猪细小病毒CG-05株在ST细胞上的增殖规律研究

通过将猪细小病毒CG-05株同步接种于ST细胞,测定不同时间收获的病毒液的TCID50和HA,研究了CG-05株病毒在ST细胞上的增殖规律。病毒接种后镜检观察接毒细胞,在接种病毒后24 h,即可在细胞较少的区域看到非常轻微的病变。测定病毒TCID50,检测到接毒后培养17h病毒已经明显增殖;当培养到40h左右,其TCID50即接近高峰,达到10-7.2/0.1mL以上,并进入平台期;继续培养,TCID50最高可达到10-8.5/0.1mL,且直到122 h也不见明显降低。病毒HA价也出现同样的平台期,但比TCID50的平台期出现得晚,到50 h才进入平台期。结果表明,用ST细胞培养CG-05株病毒,接种病毒培养56～96 h后,如病变达到80%以上,且细胞脱落已形成20%以上空斑,此时收获病毒可获得高效价的病毒液。该研究可为制备高效价的PPV病毒抗原提供数据资料。     

猪细小病毒N株的安全性试验

用PPV-N株常规接种量的5倍和10倍接种PPV HI抗体阴性4月龄小猪、后备母猪和怀孕母猪,接种后第5,7、9天未能从血液中检测到病毒血症,鼻咽和直肠拭子未分离到病毒,无任何异常临床症状,母猪产仔正常,初生仔猪PPV HI抗体阴性,而未接种的对照猪产仔正常,没发现同居感染.以上研究证明PPV N株对4月龄小猪,后备母猪和怀孕母猪具有良好的安全性.     

微载体培养ST细胞制备猪细小病毒灭活苗及其免疫原性分析

目的利用微载体规模化培养ST细胞制备猪细小病毒L株灭活疫苗,并检测其免疫原性。方法猪细小病毒L株接种微载体悬浮培养的猪睾丸传代细胞系(ST细胞)后,收获细胞培养液和细胞,经二乙烯亚胺(BEI)溶液灭活后浓缩,加矿物质油佐剂乳化,制备灭活疫苗,经肌肉注射疫苗,免疫后28天采血,测定血清中和抗体效价。结果。微载体规模化培养ST细胞制备猪细小病毒获得病毒毒价较高,经灭活浓缩后制备疫苗免疫豚鼠,获得了较高效价的中和抗体效价。结论利用微载体规模化培养ST细胞成功制备了具有较高免疫原性的猪细小病毒灭活疫苗,为后期灭活疫苗的开发奠定了基础。     

猪细小病毒N株的生物学和免疫学特性研究

猪细小病毒N株是从广西初产母猪所产死胎脏器分离的自然弱毒株。用这个毒株接种PPV HI抗体阴性的四月龄小猪和怀孕14～23天的后备母猪进行安全性试验,结果无任何异常临床症状、病毒血症和同居感染,母猪分娩正常,初生仔猪在吃初乳前HI抗体阴性。该毒株免疫的小猪、后备母猪和怀孕母猪,完全能抵抗猪细小病毒强毒攻击,攻毒后49天剖杀母猪,结果胎儿正常,胎儿心血HI抗体阴性,取胎儿脏器未分离出病毒,分娩母猪产仔正常,仔猪吃初乳前HI抗体阴性。而对照猪攻毒后产生病毒血症,产下不同组合异常仔,并从死胎儿脏器分离出病毒,健活仔猪吃初乳前能测出HI抗体。从而证明用N株作为弱毒苗能防止由猪细小病毒引起的繁殖障碍性疾病。     

猪细小病毒N株弱毒疫苗区域试验

用三批PPV-N株弱毒疫苗分别在三个规模化猪场进行了较大范围的区域试验,共免疫后备母猪32930头,观察其安全性和免疫效力.结果表明,三批苗均能使豚鼠产生良好的抗体反应.猪只注苗后食欲、体温均正常,无任何不良临床反应.平均每胎产健活仔10.96头,而死胎仅为0.52头,说明PPV-N株弱毒疫苗是预防猪细小病毒感染安全、有效的弱毒疫苗.     

猪细小病毒YK株NS1基因的克隆与序列分析

提取猪细小病毒（PPV）YK株基因组DNA，利用PCR技术扩增得到了NS1基因全序列，将其克隆到pMD 18-T质粒载体并进行了序列测定和分析。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸。氨基酸序列中含有在PPV复制过程中起重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点NISN、NFSN和NLTR。PPV YK株的NSl基因与其他PPV毒株NADL-2（4973）株、NADL-2（5075）株、NADL-2（5034）株和Kresse株相比，核苷酸同源性分别为98．3％、99．9％、99．9％和99．7％，氨基酸同源性分别为99．7％、99．7％、99．7％和97．7％。结果说明，NS1基因具有高度保守性。     

猪细小病毒SC-1株VP2基因的克隆及生物信息学分析

根据PPVNADL-2株基因组序列设计了一对引物,以复制型DNA为模板,通过PCR扩增出长约2.0kb的DNA片段,将其插入克隆载体质粒pUC19,构建重组质粒pPVP2,测序显示PPV-SC-1VP2基因全长1740bp,共编码579个氨基酸。多序列比对结果显示,猪细小病毒VP2基因保守性强,仅存在个别的差异;密码子偏向性分析结果表明,PPV-SC-1VP2基因在同一氨基酸的不同密码子的选择上存在一定的偏向性,并且与PPV-SC-1NS1在密码子的偏向性上具有相同的属性,主要偏向于使用以A结尾的密码子;氨基酸疏水性分析表明,PPV-SC-1VP2蛋白在77~82、291~304、362~373、400~411、465~477等位点存在较明显的亲水区段;跨膜区结构分析显示该蛋白不存在显著意义的跨膜区;分析该蛋白的抗原位点可能位于60~68、81~88、266~275、351~357、398~404位点处。     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NS1基因的克隆及序列分析

猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV)SY-99株由本室分离，提取SY－99株的基因组DNA，利用PCR扩增出全长NS1基因，将该基因克隆到 核表达载体pET28a中并测序。结果表明，NS1基因全长1989bp，编码662个氨基酸，氨基酸序列中含有PP 制过程中发挥重要作用的保守基序GKRN，并有3个潜在的糖基化位点，分别位于356－359、446－449、513－516位氨基酸处，SY－99株NS1基因与其它PPV毒株NADL2－1、NADL2－2、Kresse株核苷酸同源性分别为98％、99％、99％，氨基酸同源性分别为97％、99％、995。SN1基因的克隆为研究NS1在PPV的复制中所发挥的功能及利用人工表达的NS1来制备诊断抗原提供了可能。     

猪细小病毒疫苗株NS1基因克隆及生物信息学分析

为进一步开展猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）NS1蛋白功能研究,根据GenBank登录的PPV参考株NADL-2（登录号：NC001718）的NS1基因序列设计1对特异性引物,采用PCR技术扩增PPV疫苗株NS1基因,将PCR扩增产物克隆入pTA2载体构建重组质粒pTA2-NS1,并进行测序鉴定。测序结果显示,构建的pTA2-NS1质粒含有一个开放阅读框（ORF）,全长1989 bp,共编码662个氨基酸,与GenBank登录的PPV参考株NADL-2、Kresse株的NS1基因的核苷酸同源性分别为99.85%和99.65%,氨基酸同源性分别为99.70%和99.70%。上述结果表明试验成功构建了含有PPV NS1基因的重组质粒pTA2-NS1。应用DNAStar软件及在线ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM、Scansite、PSORTⅡ等生物信息学软件对NS1基因及其编码蛋白进行生物信息学分析,结果显示NS1蛋白分子质量为75.7 ku,等电点PI为6.82,是弱酸性蛋白;NS1蛋白不含信号肽序列,无跨膜区,为可溶性蛋白,主要定位于细胞核内,T199、Y309、T338、T512、S631、T635为其潜在磷酸化位点。以上研究为进行PPV NS1蛋白表达,进一步开展NS1蛋白功能研究奠定了基础。     

猪细小病毒自然弱毒N株的免疫原性研究

用PPV-N株接种抗体阴性后备母猪,5天产生HI抗体,7天达到保护性水平(＞1∶256),14天达高峰.用该毒株对4月龄猪、后备母猪和怀孕母猪进行免疫原性试验,结果攻毒后5、7、9天未检测到病毒血症和未分离到病毒.攻毒后第40天剖杀2头怀孕母猪,见胎儿正常,胎儿心血HI抗体阴性,从胎儿脏器未分离出病毒.自然分娩的母猪,产仔正常,仔猪吃初乳前HI抗体阴性,而对照猪攻毒后产生病毒血症,并产下不同组合异常仔,从死胎儿脏器分离到病毒,活仔HI抗体阳性.试验还表明豚鼠对PPV-N株的抗体应答和猪的相似,可作为PPV弱毒株免疫抗体应答检测的实验动物.本研究结果证明,PPV自然弱毒N株具有良好的免疫原性.     

一株新型猪细小病毒的鉴定和分子克隆

在与猪圆环病毒2型混合感染的患病猪肺泡灌洗液中鉴定出一株新型的猪细小病毒,命名为PPV4,该病毒与牛细小病毒2型同源性较小,与编码ORF3的Bocavir-us属(如牛细小病毒、犬细小病毒和人bocavirus等)同源性较高。PPV4的ORF3编码一个含204个氨基酸残基的蛋白质,与bocaviruses的ORF3编码蛋白质的大小类似;而bocaviruses的ORF3编码蛋白质相互间相似性较高,PPV4的ORF3编码蛋白质与GenBank非冗余蛋白质数据库中的蛋白质无同源性。     

猪细小病毒N株弱毒苗的免疫效果观察

经调查,广西猪群普遍存在猪细小病毒感染［１］。为了有效防制该病,本研究室已研制出能预防猪细小病毒感染的弱毒疫苗（简称ＰＰＶ－Ｎ株弱毒苗）。该弱毒苗用于预防猪细小病毒引起的繁殖失败,具有良好的免疫原性和安全性［２］。我们用四批ＰＰＶ－Ｎ株弱毒苗对广西多个流行该病的猪场的后备母猪进行免疫,取得了良好的效果,现将结果报告如下。１　材料和方法１．１　ＰＰＶ－Ｎ株弱毒苗本实验室研制,种毒按蒋玉雯等［２］的方法进行培养。１．２　试验动物５００克左右健康青年豚鼠,并经ＰＰＶ－ＨＩ检测为阴性。１．３　猪细小病毒…     

猪细小病毒SX株的分离鉴定

从发生蓝耳病的猪场采集流产、死胎病料中分离出了一株病毒,适用传代细胞后,该病毒能够在ST细胞上生长并引起明显的呈拉网状和细胞脱落的细胞病变(CPE),能够凝集0.5%的豚鼠红细胞,经猪细小病毒阳性血清中和后不能引起细胞病变(CPE),也失去了血凝特性;用特异荧光抗体染色可见细胞核内出现特异性荧光.采用特异性PPV NS1基因的引物进行扩增,得到了大小约为2.18 kb的片段,测序并与猪细小病毒相应序列进行比较,同源性为99%以上,鉴定该病毒为猪细小病毒,命名为PPV-SX.说明目前有部分猪繁殖障碍是由猪细小病毒和PRRS共同感染而致.     

猪细小病毒在PK细胞中的增殖过程

将猪细小病毒南京毒株1（NJ-1）、南京毒株2（NJ-2）和7909毒株接种于PK-15细胞，用免疫荧光检测方法研究了猪细小病毒增殖的基本特性与规律。在PK-15细胞中，3个毒株的增殖规律基本相似，均在感染后12h即可检测到荧光，表明其子代病毒粒子产生，随后逐渐增多，在感染后48h荧光几乎遍布所有细胞，随后荧光开始衰减，在84h时病毒引起细胞大面积崩解，荧光呈现岛屿状分布。通过绘制其一步法生长曲线可知，在病毒感染后12h，细胞培养液中的病毒TCID50／ml。为2．0左右，随后逐渐增高，感染后60h3种毒株的TCID50／mL均达到最高，子代病毒粒子向细胞外释放也达到高峰，其后TCID50逐渐下降。培养液中病毒粒子的丰寿期为7h。     

猪流行性腹泻病毒变异株CH/GX/750A/2015在Vero细胞上转瓶培养条件的优化试验

本研究旨在确定猪流行性腹泻病毒（PEDV）变异株CH/GX/750A/2015株在Vero细胞上转瓶培养的最佳条件,为大规模生产高效PEDV变异株疫苗提供技术支撑。试验以10 L转瓶培养病毒,对接毒时细胞维持液中胰酶浓度（0、2、4、6、8和10 μg/mL）、细胞密度（40%、60%、80%、100%、200%）、接毒剂量（MOI分别为1、0.1、0.01和0.001）、吸附时间（0、30、60、90、120、240 min）、收毒时间（接毒后12、24、36、48、60、72 h）、维持培养温度（35、36、37和38 ℃）和转瓶转速（6、8、10、12、14、16 r/h）7个条件进行优化。结果显示,PEDV CH/GX/750A/2015株在10 L转瓶中的最佳培养条件为：细胞刚铺满单层时接毒,接毒量为MOI=0.01,维持液（无血清DMEM培养液）中胰酶质量浓度为6 μg/mL,不需吸附,维持培养温度为37 ℃,12 r/h 旋转培养48 h后收获病毒液可获得较高效价的病毒液,效价可稳定达到10^6.50 TCID₅₀/0.1 mL。本试验为 PEDV 变异株大量培养提供了参考,为变异株疫苗研发奠定了基础。     

猪细小病毒N株弱毒苗田间试验

猪细小病毒感染普遍流行于世界各地猪群,为了有效防制该病,我们研制出能预防该病感染的猪细小病毒N株弱毒疫苗(PPV-N株)[1].该弱毒苗具有良好的免疫原性和安全性[2].我们按要求制备三批PPV-N株弱毒疫苗对三个规模化猪场的后备母猪进行田间试验,现将结果报告如下.     

猪细小病毒自然弱毒N株遗传稳定性研究

本研究将PPV-N株通过敏感猪三代、猪肾传代细胞25代,测定该毒株对敏感猪的致病性,结果表明将PPV-N株连续分别通过PPV HI抗体阴性的4月龄小猪、后备母猪、怀孕母猪三代,均未从试验猪检出病毒血症和分离到病毒,且母猪产仔正常。在IBRS-2细胞中连续传代,随着传代次数的增加其细胞病变未见异常,毒价稳定在103.5TCID50/mL。将第1、5、10、15、20、25代病毒培养物接种PPV HI抗体阴性怀孕母猪,未从母猪测出病毒血症和检出病毒,所产仔猪PPV HI抗体阴性,未从弱仔猪脏器分离到病毒,说明该毒株毒力不返强,具有良好的遗传稳定性。这为该弱毒株成为一株良好的自然弱毒疫苗株提供了依据。     

猪细小病毒Z株NS部分基因的扩增及序列分析

从猪细小病毒Z株提取基因组DNA，利用PCR扩增部分基因，并对该扩增片段进行测序与分析。结果表明，扩增的NS基因长330bp，编码109个氨基酸。氨基酸序列中含有猪细小病毒的重要保守序列。并有1个潜在的糖基化位点NFSN。Z株NS基因与其他猪细小病毒Kresse、NADL2-2、NADL2-1株的核苷酸同源性分别为99％、98％、98％，氨基酸同源性均为99％。