鸡和人志贺菌gyrA、parC基因突变与喹诺酮类耐药的关系

通过药敏实验检测了鸡鲍氏、人鲍氏和人福氏三株志贺菌对12种常用抗生素的耐药情况,发现三者均未产生对喹诺酮类药物的耐药性。用聚合酶链反应(PCR)分别扩增三株志贺菌的DNA旋转酶A亚单位(gyrA)和拓扑异构酶ⅣC亚单位(parC)基因,并对其中的耐喹诺酮类决定区(QRDR)进行了分析。发现鸡和人鲍氏志贺菌QRDR区的序列没有发生任何碱基突变,这与药敏试验结果相吻合。人福氏志贺菌虽然也对喹诺酮类无耐药性,但其gyrA基因存在83位Ser83(TCG)→Leu(TTG)的突变,由于只有83位点一处突变,所以尚未表现出耐药性表征,parC基因中存在58位Ser58(AGC)→Ile(ATC)的突变,该突变点与常见的80、84位氯基酸的改变有所不同,却仍在QRDR区域之中,虽然暂时还无法根据这一结果判断该突变与喹诺酮类耐药性之间的关系,但至少表明该菌株正处在耐药性演变进程之中,其在志贺菌耐药性中的确切作用还有待进一步研究。     

氟喹诺酮类药物压力下鸡毒支原体gyrA基因突变特征分析

按常规方法提取鸡毒支原体参考株(S6-10)、疫苗株(F14-6)及在氟喹诺酮类药物压力下体外筛选出来的耐药株的基因组DNA，扩增各菌株DNA旋转酶gyrA基因片段，并克隆、测序，利用DNASIS分析软件对测序结果进行分析。结果表明，S6-10和F14-6在恩诺沙星或环丙沙星压力下均筛选出不同程度的耐药菌，而且恩诺沙星致鸡毒支原体发生耐药性突变的机率高于环丙沙星，S6-10株耐药突变频率高于F14-6。S6-10筛选出来的耐药菌株发生突变的位置在DNA旋转酶gyrA亚基的第83位(相对于大肠杆菌gyrA亚基中的位置，以下同)和87位上，取代模式为Ser83→Ile、Glu87→Gln，高水平耐药株(Se32M，MIC≥128)除了在第83位发生突变外，在第82位还增加一突变位点(Asp→Gly)；F14-6筛选出来的高水平耐药菌株(Fe32M)在DNA旋转酶gyrA亚基的第83、87位发生了双位点突变(Ser83→Ile，Glu87→Gly)，而低水平耐药株(Fe8M、Fc8M)在gyrA亚基未发生任何位点突变。     

肉鸡屠宰生产链中的沙门氏菌耐药基因检测及耐药相关性分析

[目的 ]了解肉鸡屠宰生产链中的沙门氏茵耐药性与耐药基因的相关性。[方法 ]采用微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC),对从肉鸡屠宰生产链中分离鉴定的233株沙门氏菌进行13种抗生素药敏实验;采用PCR方法检测15种耐药基因。[结果 ]233株肉鸡屠宰生产链中的沙门氏菌对庆大霉素的耐药率最高(100%);对多西环素、氨苄西林、大观霉素、四环素、氟苯尼考、磺胺甲恶唑耐药率分别为84.94%、75.73%、67.78%、56%、52%、50%。233株沙门氏菌中,有231株至少含有1种耐药基因,其中blatem、bla CMY-1、tet B、tet G、tet X、aad A1和cat1基因检出率分别为80.26%、57.94%、54.94%、65.67%、58.37%、63.52%和72.53%。72%的菌株表现为多重耐药,共计57种耐药谱型。[结论 ]肉鸡屠宰生产链中的沙门氏菌对常见抗生素具有不同程度的耐药性,且耐药基因普遍存在于耐药菌株中;药敏实验结果与耐药基因检测结果有很高的一致性。     

鸡源性沙门氏菌耐药基因检测与耐药相关性分析

为研究沙门氏菌耐药基因与其耐药性之间的关系,本研究以K-B纸片法对临床分离的29株鸡源性沙门氏菌进行10种抗菌药物敏感性测定,应用PCR技术进行这些抗菌药物相关耐药基因检测.并通过质粒接合试验证明了耐药性及耐药基因的转移.结果显示:29株分离株对氨苄西林耐药率为31.0％,对头孢唑啉耐药率为10.3％,对四环素耐药率为44.8％,对复合磺胺耐药率为41.4％,对氯霉素耐药率为3.4％,对环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的耐药率均为37.9％,但对庆大霉素和卡那霉素均敏感.本实验共检测到8种耐药基因,其中blatem-1阳性率为31.0％,tetA和tetB阳性率为44.8％,sull和sul2阳性率为41.3％,aadAl阳性率为3.4％,dfrA1阳性率为10.3％,qnr阳性率为37.9％,而tetG、blaCMY-2和catI均未检出.此外,通过与非耐药菌接合后绝大部分接合子均获得了供体菌质粒编码的相应抗性表型,耐药基因在接合过程也发生了转移,赋予被接合细菌新的耐药性.以上结果表明沙门氏菌的耐药性与其相关耐药基因的检出率基本一致,而且耐药性通过质粒进行转移.     

痢疾杆菌福氏2a及其环丙沙星耐药株gyrA和parC基因耐药性决定区的序列分析

测定了痢疾杆菌福氏2a301株与喹诺酮类药物耐药性相关的gyrA基因和ParC基因的序列，并对其环丙沙星耐药诱变株的gyrA和ParC基因喹诺酮类药物耐药性决定区(QRDR)序列进行了测定分析。结果表明，痢疾杆菌福氏2a301株gyrA和ParC基因分别为2625bp和2256bp，环丙沙星诱导的耐药菌gyrA基因QRDR(245bp)发生氨基陵残基69—Ala→Val和87—Tyr→AsP改变，ParC基因QRDR(237b)发生氨基酸残基79—Ala→Asp、84—Ala→Glu和85—Pro→Ala改变。这一研究结果对认识痢疾杆菌喹诺酮类药物耐药性的分子机理具有重要意义。     

27株牛源肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因遗传分析

为了解重庆和四川地区牛源肺炎克雷伯菌分离株之间的进化关系,本试验通过PCR方法扩增27株肺炎克雷伯菌gyrA、parC基因并测序,对测序结果进行基因进化分析。结果表明,gyrA、parC基因片段扩增产物大小分别为420,382bp;27株分离株可分成4个大簇,荣昌分离株主要与ha06(中国·江苏)、NCTC11228(荷兰·乌特勒支)等聚类于Ⅰ簇;丰都分离株紧密聚类于Ⅱ簇;Ⅲ簇全为云阳分离株;自贡分离株聚类于Ⅰ、Ⅳ簇。     

新疆猪源沙门氏菌耐药性及耐药基因检测

为了解新疆某规模化养殖场猪源沙门氏菌对临床上常用抗菌药物的耐药情况,以及β-内酰胺酶、16S rRNA甲基化酶和质粒介导的喹诺酮耐药（plasmid mediated quinolone resistance,PMQR）基因的流行情况,本试验通过琼脂稀释法对分离的菌株进行最小抑菌浓度测定,PCR方法进行β-内酰胺酶bla_TEM、bla_CMY-2、bla_CTX-M、bla_LAP-1、bla_KPC、bla_OXA和bla_SHV基因,16S rRNA甲基化酶基因armA和rmtB及PMQR类基因qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、qepA、oqxA、oqxB和aac（6'）-Ib-cr的检测,确定阳性菌株,分析其携带的基因型与耐药表型之间的关系。分离的猪源沙门氏菌对环丙沙星和安普霉素耐药率最高,均为77.9%（102/131）,耐药菌主要以8耐为主（29.0%,38/131）。从被检基因中检测出11种耐药基因,不同基因共存有24种类型,主要以bla_TEM+bla_OXA+qnrS+aac（6'）-Ib-cr+oqxA+oqxB（27.6%,32/116）;bla_TEM+bla_OXA+qnrS+oqxA+oqxB（24.1%,28/116）;bla_TEM+qnrS（18.0%,21/116）形式共存。该养殖场分离的沙门氏菌耐药现象严重,分离耐药菌株存在β-内酰胺酶、16S rRNA甲基化酶和PMQR类基因共存现象,提示应加强对β-内酰胺酶、16S rRNA甲基化酶和PMQR类因子的监控。     

51株沙门氏菌的耐药性分析

通过对厦门市畜禽产品中分离的51株沙门氏菌临床分离株开展的24种药物敏感试验,发现沙门氏菌耐药性越来越强。同时进行了51株分离株对四环素、链霉素、氨苄青霉素、氯霉素和磺胺等5种抗菌药物的耐药性试验,结果前4种抗生素MIC超过16μg/mL的菌株依次为35株(68.6%,35/51)、37株(72.55%,37/51)、16株(31.37%,16/51)和36株(70.59%,36/51),对磺胺MIC超过1 600μg/mL的菌株达51株(100%,51/51)。结果提示控制抗生素盲目使用刻不容缓。     

鸡沙门菌环丙沙星耐药株acrA基因突变特征分析

提取体外诱导的3株不同耐药水平鸡源性沙门菌环丙沙星耐药株的染色体DNA(分别为16×MIC、64×MIC、128×MIC).设计引物acrAF和acrAK,对耐药菌株acrA全基因序列进行克隆及序列分析.与质控菌株C79-13相比,菌株16×MIC的acrA基因第121位碱基发生T→C突变;菌株64×MIC的acrA基因第393位碱基发生C→突变,第1109位碱基发生A→G突变;菌株128×MIC的acrA基因第1121位碱基发生C→T突变.菌株16×MIC的碱基突变导致acrA基因的第40位氨基酸发生M→T取代,即Met→Thr;菌株64×MIC的碱基突变导致acrA基因的第131位氨基酸发生A→C取代,即Arg→Cys;而菌株128×MIC碱基突变并没有导致相应氨基酸的改变.上述结果提示,acrA基因的突变可能并非鸡源性沙门菌耐药性产生的主要原因.     

规模化猪场猪源沙门氏菌的耐药性及相关耐药基因检测

为了解贵州省某规模化猪场猪源沙门氏菌分离株的药物敏感性和耐药基因的存在情况,也为进一步研究细菌耐药的分子机制和临床用药提供资料,利用K-B法检测了6株猪源沙门氏菌对15种药物的敏感性,采用PCR方法检测了9种常见耐药基因在分离株中的分布情况。结果显示,所有菌株对青霉素、氨苄西林和吡哌酸的耐药率最高均为100%,对头孢克洛、链霉素和庆大霉素的耐药率最低。从9种常见耐药基因中扩增到3种β-内酰胺类耐药、3种氨基糖苷类、2种氟喹诺酮耐药基因。研究表明,沙门氏菌极易产生耐药性,耐药基因广泛存在于耐药菌株中,但耐药表型与耐药基因之间无绝对相关性。     

错配PCR方法快速检测耐FQs沙门氏菌基因突变的初步研究

根据耐药沙门氏菌基因突变位点碱基变化情况,设计合适的引物进行错配PCR,鉴别突变位点,使其结果与测序结果相吻合,以建立错配PCR方法快速检测耐氟喹诺酮类药物沙门氏菌基因突变,判断菌株是否耐药.错配PCR检测方法条件优化成熟之后,对经过测序的菌株进行耐药突变位点的快速检测,检测结果与测序结果符合率高达96%.     

Detection of mutations in the gyrA gene and class I integron from quinolone-resistant Salmonella enterica serovar Choleraesuis isolates in Taiwan

The quinolone resistance-determining regions (QRDRs) of the gyrA gene of quinolone-resistant Salmonella enterica serovar Choleraesuis isolates were sequenced. Four types of point mutation, Ser-83-to-Phe (TCC→TTC), Ser-83-to-Tyr (TCC→TAC), Asp-87-to-Gly (GAC→GGC), and Asp-87-to-Asn (GAC→AAC), were found. PCR-RFLP and MAS-touch down PCR were performed on fifty swine clinical isolates of S. enterica serovar Choleraesuis (Nal^R) collected during 1997–2002. The analysis indicated seven isolates with point mutations in codon 83, 13 with point mutations in codon 87, and 30 with double mutations in both codons 83 and 87. The MICs of enrofloxacin of the isolates with a single mutation in codon 83 or 87 were <2 μg/ml, while the MICs of the isolates with double mutations in both codon 83 and 87 ranged from 2 to 64 μg/ml. A class I integron comprised of dhfr, orfF and aad2 was also identified in both human and swine S. enterica serovar Choleraesuis isolates. These results indicate that PCR-RFLP and MAS-touchdown PCR assays can be used for surveillance of gyrA gene mutations, which are important for fluoroquinolone resistance in Salmonella. Isolates with double mutations in gyrA codons 83 and 87 are the major type of quinolone-resistant Salmonella isolated from swine in Taiwan. A surveillance system may be applied to the swine industry to monitor the emergence of fluoroquinolone and/or multi-drug-resistant S. enterica serovar Choleraesuis in Taiwan.     

广州市农贸市场猪肉源伦敦沙门菌的流行情况及耐药性分析

本研究旨在探究广州市2016年5-10月农贸市场猪肉源伦敦沙门菌的流行和耐药情况.从广州市农贸市场采集样品198份,分离得到28株猪肉源伦敦沙门菌,用K-B法测定其对18种抗菌药物的耐药性,用PCR方法鉴定其所携带的耐药基因.结果表明,市场猪肉样品中沙门菌的阳性率为74.2％(147/198),伦敦沙门菌的分离率为19...     

鸭源沙门菌江苏分离株的生物学特性研究

为了解鸭源沙门菌江苏分离株的主要生物学特性,本研究对2012年至2013年从发病或死亡鸭中分离的33株沙门菌分离株进行鉴定,即采用玻片凝集法对分离的沙门菌进行血清学分型,多重PCR方法检测17种毒力基因的分布,按照美国临床和实验室标准化研究所制定的方法进行药物敏感性检测,通过结晶紫半定量法检测分离菌株的生物被膜形成能力.33株鸭源沙门菌的血清学分型结果显示,查理沙门菌占48.5％,为优势血清型.毒力基因检测结果显示,pagC、msgA、sipB、prgH、spaN、tolC、iroN、sopB及pefA为保守基因.药物敏感性检测显示,42.4％的菌株耐受8种以上药物.生物被膜检测显示,有14株细菌生物被膜形成能力为中等以上,其中57.1％的菌株耐8种以上的药物.     

Clonal Spread of Salmonella enterica Serovar Infantis in Serbia: Acquisition of Mutations in the Topoisomerase Genes gyrA and parC Leads to Increased Resistance to Fluoroquinolones

Quinolone‐resistant Salmonella Infantis (n = 64) isolated from human stool samples, food and poultry during the years 2006–2011 were analysed for their resistance phenotypes, macrorestriction patterns and molecular mechanisms of decreased susceptibility to fluoroquinolones. Minimum inhibitory concentrations (MICs) of nalidixic acid (NAL) and ciprofloxacin (CIP) were determined by the agar dilution procedure, and the susceptibility to additional antimicrobial agents was determined by the disc diffusion method. To assess the influence of enhanced efflux activity, MICs were determined in the presence and absence of the inhibitor PAβN. The results of pulsed‐field gel electrophoresis (PFGE) typing revealed that quinolone‐resistant S. Infantis in Serbia had similar or indistinguishable PFGE profiles, suggesting a clonal spread. All S. Infantis showed combined resistance to NAL and tetracycline, whereas multiple drug resistance to three or more antibiotic classes was rare (2 isolates of human origin). The MICs ranged between 512 and 1024 μg/mL for NAL and 0.125–2 μg/mL for CIP. A single‐point mutation in the gene gyrA leading to a Ser83→Tyr exchange was detected in all isolates, and a second exchange (Ser80→Arg) in the gene parC was only present in eight S. Infantis isolates exhibiting slightly higher MICs of CIP (2 μg/mL). The inhibitor PAβN decreased the MIC values of CIP by two dilution steps and of NAL by at minimum 3–6 dilution steps, indicating that enhanced efflux plays an important role in quinolone resistance in these isolates. The plasmid‐mediated genes qnr, aac(6′)‐lb‐cr and qepA were not detected by PCR assays.     

鸡源性沙门氏菌DNA旋转酶与耐氟喹诺酮类药物关系研究

取临床分离的、对5种氟喹诺酮类药物（环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、单诺沙星和沙拉沙星）均耐药的9株鸡源性沙门氏菌耐药株,提取其染色体DNA。设计引物gyrAF和gyrAR、gyrBF和gyrBR,分别扩增菌株DNA旋转酶gyrA基因和gyrB基因的氟喹诺酮类耐药决定区（QRDR）,对PCR扩增产物进行测序及序列分析。与质控菌株相比,9株临床分离耐药株中只有菌株38和60的gyrA基因发生单碱基突变,菌株38的gyrA基因第371位碱基发生C→T突变,菌株60的gyrA基因第350位碱基发生A→C突变,两处突变均位于QRDR内,其余菌株的核苷酸未发生任何突变。菌株38的碱基突变导致gyrA基因第99位氨基酸发生R→C取代,即Arg→Cys;菌株60的碱基突变导致gyrA基因第92位氨基酸发生M→L取代,即Met→Leu。9株临床分离鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株gyrB基因QRDR的核苷酸序列与质控菌株完全相同;只有菌株42的gyrB基因第1592位碱基发生C→A突变,但其位于gyrB基因QRDR之外,且菌株42的gyrB基因的碱基突变并没有导致相应氨基酸的改变。上述结果提示,DNA旋转酶gyrA基因和gyrB基因QRDR突变可能并非沙门氏菌耐药性产生的主要原因。     

耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌基因突变的MAMA-PCR检测

采用MAMA-PCR法对72株已知突变菌株的突变情况进行了检测。结果，有2种gyrA83位突变：TCG→TTG和TCG缺失；4种gyrA87位突变：GAC→AAC、GAC→GGC、GAC→TAC和GAC→CAC；1种parC80位突变：AGC→ATC以及4种parC84位突变：GAA→AAA、GAA→GCA、GAA→GGA和GAA→GTA。采用同样的方法，对38株未知突变菌株的检测结果显示，gyrA83、gyrA87、parC 80和parC84位的突变检出的正确率分别为97．4％、94．7％、81．6％和94．7％。结果表明，MAMA-PCR有望成为监测耐氟喹诺酮类药物大肠埃希氏菌的分子生物学常规方法。     

鸡源印第安纳沙门菌多重耐药性分析

采集山东不同地区鸡源沙门菌,根据Kauffmann-White方法测定分离株血清型,采用肉汤微量稀释法测试分离株对16种抗菌药物的敏感性,PCR方法检测10种耐药基因,分析耐药表型和耐药基因之间的关系。结果显示：共鉴定出沙门菌80株,其中印第安纳沙门菌60株。药敏试验证实：60株印第安纳沙门菌对阿莫西林-克拉维酸、头孢唑啉、多黏菌素、氨苄西林、多西环素和甲氧苄啶等16种抗菌药物普遍耐药。88.33%菌株多重耐药分布在12~15耐,未发现3耐以下的菌株。PCR扩增出int1,blaTEM,aac（6’）-Ib-cr,floR,catA1,tetA,strA,cmlA 8种耐药基因。超过90%的菌株携带int1,blaTEM,floR和aac（6’）-Ib-cr耐药基因。上述结果表明,耐药表型及耐药基因的符合呈现相关性。     

Detection of Resistance and Resistance Genes of Salmonella from Swine in Xinjiang

The objective of this study was to investigate the resistance of Salmonella and prevalence of resistance genes isolated from a pig farm in Xinjiang, and their coexistence with the major β-lactamases, 16S rRNA methylation enzyme genes and PMQR. The minimum inhibitory concentrations of Salmonella isolated from the pig farms were determined by agar dilution method, PCR was used to detect bla_TEM, bla_CMY-2, bla_CTX-M, bla_LAP-1, bla_KPC, bla_OXA and bla_SHV genes, 16S rRNA methylation enzyme genes armA and rmtB, and PMQR including qnrA, qnrB, qnrC, qnrD, qnrS, qepA, oqxA, oqxB and aac(6')-Ib genes. The positive strains were performed by using DNA sequencing to determine the purpose of the belt. The result showed that resistant rate of Salmonella isolates from swine were highest to ciprofloxacin and apramycin sulfate (77.9%, 102/131). Resistant mainly based on 8 kinds of drug resistance (29.0%, 38/131), 11 kinds of resistance genes were detection, the coexistence of different genotypes had 24 types. The main types were bla_TEM+bla_OXA+qnrS+aac(6')-Ib-cr+oqxA+oqxB (27.6%, 32/116), bla_TEM+bla_OXA+qnrS+oqxA+oqxB (24.1%, 28/116) and bla_TEM+qnrS (18.0%, 21/116). The Salmonella isolated from the farm had phenomenon seriously resistance, it coexisted with the main β-lactamase, 16S rRNA methylation enzyme genes and PMQR factors. The result suggested that it should strengthen monitoring to the β-lactamase enzymes, 16S rRNA methylation enzyme genes and PMQR factors.