柱花草磷高效种质筛选及根系形态对低磷胁迫的响应分析

为筛选磷高效柱花草（Stylosanthes guianensis）种质并解析其根系适应低磷胁迫的机理,本试验水培了31份柱花草,开展了磷效率评价,分析了低磷胁迫对柱花草根系的影响,并检测了6个扩展蛋白基因（Expansins,EXP）响应低磷胁迫的表达模式。结果表明,低磷胁迫显著降低柱花草的干重和全磷含量。磷效率分析结合根系表型显示,TF291为磷高效高响应型,且低磷胁迫显著促进其根系生长,TF343为磷低效低响应型,且低磷条件下其根系生长显著受抑制。荧光定量PCR表明,低磷处理（-P）使SgEXPB2在TF291和TF343根系中的表达分别增加3.73倍和1.52倍（P<0.05）,SgEXLB1在TF291根系中表达增加1.61倍（P<0.05）。综上所述,本研究筛选到磷高效高响应型柱花草种质为TF291,且根系中SgEXPB2和SgEXLB1基因上调表达,可能参与柱花草适应低磷胁迫。     

柱花草根系分泌物对缺磷胁迫的响应分析

为探索柱花草(Stylosanthes guianensis)根系分泌物对缺磷胁迫的响应，本研究以‘热研5号’柱花草为材料，通过水培试验，分析了正常供磷(+P)和缺磷(-P)处理对柱花草生长及根系分泌物的影响。结果表明，相对于+P处理，-P处理显著降低了柱花草植株干重和全磷含量。随后，代谢组共检测到101个根系分泌代谢物，可被分为有机酸、氨基酸、类黄酮、糖及醇类等七类，其中-P与+P处理间的差异累积代谢物25个。属于有机酸的咖啡酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸和α-酮戊二酸在-P处理下的分泌量显著增加，且其中α-酮戊二酸对磷酸铝具有较强的溶解能力。此外，荧光定量PCR分析发现，柱花草根系中参与α-酮戊二酸合成的柠檬酸脱氢酶基因SgICDH在-P处理下的表达量显著增加。因此，柱花草根系通过上调SgICDH基因的表达，促进α-酮戊二酸的合成与分泌，从而增强对难溶性磷的活化利用，以适应缺磷胁迫。     

柱花草磷转运蛋白SgPT1的克隆和表达分析

磷是植物生长所必需的大量元素。高亲和磷转运子是控制植物对磷吸收和转运的主要蛋白。本研究以磷高效的柱花草基因型TPRC2001-1为对象,首先建立低磷胁迫下TPRC2001-1根系全长cDNA文库。通过同源克隆的方法,首次克隆到编码柱花草高亲和磷转运蛋白的基因,SgPT1。该基因全长cDNA为1 994 bp,编码538个氨基酸残基,蛋白分子量为59 kD。SgPT1蛋白具有高亲和磷转运子的结构特点,即含有“6+6”跨膜结构。而且,定量PCR分析结果表明低磷胁迫显著促进SgPT1在根部的表达,表明该基因可能参与低磷胁迫下磷的吸收和转运的过程。总之,以上结果表明SgPT1的加强表达可能是TPRC2001-1适应低磷胁迫的分子机制之一,为进一步研究柱花草适应低磷的分子机制提供候选基因。     

柱花草SgALMT1基因克隆与表达分析

为探索铝激活苹果酸转运蛋白(Aluminum-activated malate transporter, ALMT)在植物适应酸性土壤铝毒害中的重要作用,本研究以柱花草(Stylosanthes guianensis)为研究材料,克隆了柱花草SgALMT1基因,并进行了生物信息学、亚细胞定位及基因表达分析。结果表明：SgALMT1基因全长为1 350 bp,编码450个氨基酸残基,蛋白分子量为50.6 kDa,包含6个跨膜结构域;亚细胞定位分析表明,SgALMT1蛋白定位在拟南芥原生质体细胞膜上,为膜蛋白。定量PCR结果表明,SgALMT1基因在柱花草叶中的表达量高于根中的表达量;铝处理增强了SgALMT1基因在柱花草根中的表达,表明SgALMT1基因可能参与了柱花草应对铝胁迫;另外,缺氮处理增强了SgALMT1基因在柱花草叶中的表达,而缺磷处理增强了SgALMT1在根中的表达。本研究结果为解析柱花草响应铝毒害和养分缺乏的机理提供了候选基因资源。     

柱花草SgSTOP1和SgSTOP2基因的克隆与表达分析

铝毒是酸性土壤中限制作物生长和产量增加的主要因素之一。转录因子STOPs具有调控耐铝相关基因表达的功能,是植物耐铝毒的重要基因。本研究以耐铝柱花草(Stylosanthes guianensis)基因型‘TPRC2001-1’为材料,首次克隆到两个柱花草编码锌指蛋白SgSTOP1和SgSTOP2基因。这两个基因cDNA全长分别为1 515和1 077 bp,编码504和358个氨基酸残基,蛋白分子量分别为56.2和39.7 kDa。亚细胞定位预测表明,SgSTOP1和SgSTOP2均定位于细胞核中。并且,SgSTOP1和SgSTOP2均为ZF-C_2H_2家族成员,SgSTOP1和SgSTOP2均包含4个保守的锌指结构域。定量PCR结果表明,铝毒胁迫显著增强SgSTOP1在‘TPRC2001-1’根和叶中的表达(P 0.05),但铝处理对SgSTOP2表达影响不明显(P 0.05),暗示SgSTOP1基因可能参与柱花草对铝毒胁迫的应答过程。本研究结果为进一步解析柱花草适应铝毒胁迫的分子调控机制提供了候选基因资源。     

不同基因型柱花草的根系构型差异及其磷效率

柱花草是华南坡地果园生草栽培的重要草种,为减轻柱花草与果树的根系养分竞争,有必要筛选根系构型适宜的基因型柱花草。本试验在正常供磷条件下研究了7个基因型柱花草的根系构型特征,发现存在显著的差异,且总根长、主根长和根系表面积与生物量存在显著正相关。根据生物量和根系构型将其分为3类,选择生物量高但基根角度差异大的2个基因型(‘格拉姆’和‘184号’)进行进一步的磷效率比较研究,结果表明基根角度小的‘184号’在高磷条件下具有较高的磷吸收效率,但在低磷条件下的磷吸收效率较低,从而导致其磷效率较低。本研究表明,基根角度是影响磷吸收效率的重要因子,但是磷效率还取决于低磷条件下的生长表现;‘格拉姆’可能比‘184号’更适于用作果园间作。     

6个紫花苜蓿品种根系形态结构对低磷胁迫的响应

为明确低磷胁迫下紫花苜蓿（Medicago sativa L.）根系形态结构的响应差异对磷效率的影响,以6个紫花苜蓿品种为材料,采用营养液砂培法,测定两种磷水平（对照：0.5 mmol·L^-1;低磷：0.05 mmol·L^-1）下苜蓿根系形态、解剖结构和磷效率。结果表明：低磷胁迫下,各苜蓿品种的根系长度、表面积、导管直径、中柱直径及其占根直径比例均降低,其余根系性状则呈现不同的变化趋势。低磷胁迫抑制了各苜蓿品种的生长和磷吸收;除‘赛迪’的磷利用效率显著增加外,其余5个苜蓿品种的磷利用效率均显著降低。‘赛迪’主要通过增加根冠比和磷利用效率,表现出较强的耐低磷能力。总体表明,根系长度、表面积、体积、导管直径、中柱直径及其占根直径比例是苜蓿根系响应低磷胁迫的主要指标,其中根系长度和中柱直径占根直径比例分别是影响6个苜蓿品种磷吸收和利用效率最关键的根系性状。     

柱花草在酸性红壤中磷吸收效率及其形态和生理生化特性初探

本文通过盆栽及水培试验对桂花草地上部、根部形态、根际酸化及根、叶酸性磷酸酶活性等生理生化特性的测定,对柱花草基因型适应低磷的机制进行研究,为选育磷高效率基因型提供依据。结果表明,在酸性低磷红壤区,供试的十三个桂花草品种在株高、分枝数、主根长、根系活跃吸收面积及根际酸分泌等方面差异明显。相关分析结果表明,地上部生物量与株高、分校数、主根长和根系活跃吸收面积等形态特征间相关关系明显。在低磷区,根际酸化能力与植株吸磷量之间相关关系显著,表明报际酸化有利于柱花草对磷的吸收。根部和叶部磷酸酶活性与缺磷条件下地上部生物量和植株吸磷量之间无显著相关,进而表明桂花草的磷效率主要是由吸收效率所决定的。     

过量锰处理对苗期柱花草生长及抗氧化酶活性的影响

以2份柱花草基因型(TF210和TF226)为材料,分析过量锰处理对苗期柱花草生长、叶绿素浓度(SPAD)、最大光化学效率(Fv/Fm)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响,探究柱花草中潜在的耐锰机制。结果表明,过量锰(400μmol·L-1)处理显著抑制了柱花草基因型TF210地上部和根系的生长、降低了其叶片SPAD和Fv/Fm值,但对TF226生长影响不明显,说明TF226为耐锰基因型,而TF210为锰敏感基因型。虽然过量锰处理增加了两个柱花草基因型组织锰含量,但TF226地上部和根部的锰含量显著低于TF210,暗示在过量锰处理下,TF226积累了较少的组织锰含量。过量锰处理显著增加了两个基因型叶片SOD活性,但仅增加了TF226叶片POD和CAT活性,并且在过量锰处理下,TF226叶片SOD、POD和CAT活性值均高于TF210。以上结果说明维持根系生长、降低组织锰含量和提高抗氧化酶活性是苗期柱花草TF226耐锰的生理机制。研究结果为探索柱花草耐锰机理及耐锰柱花草品种改良提供了理论依据及种质材料。     

柱花草SgNramp1和SgNramp2基因克隆与表达分析

为了探究植物天然抗性相关巨噬蛋白（Nramp）在金属元素吸收、转运和分配等方面的重要作用，本研究以柱花草（Stylosanthes guianensis）为材料，采用PCR方法克隆了柱花草SgNramp1/2基因，并分析了该基因的表达模式。结果表明：SgNramp1和SgNramp2基因全长分别为1 654 bp和1 716 bp，且均含有12个跨膜结构域。基因表达分析发现，SgNramp1在柱花草根部的表达高于叶部，而SgNramp2则在叶中特异性表达；金属元素缺乏和过量胁迫对SgNramp1/2基因表达的影响有所差异，缺锰（-Mn）处理抑制了SgNramp1/2基因在根和叶中的表达，而缺铁（-Fe）处理则增强了SgNramp2基因在叶中的表达，但抑制了其在根中的表达，SgNramp1/2基因在根和叶中的表达至少受到一种元素过量胁迫的影响。此外，金属镉（Cd）处理均增强了SgNramp1/2基因在柱花草根中的表达，而铝（Al）和镧（La）处理抑制了SgNramp1基因的表达，但增强了SgNramp2基因的表达。本研究结果表明SgNramp1/2基因可能参金属离子的转运。     

过量锰处理对苗期柱花草生长及抗氧化酶活性的影响

以2份柱花草基因型(TF210和TF226)为材料,分析过量锰处理对苗期柱花草生长、叶绿素浓度(SPAD)、最大光化学效率(F_v/F_m)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性的影响,探究柱花草中潜在的耐锰机制。结果表明,过量锰(400 μmol·L^-1)处理显著抑制了柱花草基因型TF210地上部和根系的生长、降低了其叶片SPAD和F_v/F_m值,但对TF226生长影响不明显,说明TF226为耐锰基因型,而TF210为锰敏感基因型。虽然过量锰处理增加了两个柱花草基因型组织锰含量,但TF226地上部和根部的锰含量显著低于TF210,暗示在过量锰处理下,TF226积累了较少的组织锰含量。过量锰处理显著增加了两个基因型叶片SOD活性,但仅增加了TF226叶片POD和CAT活性,并且在过量锰处理下,TF226叶片SOD、POD和CAT活性值均高于TF210。以上结果说明维持根系生长、降低组织锰含量和提高抗氧化酶活性是苗期柱花草TF226耐锰的生理机制。研究结果为探索柱花草耐锰机理及耐锰柱花草品种改良提供了理论依据及种质材料。     

柱花草在酸性红壤中磷吸收效率及其形态和生理化特性初探

本文通过盆栽及水培试验对柱花草地上部、根部形态，根际酸化及根，叶酸性磷酸酶活性等生理生化特性的测定，对柱花草基因型适应低磷的机制进行研究，为选育磷高效率基因型提供依据。     

狼尾草属象草PpPAPs基因的克隆及响应低磷胁迫的表达模式分析

为解析象草(Pennisetum purpureum)适应低磷胁迫机理，本研究通过水培试验，分析了不同磷源处理对象草生长的影响，并利用同源克隆和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术，从象草中克隆了3个可能参与ATP利用的PAP基因。结果表明，在腺嘌呤核苷三磷酸处理(+ATP)下，象草的干重和全磷含量显著高于低磷处理(-P)，表明象草对ATP具有较强的利用能力。荧光定量PCR分析表明，与正常供磷处理(+P)相比，+ATP处理10 d使3个可能参与ATP利用的PAP基因在象草根系中的表达量提高170%~403%，并伴随着根系胞内和分泌的酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)活性显著增加。综上所述，在低磷胁迫条件下，象草根系中PpPAPs基因上调表达，可能促进了根系ACP的合成与分泌，这有助于象草对ATP的活化利用。     

地毯草铝响应基因AcABCG1的克隆与表达分析

铝毒抑制植物根系生长,是酸性土壤上限制作物产量的重要因素之一。ABC转运蛋白在金属离子转运和非生物胁迫应答等方面起作用。本研究以地毯草（Axonopus compressus）为材料,克隆了地毯草编码ABC转运蛋白AcABCG1基因,并对其进行了生物信息学和基因表达模式分析。结果表明,AcABCG1基因cDNA全长为2 434 bp,编码811个氨基酸残基,蛋白分子量为91.85 kD。亚细胞定位预测表明AcABCG1定位于细胞质膜上。定量PCR结果发现,金属铝（Al）、镉（Cd）和镧（La）处理均能显著增强AcABCG1基因在地毯草根系中的表达。不同铝浓度和时间处理进一步表明了AcABCG1基因在转录水平上响应铝胁迫。此外,AcABCG1基因在根中的表达量显著高于茎和叶中的表达量,且AcABCG1基因主要在0~1 cm根尖中表达。本研究结果为进一步挖掘AcABCG1基因参与地毯草耐铝毒的生物学功能奠定基础。     

低磷胁迫对太空诱变耐低磷柱花草酸性磷酸酶活性和磷效率的影响

低磷胁迫是酸性土壤限制牧草生产的主要障碍因子之一。本课题组前期的研究中,通过太空诱变获得了一个耐低磷柱花草突变体TPRC2001-84,但其适应低磷胁迫的机制仍不清楚。以TPRC2001-84及其亲本热研2号(RY2)为试验材料,通过水培方法,比较正常供磷(+P,250 μmol·L^-1 KH₂PO₄)和低磷(-P,5 μmol·L^-1 KH₂PO₄)处理对TPRC2001-84和RY2生物量、磷吸收效率、磷利用效率、可溶性磷浓度、细胞壁磷含量和酸性磷酸酶(ACP)活性的影响。结果表明,相对于正常供磷处理,低磷处理显著降低了两份柱花草材料的植株干重和磷吸收效率(P<0.05),但显著提高了两份柱花草材料的磷利用效率(P<0.05)。并且,TPRC2001-84在低磷处理下的植株干重和磷利用效率分别是RY2的1.6和1.4倍。在低磷胁迫下,虽然TPRC2001-84叶片和根系的细胞壁磷含量只有RY2的70%左右,但是,TPRC2001-84叶片和根系的可溶性磷浓度分别比RY2高36.8%~42.6%,细胞壁ACP活性分别比RY2高46.6%~53.6%。以上结果说明,柱花草TPRC2001-84在低磷胁迫下具有较高的细胞壁ACP活性,有利于其对细胞壁中贮存磷的活化利用,从而获得较高的磷利用效率。这将为选育磷高效柱花草新品种提供理论依据和种质材料。     

外源褪黑素对盐胁迫下燕麦幼苗生长及抗氧化系统的影响

褪黑素作为一种吲哚胺类生长激素，具有多种生物学功能，能够调节植物的逆境胁迫中的防御反应。为探究外源褪黑素对盐胁迫下耐盐饲用燕麦(Avena sativa L.)幼苗‘白燕7号’的表型和生理的调节作用。本研究在人工气候室进行，采用根灌水培培养，比较在单独盐胁迫和盐与褪黑素复合处理下，‘白燕7号’表型指标、渗透调节物质、膜脂过氧化程度、抗氧化系统活性、编码抗氧化物酶相关基因的表达量变化。研究结果表明：与盐胁迫处理相比，添加外源褪黑素后‘白燕7号’幼苗的株高和根长显著增高，氧化胁迫造成的膜损伤减轻，且脂氧合酶相关基因LOX表达水平下调，同时渗透失衡得到有效缓解；在清除活性氧方面，编码抗氧化物酶的相关基因表达量上调，酶活性显著提高，抗氧化系统活性显著提升，外源褪黑素最为适宜的浓度为150μmol·L^-1。这些结果说明外源褪黑素在缓解燕麦盐胁迫方面起重要作用。     

不同施磷浓度对柱花草和黑籽雀稗根系分布的影响

采用根箱法,结合Winrhizo2004a根系扫描测定系统,以豆科牧草柱花草和禾本科牧草黑籽雀稗为试验材料,研究不同施磷水平对柱花草和黑籽雀稗根系分布的影响。结果表明,2种牧草根系分布随土壤深度的增加而减少, 柱花草集中分布于0～10 cm土层, 黑籽雀稗集中分布于0～20 cm土层;磷对2种牧草根系生长的影响存在较大的差异。低磷(P1,0.48 g P₂O₅/kg土)更适合柱花草根系和地上部分的生长,高磷(P3,1.92 g P₂O₅/kg土)水平对根系生长有抑制。黑籽雀稗对磷的需求量大,随着磷施入量的增加,根干重、总根长、根表面积、体积和根系平均直径均有所提高。     

紫花苜蓿苗期根系生长的水分胁迫损伤及氮磷的修复生长作用

土壤水分胁迫对牧草根系生长有重要影响。为明确土壤水分胁迫对紫花苜蓿根系生长的损伤以及胁迫解除后根系修复生长过程中土壤养分的作用和利用率,以赛迪-7(Sadie-7)和标杆(Icon)两个品种进行盆栽试验,分析了土壤渍水和低水分条件下生长的紫花苜蓿小苗的根系形态;并在解除土壤水分胁迫后施氮(尿素:0.336 g/盆)或磷(过磷酸钙:1.51 g/盆),分析了氮、磷对根系生长的影响。结果表明,土壤渍水显著抑制紫花苜蓿小苗主根的伸长生长,主根直径、根表面积以及根体积均小于对照;土壤低水分处理促进主根伸长生长,但显著抑制侧根生长。胁迫解除后,前期渍水处理的植株主根生长加快,但侧根生长则比前低水分处理的植株和对照缓慢;施氮、磷肥可显著促进根系的生长。土壤水分胁迫造成的根系生长伤害及胁迫去除后侧根生长缓慢导致氮、磷吸收利用率显著降低。试验结果说明,保持适宜的土壤水分或在土壤水分胁迫后适当施用氮、磷肥,将是促进紫花苜蓿根系生长,提高饲草产量的重要栽培措施。     

过量表达Fa14-3-3C促进拟南芥对低氮胁迫耐受性的研究

氮元素是植物生长发育过程必不可少的营养元素之一,对禾本科作物生长的影响更加明显。本研究采用RACE技术从高羊茅叶片中克隆获得Fa14-3-3C基因全长,并对其亚细胞定位与分子功能进行系统研究。在烟草表皮细胞中观察发现Fa14-3-3C-GFP主要定位在细胞质中与细胞膜上。将Fa14-3-3C基因在拟南芥中过量表达获得3个单拷贝转基因株系(抗性分离比为3∶1)。在低氮胁迫反应中,Fa14-3-3C过量表达株系OE-1与OE-3的根鲜重显著比野生型高,而OE-2与野生型差异不显著,通过荧光定量PCR分析发现OE-1与OE-3过量表达明显而OE-2没有过量表达,说明Fa14-3-3C对植物耐低氮胁迫调节具有剂量效应。定量观察植物根系生长发现在低氮处理早期OE-1转基因株系就显著优于野生型,主要是通过补偿根系生长的方式缓解低氮胁迫对植物的伤害。因此本研究不仅获得了耐低氮胁迫候选基因,而且验证了其在模式植物中的分子功能,为进一步通过基因工程等手段培育耐低氮胁迫种质资源奠定基础,具有重要理论研究价值与生产应用前景。     

假地豆响应缺磷胁迫的代谢衍生物分析

为探究假地豆（Desmodium heterocarpon）对缺磷胁迫的生理和代谢响应,本研究通过水培试验,分析了正常供磷（+P处理）和缺磷（-P处理）对假地豆生长及代谢物积累的影响。结果表明：缺磷胁迫降低了假地豆地上部干重和磷含量,但促进了根系生长。随后,代谢组共检测到假地豆叶片和根系的267个代谢物,可被分为12类。其中,叶片和根系的缺磷胁迫差异累积代谢物（DAMs）均为79个。缺磷处理导致假地豆叶片和根系的原花青素、槲皮素及其衍生物的积累显著增加,而2'-脱氧腺苷5'-单磷酸（dAMP）的积累显著减少。此外,缺磷处理使根系的8个有机酸和4个糖及醇类的积累显著增加。综上,假地豆通过促进根系生长和调整代谢物积累来提高对缺磷胁迫的适应性。本研究将为进一步解析假地豆适应缺磷胁迫的机理提供理论参考。