌抗黄曲霉毒素M1的杂交瘤细胞株系.其染色体平均计数为90±10对,间接ELISA检测该株系培养上清的效价为1:6 400,纯化腹水效价为5 000×27.与黄曲霉毒素M1及其结构类似物黄曲霉毒素B1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的反应率分别为100%、7%、0%.经传30代后.抗体效价稳定.并在此基础上建立了间接竞争ELISA检测方法,该方法的最低检出浓度是0.08 ng/mL,校正曲线的线性范围为0.08 ng/mL～ 5 ng/mL.该方法的加标回收率为80.0%～128.3%.     

犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定

为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。     

庆大霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

本研究采用碳二亚胺法将庆大霉素与载体蛋白偶联形成完全抗原,用基质辅助激光解吸/电离质谱进行了表征.以人工抗原免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤技术获得了分泌抗庆大霉素单克隆抗体并能稳定传代的杂交瘤细胞株,建立了庆大霉素间接竞争ELISA检测方法,其线性检测范围为0.1～5 ng/mL,半数抑制浓度(IC50)为0.8 ng/mL,与其他化合物的交叉反应率小于0.01%.按药典剂量给患乳房炎奶牛肌肉注射庆大霉素注射液,不同时间段采集牛奶样品,按本研究建立的竞争ELISA方法测定了牛奶中的庆大霉素残留量.     

抗马动脉炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备

为制备抗马动脉炎病毒(EAV)衣壳蛋白(N)的单克隆抗体(MAb),本研究通过原核表达重组N蛋白,纯化后免疫6周龄雌性BALB/c小鼠,细胞融合后经间接ELISA筛选获得两株能够稳定分泌抗EAV N蛋白的杂交瘤细胞株,MAbs亚型鉴定为IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,这两株杂交瘤细胞分泌的MAb均能够识别EAV。EAV N蛋白MAb的制备,为EAV血清学检测方法的建立奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

氨基脲人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备

目的合成氨基脲人工抗原并制备其多克隆抗体。方法以氨基脲(SEM)和对醛基苯甲酸(CP)为原料合成半抗原(CP-SEM),并采用碳化二亚胺法和混合酸酐法将其分别与牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)偶联,合成氨基脲人工抗原。以氨基脲人工抗原(CPSEM-BSA)为免疫原免疫Balb/c小鼠,利用间接ELISA法测定其抗体效价。结果经薄层层析、红外光谱和元素分析等方法鉴定合成半抗原即为CP-SEM。紫外扫描、聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明人工抗原合成成功。免疫获得抗氨基脲的多克隆抗体,其抗体效价为1:64000。结论氨基脲人工抗原合成成功,并获得抗氨基脲的多克隆抗体。     

Development of a monoclonal antibody against deoxynivalenol for magnetic nanoparticle-based extraction and an enzyme-linked immunosorbent assay

Monoclonal antibody (mAb, NVRQS-DON) against deoxynivalenol (DON) was prepared. DON-Ag coated enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and DON-Ab coated ELISA were prepared by coating the DON-BSA and DON mAb. Quantitative DON calculation ranged from 50 to 4,000 ng/mL for DON-Ab coated ELISA and from 25 to 500 ng/mL for DON-Ag coated ELISA. 50% of inhibitory concentration values of DON, HT-2, 15-acetyl-DON, and nivalenol were 23.44, 22,545, 5,518 and 5,976 ng/mL based on the DON-Ab coated ELISA. Cross-reactivity levels of the mAb to HT-2, 15-acetyl-DON, and nivalenol were 0.1, 0.42, and 0.40%. The intra- and interassay precision coefficient variation (CV) were both <10%. In the mAb-coated ELISA, mean DON recovery rates in animal feed (0 to 1,000 µg/kg) ranged from 68.34 to 95.49% (CV; 4.10 to 13.38%). DON in a buffer solution (250, 500 and 1,000 ng/mL) was isolated using 300 µg of NVRQS-DON and 3 mg of magnetic nanoparticles (MNPs). The mean recovery rates of DON using this mAb-MNP system were 75.2, 96.9, and 88.1% in a buffer solution spiked with DON (250, 500, and 1,000 ng/mL). Conclusively we developed competitive ELISAs for detecting DON in animal feed and created a new tool for DON extraction using mAb-coupled MNPs.     

Characterization of specific antibodies and the establishment of sandwich ELISA and ELISPOT systems for swine IL-4

We produced four monoclonal antibodies (mAb) and two polyclonal antibodies using the purified cytokine expressed in bacteria and characterized them. Specific binding of each of the mAb and polyclonal antibodies to recombinant swine IL-4 (rSwIL-4) purified from Escherichia coli and baculovirus was demonstrated in an indirect ELISA and/or in western blotting. We established a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring concentration of SwIL-4 in biological samples and established an enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for detecting IL-4-secreting cells using a mAb and a polyclonal IgG from goat. The detection limit of the sandwich ELISA for SwIL-4 was 78 pg/ml. Using sandwich ELISA, SwIL-4 was detected in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of pigs experimentally infected with Mycoplasma hyopneumoniae and could quantitate in supernatants of mitogen-stimulated PBMC culture. The ELISPOT system is useful for the detection of IL-4 producing cells in swine PBMC culture.     

苯乙醇胺A单克隆抗体的研制及ELISA检测方法的建立

为制备苯乙醇胺A(phenylethanolamine A,PA)单克隆抗体,建立一种针对苯乙醇胺A的快速、简便、灵敏度高的检测方法,本试验采用重氮化法将制备的苯乙醇胺A衍生物分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)进行偶联作为免疫原和包被原。利用弗氏佐剂充分乳化免疫原(PA-BSA),按常规免疫程序免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,选择血清抗体效价较高的小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞以PEG法进行细胞融合。结果显示,经3次细胞亚克隆筛选后,最终筛选出一株可稳定分泌抗苯乙醇胺A单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为D6H8,利用此细胞以小鼠体内诱生法制备抗体。经鉴定,D6H8腹水抗体亚型为IgG1,轻链为κ链;纯化后的抗体与沙丁胺醇、盐酸克伦特罗、盐酸异丙肾上腺素和盐酸去氧肾上腺素均无明显的交叉反应(CR<0.18%),表明该抗体特异性良好。利用此抗体建立针对苯乙醇胺A药物残留检测的间接竞争ELISA方法,结果表明,腹水抗体效价为1∶12 800,猪肉中苯乙醇胺A添加浓度在5～1 000 ng/mL时线性关系良好,标准工作曲线为y=0.3861x-0.1845 (R^2=0.990),其IC₅₀为58.88 ng/mL,LOD为3.83 ng/mL,回收率在85.96%～104.32%之间。综上所述,本试验成功建立了检测苯乙醇胺A药物残留的间接竞争ELISA方法,该方法灵敏度高、稳定性较好。     

牛γ-干扰素ELISA检测方法的建立与初步应用

以纯化的rHis-BoIFN-γ制备兔多抗血清,辛酸—硫酸铵两步法对体内诱生的抗rBoIFN-γ单抗腹水进行纯化,用美洲商陆素（Pokeweed mitogen,PWM）刺激奶牛全血产生的分泌性天然BoIFN-γ筛选出与之反应最佳的单抗5E11。将单抗5E11以40μg/mL浓度包被,与1∶3 000倍稀释的兔抗rHis-BoIFN-γ多抗血清（13.8μg/mL）配对,以1∶6 000稀释的商品化酶标羊抗兔IgG为指示抗体,建立了BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法,该方法可以检出2.56 U/100μL（30.5 pg/100μL）的rHis-BoIFN-γ、8U/100μL的rBac-BoIFN-γ和1U/100μL的分泌性天然BoIFN-γ。以商品化试剂盒作为平行对照,将获得的奶牛临床检测血浆样品使用BoIFN-γ抗原捕获ELISA法进行检测,结果显示两种方法检测符合率达到83.9%。本研究建立的BoIFN-γ抗原捕获ELISA检测方法可有效检测分泌性IFN-γ,为进一步开发BoIFN-γELISA检测试剂盒奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定

旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p54蛋白的特异性单克隆抗体。本研究利用大肠杆菌表达系统表达p54蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。利用纯化的p54蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA方法筛选获得阳性杂交瘤细胞。经4次亚克隆后,取杂交瘤细胞上清进行单克隆抗体亚型鉴定,利用体内诱生法制备单克隆抗体并进行纯化。间接ELISA方法检测单克隆抗体的效价,利用交叉反应性试验、间接免疫荧光试验和蛋白印迹对所获单克隆抗体的特异性进行鉴定。根据预测的p54蛋白二级结构,采用逐步截短法分析鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域,并在p54的三级结构中进行标注。结果显示：成功筛选了6株分泌p54单克隆抗体的杂交瘤细胞,分别命名为28G12-1、31G7-1、31G7-2、35F10-1、35F10-2、38D3-1。其中28G12-1、31G7-1、31G7-2重链为IgG2a型,35F10-1、35F10-2、38D3-1重链为IgG1型;轻链均为κ链。单克隆抗体的最低效价为1∶25 600,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒、猪细小病毒、猪急性腹泻综...     

Surfactant proteins in bronchoalveolar lavage fluid of horses: assay technique and changes following road transport

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for equine surfactant proteins SP-A and SP-D in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Anti-equine SP-A or SP-D monoclonal antibodies (mAb) were produced by hybridoma technology, purified by the antibody purification reagent, and analysed by Western blotting analysis. The immunoreaction (two-site sandwich ELISA) with a mAb, peroxidase-labelled mAb and BALF sample was carried out simultaneously and analytical recovery and precision were assayed. Six mAb for SP-A and four mAb for SP-D were successfully cloned in limiting dilution to monoclonality. These mAb were reacted with equine SP-A or SP-D on Western blotting analysis. For SP-A, a combination of solid-phase TA08 and horseradish peroxidase (HRP)-conjugated WA28 was found to be more sensitive than other combinations, gave a good dose response and was capable of measuring 0.78 to 100 ng of protein/ml. For SP-D, a combination of solid-phase TD13 and HRP-conjugated WD19 was found to be more sensitive than other combinations, had a good dose response and was capable of measuring 0.78 to 200 ng of protein/ml. The assay was used to determine the effect of 41 hours of road transport on the concentrations of SP-A and SP-D in the BALF of 30 horses. The concentrations of SP-A and SP-D decreased by 55 per cent and 36 per cent, respectively, decreases similar to the decrease in phosphatidylglycerol concentration previously reported by the authors.     

克伦特罗单克隆抗体的研制及初步鉴定

为制备克伦特罗(clenbuterol,CL)单克隆抗体,鉴定其特性,采用重氮化法合成克伦特罗-人血清白蛋白(CL-HSA)作为免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术建立杂交瘤细胞株,利用体内诱生法制备单克隆抗体,用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗体效价和特异性.将细胞反复冻存和传代,考察稳定性.获得细胞株C611...     

传染性法氏囊病病毒VP2单克隆抗体夹心ELISA检测试剂盒的研制

为研制传染性法氏囊病病毒（IBDV）快速检测试剂盒,用重组IBDV-VP2蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞触合,获得3株稳定分泌抗VP2蛋白单克隆抗体（mAb）的杂交瘤细胞株,分别命名为1D11、2G8和2E5,抗体亚类分别为IgG1κ、IgG2bκ和IgG1κ。间接免疫荧光试验（IFA）证明,3株单抗均与VP2发生特异性反应。相加ELISA证明3株mAb识别VP2不同的抗原表位。在病毒中和试验中,1D11和2G8腹水对IBDV的中和效价分别为104和103,而2E5无中和活性。用亲和层析方法纯化1D11和2E5,分别作为包被抗体和标记抗体,建立了IBDV夹心ELISA检测方法,优化了试验条件,测定了其主要性能指标,对IBDV的最低检出量为102 TCID50/mL。用夹心ELISA、AGP和RT-PCR 3种方法同步检测8种试验样品,夹心ELISA与RT-PCR的检测结果一致,显著高于AGP方法。组装成的试剂盒,置于37℃保存7d、4℃保存6个月和-20℃保存24个月,其检测结果没有显著差异（P〉0.05）。     

SMD单克隆抗体的制备及测定方法的建立

用戊二醛作为偶联剂 ,将磺胺对甲氧嘧啶 (SMD )与牛血清白蛋白 (BSA )或卵清蛋白 (OVA)偶联形成完全抗原 ,经紫外分光光度计扫描鉴定。以人工抗原免疫BALB/c小鼠 ,取脾细胞与骨髓瘤细胞 (SP2 /0 -Ag1 4)融合 ,用间接ELISA联合竞争ELISA法筛选出产生针对SMD抗体的杂交瘤细胞。经克隆 ,得到 3株特异性好的阳性杂交瘤细胞 ,注入小鼠腹腔产生腹水。建立了测定SMD的ELISA法 ,其检测下限小于5ng/mL。