检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定

 大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)和黑白轮枝菌（V. albo-atrum）在世界范围内引起多种作物的黄萎病,属于我国重要进境植物检疫对象。本研究对采自我国部分地区和CBS保存的多种植物病原性轮枝菌,包括黑白轮枝菌、大丽轮枝菌及其变种大丽轮枝菌长孢变种(V. dahliae var. longisporum)、三体轮枝菌(V. tricorpus)、变黑轮枝菌(V. nigrescens)和云状轮枝菌(V. nubilum),采用生物学特性观察,结合rDNA-ITS序列分析的方法,进行了比较和分析。结果表明：不同种类轮枝菌在休眠结构形态上具有一定差异,部分菌株不产生任何休眠结构。各供试菌株在15～25℃范围内均可生长,但黑白轮枝菌在30℃下生长受到强烈抑制,而其他菌株受影响较小。对供试菌株rDNA-ITS序列分析结果表明植物病原性轮枝菌可聚为9个分支,包括三体轮枝菌、变黑轮枝菌、云状轮枝菌、V. theobromae、大丽轮枝菌、大丽轮枝菌长孢变种和3个不同的黑白轮枝菌分支,黑白轮枝菌、大丽轮枝菌及其长孢变种亲缘关系较近。采用生物学性状结合rDNA-ITS序列分析能够更加有效地将两种检疫性轮枝菌从其他植物病原性轮枝菌中区分出来。     

甜瓜种子携带的镰刀菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到23个镰刀菌分离物。采用形态观察和分子生物学方法对其进行鉴定,并研究其致病性以及对甜瓜种子发芽的影响。通过观察菌落形态和色素颜色,以及大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形态,同时分析ITS-rDNA序列和翻译延伸因子-1α(TEF-1α)基因序列,以确定真菌分离物的分类属性。结果表明,4个分离物为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),5个分离物为层生镰刀菌(F. proliferatum),5个分离物为木贼镰刀菌(F. equiseti),9个分离物为轮枝样镰刀菌(F. verticillioides)。这4种镰刀菌均对甜瓜幼苗有致病性,其分生孢子悬浮液对甜瓜种子发芽有抑制作用。这是我国首例开展甜瓜种子携带致病性镰刀菌的研究报道。     

甜瓜种子携带的镰刀菌种类鉴定及其致病性研究

 采用洗涤检验法和马铃薯葡萄糖琼脂培养基法,从甜瓜种子上分离得到23个镰刀菌分离物。采用形态观察和分子生物学方法对其进行鉴定,并研究其致病性以及对甜瓜种子发芽的影响。通过观察菌落形态和色素颜色,以及大型分生孢子、小型分生孢子和厚垣孢子形态,同时分析ITS-rDNA序列和翻译延伸因子-1α(TEF-1α)基因序列,以确定真菌分离物的分类属性。结果表明,4个分离物为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum),5个分离物为层生镰刀菌(F. proliferatum),5个分离物为木贼镰刀菌(F. equiseti),9个分离物为轮枝样镰刀菌(F. verticillioides)。这4种镰刀菌均对甜瓜幼苗有致病性,其分生孢子悬浮液对甜瓜种子发芽有抑制作用。这是我国首例开展甜瓜种子携带致病性镰刀菌的研究报道。     

环介导等温扩增技术检测大丽轮枝菌

 本研究基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP),通过比对分析大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)与其相近种不同靶标序列间的差异,选取Gpd(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因作为靶标基因,设计并筛选了四条特异性强、灵敏度高的LAMP引物和两条环引物,建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的大丽轮枝菌的检测方法,并进行了特异性、灵敏度实验及田间发病组织的检测。该方法在62 ℃等温条件下进行核酸扩增反应70 min,扩增前加入染料HNB(羟基萘酚蓝),反应后根据染料颜色变化判定扩增结果。特异性试验中,仅含有大丽轮枝菌菌株DNA的反应管扩增后呈天蓝色的阳性反应,而其他供试菌株均呈紫色的阴性反应。该方法的最低检测限为100 pg·μL^-1,在土壤中检测的灵敏度为10个孢子/0.25g土壤。该技术能够检测出棉花发病组织中的目标菌,对采自江苏和山东的24份疑似病害样本进行检测,11份为阳性。该方法的建立为大丽轮枝菌的检测及其所致病害的诊断提供了新的技术。     

宁夏马铃薯黄萎病病原菌分离鉴定及寄主范围测定

 为明确引起宁夏马铃薯黄萎病病原菌种类,本试验通过常规组织分离法对采自宁夏马铃薯主栽地区固原和西吉的27株马铃薯黄萎病标样进行了分离,共获得11株分离物。采用形态学并结合肌动蛋白(ACT)、延伸因子-1α(EF1α)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、色氨酸合成酶(TS)的多基因系统发育分析方法,11株分离物均被鉴定为非苜蓿轮枝菌(Verticillium nonalfalfae)。致病性测定结果表明,该轮枝菌能够侵染马铃薯植株幼苗并引致典型的黄萎病症状。非苜蓿轮枝菌对茄科、菊科、豆科、十字花科、葫芦科和锦葵科等6科13种双子叶作物的致病性测定结果表明,其对西葫芦、黄瓜、茄子、烟草、豇豆、棉花和向日葵的致病性强,对番茄、辣椒、生菜和白菜致病力弱且发病缓慢,对西蓝花和苜蓿无致病性。     

河南省玉米茎基部镰刀菌的形态和分子鉴定

 为明确河南省玉米茎基部镰刀菌(Fusarium spp.)的种群组成及分布, 2011和2012年, 我们采集了河南省14个地市42个县(区)的玉米茎基腐病病样, 分离得到163个镰刀菌单孢菌株。首先对菌株进行了形态学鉴定, 在此基础上使用镰刀菌种特异性引物进行了PCR检测;对于部分PCR检测未能确认的菌株进行了Translation elongation factor 1-α(TEF-1α)基因片段测序及BLAST分析, 最终将163个菌株鉴定到种。结果表明在163个菌株中, 禾谷镰刀菌F. graminearum为优势种, 占44.2%(72株), 其次为层出镰刀菌F. proliferatum和轮枝镰刀菌F. verticillioides, 分别占28.8%(47株)和27.0%(44株)。豫西北的焦作(47.6%)、洛阳(50.0%)及豫中的许昌(45.5%)均以F. verticillioides为主, 豫东的商丘(42.9%)、开封(57.1%)以F. proliferatum为主, 豫北的安阳(66.7%)、濮阳(71.4%)、新乡(62.5%)和豫南的南阳(57.1%)、驻马店(45.0%)以及中部的郑州(57.1%)、漯河(66.7%)则均以F. graminearum为优势种。     

甘肃玉米穗腐病样品中轮枝镰孢菌的分离鉴定及生物学特性

 为了明确甘肃玉米穗腐病的病原种类, 于2009年9月在甘肃省四大生态区采集玉米穗腐病样品, 以组织分离法进行病原物的分离培养, 对分离得到的镰孢菌菌落进行纯化和单孢分离后, 以形态学为基础, 参照Leisle分类系统进行鉴定。结果表明:共分离到271株镰孢菌菌株, 其中以轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)和黄色镰孢菌(F. culmorum)出现频率高, 属优势种。按照柯赫氏法则对沈单16和金穗96832进行致病性测定, 证实了轮枝镰孢菌对玉米果穗的致病性。选取2株轮枝镰孢菌菌株进行EF-1α(tef) 基因序列分析, 将PCR产物回收测序后在GenBank上比对, 菌株GSLT4-3-2与GenBank中登记的轮枝镰孢菌FN179339、FN179345和FN179338;GSTS24-2-1与轮枝镰孢菌FN179343、FN179346、FN179340、FN179344和 FN252384亲缘关系最近, 序列同源性达100%。轮枝镰孢菌GSYC17-2-1的生长温度范围为15～35℃, 最适温度为28℃, pH 值为8;菌落在pH值为4～10的培养基上能够迅速扩展, pH值为7时产孢量最大;碳源对轮枝镰孢菌菌丝生长影响相对稳定, 而氮源对其营养生长影响的变幅较大;完全黑暗条件下, 菌丝扩展最快, 12 h光暗交替对产孢量有明显的促进作用;病原菌菌丝致死温度为70℃, 10 min。     

中国七省(自治区)马铃薯黄萎病病情及优势病原菌致病力分析

 2013-2016年,对我国内蒙古、河北、甘肃、黑龙江、山西、宁夏和云南7省(自治区)53县市245块马铃薯种植田黄萎病的发生、病样采集和病原分离开展了研究工作,通过分子生物学方法鉴定了病原菌分类地位,并通过温室试验研究了主要病原菌大丽轮枝菌的致病力分化情况。结果表明:(1)我国北方6省(自治区)内蒙古、河北、甘肃、黑龙江、山西和宁夏属于马铃薯黄萎病病区,云南省属于无病区;(2)引起我国马铃薯黄萎病的病原菌为大丽轮枝菌和黑白轮枝菌两种,占比分别为75.5%和24.5%,大丽轮枝菌为相对优势病原菌种类;(3)根据病原菌种类可将我国北方6省(自治区)病田划分为大丽轮枝菌病田、黑白轮枝菌病田及两菌混生病田。其中甘肃为大丽轮枝菌病田,宁夏为混生病田,山西为大丽轮枝菌病田和混生病田,内蒙古、河北和黑龙江3种病田均存在。两菌混生病田中各类病原菌属于单独侵染致病。(4)聚类分析表明来自甘肃、河北和内蒙古3省(自治区)马铃薯的82个大丽轮枝菌菌株在马铃薯上的致病力至少可以分为3个聚类组,相应菌株的病害发展曲线下面积(AUDPC)均值聚类组间存在显著差异,相应可分为强、中、弱3个致病力类型,并确定了相应95%置信区间,其中强致病力菌株在3省(自治区)供试病原菌中所占比例分别为3.33%、21.74%和10.34%。     

大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1诱导棉花抗病性及作用机理

 PevD1是一种大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)分泌蛋白,具有激发烟草过敏反应(HR)和系统获得性抗病(SAR)的功能。为明确蛋白PevD1诱导棉花抗病性及其作用机制,本文利用大肠杆菌表达、纯化的PevD1诱导棉苗植株,检测棉苗对大丽轮枝菌的抗性及免疫应答反应。结果表明,大肠杆菌表达的PevD1重组蛋白不是棉花品种“新陆早42号”的致萎因子,叶片注射8 μg/mL PevD1蛋白诱导3 d后根部接种大丽轮枝菌,15 d后PevD1处理组病害减轻率达35.04%。PevD1能诱导棉花叶片抗性早期信号分子H₂O₂产生和NO积累,维管束细胞壁加厚、木质素和酚类物质的积累。另外,PevD1处理能提高防御酶PAL、POD和PPO活性,提高棉花抗性基因和木质素合成相关基因PAL、C4H1、4CL的转录水平。说明PevD1通过激发棉花免疫系统而提高抗病性,该研究不仅为利用PevD1蛋白激发子控制棉花黄萎病提供了科学依据,同时也为阐明棉花与大丽轮枝菌互作机理提供了理论基础。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。     

一种丹参新病害的病原菌鉴定及致病力测定

调查发现河北省安国市丹参生产区发生一种丹参新病害.为有效防治该病害,开展了丹参新病害病原菌分离鉴定及致病力测定.采用常规组织分离法,从丹参病株中分离并单孢纯化获得15个真菌分离物.柯赫氏法则证明这15个真菌分离物可造成丹参组培苗表现与田间病株相似症状,并分离获得了与丹参病株初分离物菌落形态相同的真菌菌株.显微观察发现1...     

内生球毛壳属真菌CEF-082对棉花黄萎病的控制作用

 内生真菌在生物防治上具有很大的应用潜力,本研究旨在明确棉花内生真菌球毛壳菌(Chaetomium globosum)CEF-082对黄萎病菌(Verticillium dahliae)的拮抗作用及对黄萎病(Verticillium wilt)的防治效果。采用圆盘滤膜法、凹玻片法等测定CEF-082对棉花黄萎病菌的抑制效果;温室采用滤液接种法和基质接种法测定其对棉花黄萎病的防治效果;并采用实时定量PCR检测棉株内防御基因的表达及黄萎病菌的含量。结果表明,CEF-082的非挥发性代谢物对棉花黄萎病菌菌落生长的抑制率为100%,对分生孢子产量的抑制率为70.5%,试验浓度范围内对分生孢子萌发没有明显抑制作用;棉苗预接种CEF-082培养滤液或将CEF-082的玉米沙粒培养物接入基质中再种植棉花,对黄萎病的防治效果分别为62.37%和66.88%;这两种处理对棉花的生长发育没有副作用,且后者对出苗有促进作用;荧光定量PCR结果表明,CEF-082代谢产物显著提高了棉花防御基因苯丙氨酸解氨酶基因(pal)、过氧化物酶基因(pod)和多酚氧化酶基因(ppo)以及β-1,3-glucanase基因的表达量,抑制了黄萎病菌在棉株体内的繁殖。棉花内生真菌CEF-082可以有效地防治棉花黄萎病,其作用机理主要有抗生作用和诱导抗性,在棉花黄萎病防治上具有较好的应用前景。     

豆科植物繁殖烟蚜及扩繁烟蚜茧蜂的潜力

为探究豆科植物作为繁育烟蚜和扩繁烟蚜茧蜂寄主植物的潜力,本研究测试了烟蚜在豌豆、蚕豆、大豆和绿豆4种豆科植物上的发育历期和繁殖力,随后比较了豆科植物和烟草繁育的烟蚜茧蜂以及蚕豆烟蚜茧蜂回接烟草所获得的子代蜂在羽化率、体型、成虫寿命和寄生力等重要生物学特性上的差异。结果表明：与豌豆和蚕豆相比,大豆与绿豆上蚜虫发育历期更短;大豆与绿豆单头烟蚜总产蚜量为22.3头和25.2头,显著高于豌豆和蚕豆的21头和18.2头;不同植物上蚜虫扩繁速度有显著差异,绿豆不适合作为扩繁烟蚜和烟蚜茧蜂的寄主植物;豌豆与大豆上僵蚜羽化率为67.5%和78.33%,显著低于其他植物;各植物上子代蜂性比无显著差异;烟草繁育的子代蜂成虫寿命（6.89 d）和后足胫节长（雌蜂573.5 μm,雄蜂493.5 μm）均显著高于豆科植物;不同寄主植物繁育烟蚜茧蜂的寄生力由大到小为烟草,蚕豆,豌豆,大豆;回接组烟蚜茧蜂各项指标均不低于烟草组。综合考虑扩繁周期、时间、空间利用率及经济成本等因素,蚕豆有望成为烟蚜茧蜂规模化扩繁的寄主植物。     

苹果树腐烂病菌转录因子VmSte12的鉴定及功能分析

 Ste12是最早在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中发现的一类转录因子。之后在部分丝状真菌中也发现了该类转录因子的存在,并证明其能够参与调控生殖生长以及病原真菌的致病力。然而,苹果树腐烂病菌(Valsa mali)中是否存在该类转录因子以及其功能尚不明确。本研究基于生物信息学鉴定苹果树腐烂病菌中Ste12的同源基因,采用烟草瞬时表达系统进行蛋白亚细胞定位分析,利用酵母单杂技术进行转录激活功能分析,进而利用PEG介导的原生质体转化技术构建基因缺失突变体,并对其进行表型观察与分析。结果表明,苹果树腐烂病菌存在Ste12的同源基因,我们将其命名为VmSte12。该基因编码701个氨基酸,包含Ste同源结构域和C₂H₂锌指结构域。VmSte12定位于细胞核,并具有体外转录激活功能。与野生型相比,VmSte12敲除突变体生长速率平均下降10.1%,分生孢子器数量平均下降94.6%,致病力平均下降27.4%。可见,VmSte12具有Ste12类转录因子特征,并且极有可能在腐烂病菌的生长、繁殖、致病等方面发挥重要作用。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

 枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPCR结果证明,野生型菌株和突变子MS脂肽提取物能抑制微菌核形成相关基因的表达,而突变子MF丧失了对微菌核形成相关基因表达的抑制作用。以上结果证明,fengycin在NCD-2菌株抑制大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成中发挥主要作用。     

脂肽类抗生素fengycin对大丽轮枝菌孢子萌发和微菌核形成的影响

枯草芽胞杆菌NCD-2菌株能够产生脂肽类抗生素fengycin和surfactin。本研究分别比较了NCD-2野生型菌株、丧失fengycin合成的突变子MF和丧失surfactin合成的突变子MS对大丽轮枝菌的抑菌活性。结果表明,NCD-2菌株和突变子MS周围能形成清晰的透明圈,而突变子MF周围透明圈模糊,说明fengycin对大丽轮枝菌具有抑菌活性。不同浓度的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制试验表明,NCD-2野生型菌株的脂肽提取物能抑制大丽轮枝菌孢子萌发,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率为46.30%,且随着脂肽浓度的提高抑制效果更加明显;同野生型菌株相比,突变子MF脂肽提取物显著降低了对大丽轮枝菌孢子萌发的抑制效果,在0.1 mg·mL^-1浓度下对孢子萌发的抑制率仅为18.48%,而突变子MS的脂肽提取物对大丽轮枝菌孢子萌发抑制效果与野生型菌株没有显著差异。通过测试脂肽提取物对微菌核形成的影响,发现野生型菌株和突变子MS脂肽提取物均能够显著抑制微菌核的形成,而突变子MF几乎丧失了对微菌核形成的抑制作用。RT-qPC...     

新疆部分地区苹果、核桃和杨树腐烂病的病原鉴定

树木腐烂病在新疆主林果种植区均有不同程度的发生,近年呈加重趋势。本研究在调查了新疆阿克苏、和田、伊犁、喀什和库尔勒等地区苹果树、核桃树和杨树3种林果腐烂病田间发病情况的基础上,重点对14个样本点的样品进行病原物的分离与鉴定。结果表明,各样本点3种林果均有不同程度的腐烂病发生,分离鉴定结果为引起苹果树腐烂病病原菌主要为Valsa mali var.mali(分离频率为64.5%),其次是V.mali var.pyri(25.8%)、V.malicola(3.2%)和V.nivea(6.5%);引起核桃树和杨树腐烂病病原菌为V.sordida(分离频率为83.3%和96%)和V.nivea(分离频率为16.7%和4%)。离体枝条及苹果果实上的致病性测定结果表明,3种林果上分离得到的病原菌均能感染原寄主。引起新疆部分地区苹果树腐烂病的主要病原菌是Valsa mali var.mali,核桃树和杨树腐烂病的主要病原菌是V.sordida。同时,基于实际生产中存在感病枯死杨树枝干作为苹果园、核桃园树体支撑木的现象,推测3种林果腐烂病菌间可能存在交叉感染的潜在风险。     

一个编码富含丝氨酸蛋白的基因影响大丽轮枝菌的微菌核形成、产孢及致病力

 大丽轮枝菌是一种可在广泛的寄主范围内引发黄萎病的土传植物病原真菌,主要以微菌核的形式在土壤中存活多年,因此鉴定与微菌核形成及致病力相关的基因对防治该病害至关重要。本课题组从前期构建的棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体库中筛选到一个微菌核明显减少的突变体,致病力测定结果表明,该突变体致病力明显下降。以棉花黄萎病菌野生型菌株V592的基因组DNA为模板,从棉花黄萎病菌中克隆到被T-DNA插入突变的基因(VdSRP1)编码区全长为415 bp,包含一个外显子,编码一个富含丝氨酸蛋白,与任何已知的注释基因没有显著的序列相似性。为了明确VdSRP1基因在大丽轮枝菌中的功能,利用同源重组的原理及农杆菌介导的遗传转化方法获得了VdSRP1基因的2个敲除体菌株,与棉花黄萎病菌野生型菌株V592相比,VdSRP1基因敲除突变体的微菌核形成明显减少,产孢量及孢子萌发率下降,对棉花的毒力也显著下降。对野生型菌株V592及VdSRP1敲除突变体的转录分析表明,VdSRP1调控一系列与微菌核形成、孢子形成及致病力相关基因的表达。这些结果表明,VdSRP1基因影响大丽轮枝菌的致病力、微菌核形成、产孢及孢子萌发。