应用抑制性差减杂交技术构建副猪嗜血杆菌基因组差减文库

为构建副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)有毒力菌株SW124(血清4型)和无毒力菌株H465(血清11型)间的差异表达基因文库,采用抑制性差减杂交技术(Suppression subtractive hybridization,SSH)分析SW124和H465菌株细菌基因组的表达差异,并进行两轮差减杂交和两次PCR扩增,将第2次PCR产物与pMD19-T载体相连,转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞并进行文库扩增和蓝白斑筛选,RT-PCR鉴定差异表达文库。结果共获得327个阳性克隆,筛选100个克隆制备质粒进行PCR检测,均扩增出100～2 000 bp大小的片段。差异DNA差减文库的构建为进一步筛选、克隆HPS特异的未知新基因、建立分子鉴别新体系奠定了基础。     

转PPase基因对马铃薯块茎休眠特性的影响

利用农杆菌介导法将组成型表达启动子CaMV 35S驱动的正义和反义无机焦磷酸酶(PPase)基因导入到马铃薯栽培品种‘费乌瑞它’的试管薯中,通过PCR检测证明PPase基因已转入马铃薯基因组中.对转基因株系及对照植株块茎的休眠特性的测定表明,分别在4℃低温和25℃室温贮藏条件下的转反义基因马铃薯株系块茎的休眠期较对照株系均延长了2~3周;转正义基因马铃薯株系块茎的休眠期较对照株系均提前了2~3周;且在4℃低温贮藏条件下的转基因马铃薯株系及对照块茎的休眠期比25℃条件贮藏的长2~3周,为进一步利用PPase基因改良马铃薯块茎休眠特性提供科学依据.     

烟草液泡转化酶抑制子基因调控马铃薯块茎低温还原糖累积的研究

【目的】克隆烟草液泡转化酶抑制子基因，并在马铃薯中表达，从而抑制低温贮藏块茎还原糖积累，提高马铃薯加工品质。【方法】通过RT-PCR法分离Nt-VIF全长cDNA，转化马铃薯植株，PCR、Northern杂交和Southern杂交检测转基因植株，转基因植株块茎在低温和常温条件下贮藏30 d，分析转化酶活性与还原糖含量。【结果】克隆到Nt-VIF全长cDNA，35S调控下正向的Nt-VIF基因cDNA已经成功转入鄂马铃薯3号（E3）植株。转基因植株块茎在4℃和20℃贮藏30 d表明，VI活性受温度调节，高温贮藏块茎的VI活性显著低于低温贮藏的块茎，且高温条件下转基因块茎与对照无显著差异，而低温条件下转基因块茎的VI活性与对照相比下降幅度为22.7%（株系A-3）～78.1%（株系A-31）。转基因块茎还原糖（RS）含量在高温贮藏条件下与对照差异亦不明显，而低温贮藏条件下RS含量下降幅度为20%（株系A-17）～80.5%（株系A-30）。进一步分析还表明，转基因块茎低温贮藏其液泡转化酶活性与还原糖含量呈显著正直线相关（RS = 0.289VI + 0.0736）。【结论】Nt-VIF基因的表达显著抑制了马铃薯液泡转化酶活性，导致还原糖积累降低。     

影响马铃薯块茎低温糖化的植物激素相关基因的表达

对低温贮藏5 d的低温糖化不敏感品种‘华薯三号’和敏感品种‘中薯五号’马铃薯块茎进行转录组测序,通过对差异表达基因的生物信息学分析,获得与植物激素相关的差异表达基因,其中6个与植物激素合成或信号转导有关的差异表达基因与糖分解代谢密切相关。结果表明：KOox2和GA3ox1是马铃薯块茎中赤霉素合成的关键酶基因,赤霉素可刺激淀粉酶和转化酶活性,加剧块茎还原糖的积累,是马铃薯低温糖化的正调控因子;ANT和AIL6属于参与乙烯响应的AP2转录因子家族;BRI1和BKI1是油菜素内酯信号通路中的转录因子,两者互作共同拮抗14–3–3蛋白质活性;ANT、AIL6、BRI1和BKI1这4个转录因子通过负调控转化酶基因的表达而影响还原糖的产生,是马铃薯低温糖化的负调控因子。     

应用抑制差减杂交法分离粗枝大叶黄杨幼苗的冷诱导表达基因

 应用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）方法，构建冷诱导表达的正向抑制差减cDNA文库，低温处理的幼苗为tester，常温处理为driver，通过cDNA宏阵列差异筛选cDNA文库，得到604个低温诱导或表达增强的候选克隆，对其中的84克隆进行DNA测序，去除冗余的cDNA，在GenBank中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析，共有36个单一序列，有 12 个cDNA未找到同源序列，可能为新基因，表明采用抑制差减杂交方法与cDNA宏阵列技术分离诱导表达的基因是可行的。     

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定

为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。     

干旱胁迫下早稻幼苗特异性表达cDNA的筛选

以生长在特殊环境中（26℃、12h／12h光／暗周期、光强2500lx）的早稻297二叶一心期幼苗为材料，构建了干旱胁迫诱导表达差减文库。以干旱为处理，而有水状态为对照。通过筛选差减文库，共获得了141个克隆。分析表明，差减文库建立成功。     

茄子温敏单性结实抑制差减文库的构建与分析

 【目的】构建茄子单性结实差减文库,分离获得茄子单性结实相关基因,研究茄子单性结实形成的分子机制。【方法】以茄子单性结实品系D-10低温条件下无籽的子房和果实,以及适温条件下有籽的子房和果实为材料,采用抑制差减杂交（SSH）技术构建正向和反向差减文库。对阳性克隆测序、BLAST比对分析、GO（gene ontology）功能注释及分类和荧光定量PCR分析。【结果】正反向文库共获得了2 347个阳性克隆;测序、序列拼接后,共获得1 248个高质量的unigenes;将其与非冗余数据库BLAST比对后,有1 109个unigenes找到同源序列,139个unigenes无同源序列为新基因。1 248个unigenes中527个在GO数据库中有功能注释,其中细胞组分、分子功能和生物过程的unigenes分别为206、445和361条,分析表明,茄子单性结实果实的差异主要发生在细胞内部,单性结实性状的表达可能受到一些因子和激酶的调控。【结论】成功构建了茄子单性结实不同时期果实的抑制差减文库,获得3个可能与茄子单性结实相关的unigenes,包括MADS-box基因、雌蕊伸展相关蛋白和果实膨大相关基因。     

低温处理与常温凡纳滨对虾基因差异表达文库的构建及分析

[目的]筛选出对虾耐寒相关基因,为今后进一步研究对虾耐寒分子机理提供科学依据.[方法]利用SSH技术构建低温处理与常温凡纳滨对虾的基因差异表达文库,并通过斑点杂交、克隆测序分析及候选基因RT-PCR扩增等对差减获得的耐寒相关功能基因进行验证.[结果]在构建的正、负文库768个克隆中有152个为低温高表达克隆、331个为常温高表达克隆;将正文库100个克隆拼接可获得ESTs同源群39个,其中已知基因29个,主要涉及能量代谢、表达调控、信号传导、细胞免疫、抗细胞凋零、蛋白质加工及其他基因等;将负文库50个克隆拼接可获得ESTs同源群18个,其中已知基因17个,主要涉及细胞免疫、维持细胞代谢、物质转运、信号传导及其他基因等.经RT-PCR验证,从正文库中筛选出的HSPB1、NGT4和NGT7基因在低温条件下的表达量显著高于常温.[结论]综合运用SSH、斑点杂交、克隆测序和RT-PCR可有效筛选并验证凡纳滨对虾耐寒相关基因,为揭示对虾耐寒分子调控机制奠定基础.     

抑制消减杂交技术筛选鹅产蛋期差异表达基因

[目的]鉴定筛选鹅产蛋与就巢差异表达基因。[方法]应用抑制消减杂交技术构建鹅产蛋与就巢鹅卵巢组织双向cDNA文库,获得差异表达基因。[结果]从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签（ESTs）。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经Blast比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。[结论]比较就巢与产蛋SSH文库,发现产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多,而在就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高。该结果对进一步研究鹅卵泡发育及繁殖力分子标记筛选打下了基础。     

绒山羊生长期次级毛囊cDNA消减文库的构建及其序列分析

 【目的】构建绒山羊生长期次级毛囊的消减文库,寻找绒毛生长的相关候选基因。【方法】以生长期次级毛囊cDNA为tester,休止期次级毛囊cDNA为driver,利用抑制性消减杂交技术构建生长期次级毛囊消减文库并进行生物信息学分析。【结果】构建了具有高消减效率的cDNA文库。随机挑取20个阳性克隆进行PCR扩增,插入片段长度主要分布在250～1 000 bp之间。挑取750个克隆进行测序,得到342条有效序列,平均长度596 bp。进行同源性分析,有298个与nucleotide数据库山羊及其它物种的已知序列同源。在EST数据库中找到38个相似EST序列和6个无同源性序列。对298个已知功能基因的ESTs进行分类,细胞分裂类为13个、细胞信号类为49个、细胞结构蛋白52个、细胞防御类21个、代谢类46个、基因/蛋白表达类37个、未分类的80个。【结论】应用SSH技术,构建了绒山羊生长期和休止期次级毛囊差异表达基因的cDNA文库,为进一步筛选绒毛生长相关的候选基因奠定了基础。     

水杨酸诱导云烟85基因表达差减文库的构建及初步分析*

 利用水杨酸（SA）诱导烟草抗病相关基因表达,以此为目标样本,以清水喷施为对照样本,进行抑制差减杂交,构建烟草抗病基因表达文库。结果显示,插入片段主要集中在150～500bp之间。随机挑选12个克隆进行测序,结果有7条与已知的系统获得性抗病基因同源,1条与病程相关蛋白PR1a同源,1条与光系统II的促氧蛋白一个亚基有较高同源性,1条与水通道蛋白基因（aquaporin 1）同源, 1条与Ert13基因有关,1条未找到同源序列,是新的cDNA片段。     

细菌性条斑病菌JH01诱导水稻抗病均一化差减文库的构建

[目的]构建细菌性条斑病菌诱导下的水稻抗病均一化差减c DNA文库,对获得的差异表达ESTs进行生物信息学及抗病相关基因的表达分析。[方法]以水稻IR26(Tester)和两优培九(Driver)幼苗5~6叶期叶片为材料,采用双链特异性核酸酶(DSN)介导的均一化消减杂交技术,构建细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻抗病相关基因差减c DNA文库,以p LB-F和p LB-R为引物,通过菌液PCR扩增对差减文库的质量进行检测。[结果]c DNA文库的插入片段分布在0.5~2.0 kb,平均大小约为1.0 kb,重组率达95%。序列测定分析发现,随机挑取的504个克隆中有98条差异表达基因;经BLAST比对和GO注释发现,59条序列具有同源基因,分别参与信号转导、能量代谢、过敏性坏死反应、防卫反应等;另外39条序列无相似基因,有待进一步研究。通过实时荧光定量PCR发现,从该文库中分离得到的Os NDPK4参与细菌性条斑病菌JH01诱导的水稻防卫反应。[结论]水稻受细菌性条斑病菌侵染的c DNA文库质量较好,为研究条斑病菌致病性因子与水稻互作机制奠定基础。     

多花水仙花瓣抑制消减杂交cDNA文库的构建及分析

采用抑制消减杂交(SSH)技术,以多花水仙的栽培品种‘黄花水仙2号’黄色花瓣和‘金盏银台’白色花瓣的cDNA分别作为测试子和驱动子,建立正、反向抑制消减杂交cDNA文库.随机挑选正、反向文库各216个阳性克隆测序,对已知功能的uniESTs进行基因本体论(GO)分类分析,荧光定量PCR检测部分可能参与色素形成的uniESTs.结果表明:水仙花色差异表达正、反向消减文库经检验质量可靠,为分离花色形成相关基因奠定了基础;GO功能分类分析显示,水仙花色差异可能受到多个代谢途径的影响;经初步筛选得到11个与水仙花色形成相关的uniESTs,为进一步克隆基因全长和功能验证提供参考.     

陆地棉显性无腺体近等基因系SSH文库的构建

[目的]应用抑制性消减杂交技术构建差异表达cDNA消减文库。[方法]以显性无腺体中棉所12（显无中12）和中棉所12（中12）提取棉花总RNA,以显无中12为驱动子,中12为检测子,利用SSH法建立差异表达cDNA文库进行克隆,并以NestedPcRPrimer1和2R对插入片段进行PCR扩增,分别以显无中12和中12总cDNA为探针进行反向Northern杂交,筛选差异表达克隆,进行序列相似性分析。[结果]通过建立差异表达cDNA文库共获得2280个克隆,通过反向Northern杂交共筛选363个差异表达克隆,测序后得到299个质量合格的EST序列,共56个重叠群,91个单拷贝。这些EsT所涉及的基因,主要是与代谢和次生代谢调节、生物合成、细胞凋亡、信号传导等有关联的cDNAs。[结论]SSH文库的构建和分析为显性无腺体形成相关基因的克隆和结构功能研究奠定了基础。     

福美双诱发肉鸡胫骨软骨发育不良早期生长板消减cDNA文库的构建

 【目的】为应用cDNA芯片技术筛选肉鸡胫骨软骨发育不良(TD)时序性差异表达基因,本研究构建了早期生长板消减 cDNA文库。【方法】将7日龄AV肉鸡随机分为两组,对照组(control,C)饲以基础日粮,试验组(thiram diet-fed,T)饲以基础日粮添加福美双100 mg?kg-1,2 d后继续饲以基础日粮,诱发肉鸡TD。应用抑制消减杂交技术(SSH)构建正反向消减cDNA文库,用PCR验证两个文库中克隆的插入片段,随机抽取100个阳性克隆测序,对所测序列同源性分析和功能预测。【结果】从两个文库共获得2 227个有效阳性克隆,插入片段大小主要分布在200—1 000bp之间;所测序列中有97条ESTs与GenBank中的鸡基因序列同源性达到99%,且非冗余度达到68.7%;此外,有3条ESTs未找到同源序列。这些基因具有构成细胞外基质,参与软骨内骨化和骨的重构,调节骨发育,行使信号转导、血管发生,参与电子传递及能量代谢等功能。【结论】成功构建了消减 cDNA文库,将为进一步点制cDNA芯片,筛选不同阶段的差异表达基因奠定了基础,也为肉鸡TD机理研究提供新线索。     

贮藏温度对马铃薯块茎还原糖含量的影响

以马铃薯栽培品种 (系 )甘农薯 1号、甘农薯 2号、甘农薯 3号的块茎为试验材料 ,在 1 5～ 2 0℃、5～7℃和 4℃下分别贮藏 1 2 0 d,并将 5～ 7℃下贮藏 6 0 d和 4℃下贮藏 90 d的块茎分别转移到 1 5～ 1 6℃和 1 8～2 0℃的条件下保存 1 0 d和 2 0 d。结果表明 ,1 5～ 2 0℃下贮藏的块茎还原糖含量随贮藏时间的延长变化不大 ,在 5～ 7℃和 4℃下贮藏的块茎还原糖含量逐渐增加 ,当其转移到高温条件下 ( 1 5～ 1 6℃和 1 8～ 2 0℃ )保存 1 0d和 2 0 d后 ,块茎还原糖含量又呈下降趋势。不同品种还原糖含量的变化对温度的反应敏感程度不一样 ,在高温下还原糖逆转为淀粉的能力不同。甘农薯 1号具有较高的高温逆转能力