五味子的DNA提取及RAPD鉴定研究

采用CTAB、SDS、改良CTAB法对五味子总DNA提取进行研究,并对总DNA进行电泳分析和含量测定,结果表明以改良CTAB法提取五味子叶片DNA纯度最好,以此DNA为模板可获得条带清晰、重复性好的RAPD扩增结果。从14条重复性好的引物中共扩增出67条带,平均每个引物4.8个片段,多态性位点数为58,比例为86.6%。UPGMA聚类分析的结果与五味子形态学分类结果相似,10份五味子优系在遗传相似系数0.69处可划分为3个类群,该RAPD技术体系可以很好地用于10份五味子种质资源的鉴定。     

麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因真核表达载体的构建

将麻花鸡副黏病毒ZH-1株毒种接种于11日龄SPF鸡胚,收集48～96h死亡的鸡胚尿囊液.参考已发表的鸡源副黏病毒F基因序列,设计并合成了一对特异性引物,用以扩增麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因,预期扩增的F基因片段包含完整的开放阅读框.通过RT-PCR扩增出麻花鸡副黏病毒ZH-1株F基因片段,琼脂糖凝胶电泳回收、纯化,得到F基因片段,经EcoR I和Sal I消化,将F基因克隆进入PCI-neo载体,转化大肠杆菌DHSa,挑选菌落,经限制性核酸内切酶Sal I和EcoR I双酶切及PCR鉴定,结果证明重组真核表达载体PCI-neo-F构建成功,为下一步在哺乳动物细胞vero细胞中表达打下良好的基础.扩增的F基因测序后,与其他禽副黏病毒1型F基因进行系统发育树的分析比较,为阐明麻花鸡副黏病毒ZH-1株的遗传背景奠定了基础.     

表达禽流感HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

本试验首先用RT-PCR方法扩增出H9N2亚型禽流感病的HA基因,大小约1 700 bp,将其克隆到真核表达载体pcDNA中,并将该真核表达载体上的CMV启动子控制的含LacZ和HA基因表达盒克隆入马立克氏病病毒US2基因中,成功的构建了马立克氏病病毒的转移载体。然后,通过脂质体方法转染已感染马立克氏病病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过蓝斑筛选获得重组病毒。该重组病毒通过PCR方法鉴定证实其基因组中含有完整的HA基因。免疫酶反应和Western-blot证实重组病毒表达了禽流感HA蛋白,表达的HA蛋白具有血凝活性。     

H5亚型禽流感病毒HA基因在WISH细胞中的瞬时表达

在WISH细胞中,对H5亚型禽流感病毒HA基因进行了瞬时表达的研究。首先构建了真核表达质粒pVAX-H5HA,通过酶切和PCR筛选阳性克隆后测序。然后将重组表达质粒以脂质体介导法转染WISH细胞。通过RT-PCR在转录水平检测目的基因的表达,间接免疫荧光检测目的蛋白。结果表明,HA基因在WISH细胞中进行了表达。     

小鼠 Dazl 基因真核表达载体的构建及表达检测

为研究小鼠Dazl基因的功能及探究Dazl基因过表达在干细胞向生殖细胞分化过程中的作用,采用RT-PCR方法,从13．5 dpc 雌性胎鼠卵巢中克隆出Dazl基因的全部编码区,测序正确后利用限制性内切酶将其连接到真核表达载体pcDNA3．1上。线性化后对小鼠成纤维细胞进行转染,qRT-PCR及Western Blot 技术显示外源基因Dazl已经成功转染并表达。为研究Dazl基因的功能及干细胞向生殖细胞的诱导分化奠定了基础。     

H9N2亚型AIV HA基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达

[研究目的]利用杆状病毒表达系统表达AIV H9N2亚型HA基因以获得可以利用的HA蛋白;[方法]应用DNAStar软件,参照Genbank中注册的AIV H9N2亚型HA基因序列,设计了一对引物,用RT-PCR方法成功地扩增出带双酶切位点的H9亚型AIV的HA基因,通过BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点将H9HA基因插入转移质粒载体pFastbacHTa中,获得重组转移载体pFastbacHTa-H9HA并将其转化DH10 Bac细胞,与Bacmid发生位点特异性转座作用,得到重组穿梭载体Bacmid-H9HA,再将其转染昆虫细胞High Five,进行PCR鉴定、SDS-PAGE和Westem Blot检测;[结果]HA基因正确地插入到病毒基因组的多角体蛋白基因启动子下游,HA基因在High Five细胞中得到了表达,H9HA大小约为67 KD,而且表达的产物具有特异免疫学反应性;[结论]HA基因在昆虫细胞获得表达,为进一步生产检测H9N2亚型流感病毒的检测试剂或者构建亚单位疫苗奠定了基础.     

高抗体水平肉种鸡H9N2的分离鉴定及HA基因序列分析

从抗体水平较高、产蛋下降的种鸡群分离到一株具有血凝特点的病毒,经HI交叉抑制试验证实为H9N2病毒,命名A/Chicken/Shandong/LY/08,病毒对SPF鸡无致病性,IVPI为0。对其HA基因进行克隆测序,HA基因氨基酸裂解位点的基序为RSSR↓GL,与弱毒基序一致。A/chicken/Shandong/LY/08分离毒株与GenBank上发表的山东参考株HA基因的核苷酸之间的同源性为95.2%～99.6%,氨基酸序列之间的同源性为95.4%～99.5%。与国外A/ck/Korea/ms96/96、A/Parakeet/chiba/1/97和A/turkey/Wisconsin/1/1966 HA基因核苷酸序列同源性为82.6%～91.6%,氨基酸序列同源性为87.9%～92.2%。系统进化树分析表明,该毒株与近年来国内流行的H9N2禽流感毒株类似。     

一株商品肉鸡腺胃H9N2的分离鉴定及HA基因序列分析

从30日龄商品肉鸡腺胃分离到一株具有血凝特点的病毒,经HI交叉抑制试验证实为H9N2病毒,命名A/Chicken/Shandong/KD/09,病毒对SPF鸡无致病性,IVPI为0.对其HA基因进行克隆测序,HA基因氨基酸裂解位点的基序为RSSR↓ GL,与弱毒基序一致.A/chicke/Shandon/KD/09分离...     

禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定

为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T₀阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T₁叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T₃植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-...     

口蹄疫病毒3D基因真核表达载体pEGFP-3D的构建及其融合蛋白分子在BHK细胞中的定位

为研究口蹄疫病毒RNA聚合酶3D基因的分子生物学特性及定位,构建了3D基因真核表达载体pEGFP-3D,观察了3D在BHK-21细胞中的瞬时表达情况.从重组质粒pMDl8.T-3D扩增到3D基因,与pGEM-T easy载体连接,将鉴定为阳性的重组质粒pGEM-3D与表达载体pEGFP-N1分别经Barn H Ⅰ/Hind Ⅲ酶切,进行定向亚克隆;重组表达质粒pEGFP-3D经PCR、酶切鉴定.阳性质粒进行测序.利用脂质体介导阳性pEGFP-3D质粒转染BHK-21细胞.免疫组化检测转染细胞中3D基凶表达情况和3D基因在细胞中的定位,Western blotting验证pEGFP-3D融合基因的表达.结果表明,成功构建了重组表达质粒pEGFP-3D,并在BHK-21细胞中进行了表达.免疫组化分析表明,3D蛋白主要定位于细胞核;Western blotting证实pEGFP-3D融合蛋白在80 kDa处出现阳性条带,说明表达的外源蛋白具有免疫活性.pEGFP-3D表达载体转染细胞后很快就能通过观察荧光蛋白而检测出基因的瞬时表达情况,为基因转染研究中确定转染效率、3D的表达情况及蛋白定位等提供了直观的靶标,有望应用于FMDV聚合酶分子的生物学特性研究.     

H5N1亚型禽流感病毒HA基因DNA疫苗的构建和活体电击免疫试验初报

将高致病力禽流感病毒A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)的HA基因克隆到质粒pcDNA4/His鄄Max和pRc/CMV上得到真核表达质粒pC4H5和pCMVH5。将pC4H5和pCMVH5经活体电击和肌肉注射接种于3周龄SPF鸡的右腿内侧,并设空白质粒对照。二次免疫后第二周用104.2ELD50的同源病毒进行攻击。结果pC4H5和pCMVH5活体电击免疫SPF鸡能诱导产生持续表达的高水平特异性抗体,可产生100%的保护率,并能有效地阻止H5N1病毒攻击后病毒在泄殖腔的排出,而肌肉注射组和空白对照组在攻毒后全部发病并死亡。结果表明活体电击免疫是一条可以与基因枪免疫相媲美甚至优于基因枪免疫的有效免疫途径。     

左旋咪唑影响流感灭活疫苗（H9N2）抗体滴度

为了研究不同剂量的左旋咪唑对鸡流感病疫苗免疫效果的影响,将20只17龄雏鸡,随机分成A、B、C、D四组,每组5只。分别皮下注射H9N2灭活疫苗0.5ml/羽,同时给试验组A(0.6mg)、B(0.3mg)、C(0.15mg)剂量的左旋咪唑,D组不加。免疫后0d、7d、14d、21d和28d,翅下静脉采血检测抗H9N2亚型禽流感病毒抗体滴度。结果表明,给药组的抗体水平都明显高于对照组;不同给药剂量的组别的抗体水平也存在差别,高、中剂量A、B组抗体水平基本一致,却明显低于低剂量组D。这表明左旋咪唑影响H9N2流感病毒疫苗抗体滴度,低剂量(0.15mg)添加左旋咪唑,可提高疫苗的抗体水平。     

抗H5亚型AIV血凝素单克隆抗体的制备及亚型鉴定

制备抗H5亚型AIV血凝素单克隆抗体;依据淋巴细胞杂交瘤技术,用纯化的H5N1亚型AIV和重组噬菌体T4-H5HA免疫Balb/C小鼠,细胞融合后用ELISA方法筛选特异性单克隆抗体;获得6株抗H5亚型AIVHA的特异性单克隆抗体H5-01（1E6）、H5-02（2C2）、H5-03（2A8）、H5-04（2G6）、H5-05（2E9）和H5-06（3F6）。各株单抗亚型测定的结果为：H5-01、H5-02为IgG1,H5-03、H5-04为IgG2a,H5-05、H5-06为IgG2b,轻链的亚型均为kappa链;经特异性和与同型病毒的反应谱检测,6株均是抗H5亚型AIVHA特异性单克隆抗体,为进一步分析H5N1亚型AIV的结构与功能以及建立监测该亚型AIV的试剂盒奠定了基础。     

H7N7亚型禽流感病毒血凝素B细胞和Th细胞表位预测及初步鉴定

摘　要 　目的 预测H7N7亚型禽流感病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)B细胞和Th细胞相关抗原表位,并对所获表位的抗原性进行初步鉴定。方法 根据禽流感流行趋势,从GeneBank下载H7N7禽流感病毒HA氨基酸序列,使用生物信息学方法,对所下载序列进行预测与分析,获得H7N7亚型禽流感病毒血凝素B细胞和Th细胞相关抗原表位。通过H7亚型禽流感病毒阳性血清,初步验证所选表位抗原性。结果 获得了5个H7N7亚型禽流感病毒候选B细胞和Th细胞表位,经过间接ELISA方法分析,其中HA165~178,HA180~193,HA241~255表序列相对保守,与流行的H7N7亚型禽流感病毒HA相应区域具有较好的一致性,同时具有与H7型禽流感病毒阳性血清抗体结合能力,预示了其成为功能表位的可能。结论 所筛选的表位具有成为H7N7亚型禽流感病毒HAB细胞和Th细胞相关抗原表位的可能,为H7N7亚型禽流感表位疫苗的研究奠定基础。     

葱乙醇提取物对小鼠免疫功能的影响

摘 要：【目的】本研究利用流式细胞术、DTH法和LDH法探讨葱乙醇提取物对小鼠特异性和非特异性免疫的影响,为调节动物免疫状态和改善机体防御能力提供试验依据。【方法】将昆明种小鼠随机分为环磷酰胺组（C）、环磷酰胺+葱乙醇提取物组（C+A）、葱乙醇提取物组（A）和生理盐水组（S）。环磷酰胺皮下注射造成小鼠免疫抑制;C+A 组和A组给小鼠葱乙醇提取物连续灌胃35 d;S组灌服等量生理盐水。观察测定临床症状、免疫器官指数、细胞免疫功能、体液免疫功能和非特异性免疫功能。【结果】结果显示,葱乙醇提取物可以提高免疫器官指数;对免疫抑制小鼠的左右耳重量差、CD4+/CD8+值、血清抗体和巨噬细胞吞噬活性都有促进作用,对正常小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬活性和NK细胞活性有促进作用。【结论】结果表明,葱乙醇提取物对小鼠的特异性免疫和非特异性免疫功能具有显著的调节作用。     

H2O2和Ce(NO3)3·6H2O对棉花幼苗抗低温效应的影响

试验分析了H2O2(双氧水)和Ce(NO3)3.6 H2O(硝酸铈)浸种对棉花幼苗抗低温效应的影响。通过对幼苗长度、根系活力、POD(过氧化物酶)活性、CAT(过氧化氢酶)活性和PrO(脯氨酸)含量的测定,结果显示:H2O2和Ce(NO3)3.6 H2O混合液对棉花幼苗抗低温效应有比较显著的影响,其中以0.50 mmol/L H2O2 35μg/ml Ce(NO3)3.6 H2O混合液效果最佳。