家蚕翅原基发育的研究进展

家蚕翅原基在幼虫期生长缓慢,从五龄开始至蛹期,翅原基的形态发生了巨大的变化。造成这些变化的原因是蜕皮激素和保幼激素的作用导致了一系列翅原基发育相关基因的转录、表达水平的改变。翅原基易于摘取,体外培养的技术方法也已经很成熟,这对于研究翅原基的发育是很好的条件,基于翅原基是个很好的研究材料,很多学者为揭示翅原基的发育过程做了大量的实验研究。     

家蚕翅原基的一些发育规律研究

为进一步解明家蚕的生长发育机制 ,调查了家蚕 5龄幼虫及蛹期翅原基的大小和形态变化 :翅原基在 5龄前期生长缓慢 ,变态前生长最快 ,2～ 3d及 8～ 11d为形态变化最大的两个时期 ;蛹期翅芽基本不变 ,3d始见初生鳞毛 ,5d时已经呈浓密的毛状 ,8d时翅面鳞毛发育成柳叶状 ,之后逐渐出现分叉 ,9d花纹清晰可见 ,化蛾后翅面鳞片呈现棕榈叶状。进行翅原基摘除和异位移植发现 :4个翅原基全部摘除后家蚕仍能正常生长并发育成蛹和具有交配及产卵能力的蛾 ,表明家蚕血球和造血器官有很强的再生能力 ,家蚕血球细胞的生成可能具有更复杂的机制 ,由此证明了家蚕翅原基异位移植的可行性。     

家蚕Met1基因的表达与组织定位分析

选择家蚕基因组中与果蝇Dm Met(Methoprene tolerant protein)同源的基因Bm Met1进行研究。预测Dm Met和Bm Met1的结构域均是一个b HLH-PAS(basic helix-loop-helix Per-ARNT-SIM)型转录因子,具有典型的DNA结合结构域。在原核系统表达获得了Bm Met1蛋白并制备了抗体。qRT-PCR和Western blotting检测结果显示,无论是Bm Met1基因mRNA的转录还是Bm Met1蛋白的表达,在家蚕5龄中后期和吐丝期的翅原基组织中都呈现较高水平,而在蛹期呈现较低的水平。通过免疫组织化学方法分析Bm Met1的组织定位,结果显示该蛋白质在5龄第6天和吐丝期家蚕胸节表皮、脂肪体及翅原基等组织中都有较高水平的表达,在蛹期上述部位和组织的表达水平较低。分别将蜕皮激素(20E)和保幼激素类似物(Methoprene)按照2μg/头的剂量注射到5龄第3天幼虫第2~3胸节间,qRT-PCR检测幼虫翅原基组织中的Bm Met1受到Methoprene的诱导上调表达,且在处理2 h后表达水平最高。上述结果暗示Bm Met1可能参与了保幼激素对家蚕翅原基生长分化的调控。     

家蚕Gar1p基因的克隆表达及生物信息学分析

在对家蚕功能基因筛选中获得一条长844 bp的基因序列,其编码蛋白与一种富含甘氨酸和精氨酸的核仁小分子RNA结合蛋白(glycine and arginine-rich nucleolar protein,Gar1p)的同源性达63%。利用生物信息学方法分析了该基因上游的启动子序列,发现该基因不含内含子,由1个699 bp的单一外显子编码232个残基的蛋白,预测分子量为22.4 kD,等电点11.43。该Gar1p蛋白的疏水性最大值为1.167,最小值为-2.011,其序列的两端各有1个强亲水性的GAR区域,而中间含有5个潜在的磷酸化位点。Gar1p基因已从家蚕基因组中扩增得到,并克隆进表达载体pET-28a中,在大肠杆菌中得以表达,为研究其功能提供了条件。     

家蚕翅原基表皮蛋白基因BmWCPs的生物信息学分析与激素诱导表达特征

翅原基表皮蛋白(WCPs)在昆虫翅的发育中起着非常重要的作用。为了研究家蚕翅原基表皮蛋白基因BmW CPs的表达是否与蜕皮激素(20E)的调节有关,用生物信息学方法分析BmW CPs基因的序列结构与系统进化特点,并通过半定量RT-PCR检测蜕皮激素对部分BmW CPs基因表达的诱导作用。11个BmW CPs基因成簇分布在家蚕基因组中,除BmW CP6和BmW CP10分别分布在第7号、第21号染色体外,其余的BmW CPs均分布在第22号染色体上;11个BmW CPs的核苷酸序列长度为588~2 670 bp,编码115~312个氨基酸,蛋白质分子质量12~35 kD,等电点4.30~7.45;11个BmW CPs基因的ORF内均有内含子插入,81.82%的基因含有2~3个内含子,内含子长度50~5 958 bp,在50~300 bp之间分布频率最高,占46%。将解剖获取的上蔟1 d蚕体的翅原基进行体外培养,并用浓度为2μmol/L的20E直接处理12 h后再常规培养18 h,提取翅原基总RNA并反转录合成cD NA,经半定量RT-PCR检测样品中BmW CPs的表达水平显著上调。依据上述研究结果初步认为,用蜕皮激素直接处理12 h后再常规培养18 h的脉冲作用,可诱导基因组中成簇分布的BmW CPs在翅原基组织中大量表达,以利于家蚕完成翅原基的变态发育。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin-6在不同发育时期的表达分析

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)是一类具有重要生理调控功能的蛋白酶超家族。为研究家蚕serpin-6基因(Bmserpin-6)在蚕体内的功能,利用半定量RT-PCR方法,分析该基因mRNA在家蚕不同发育时期的转录水平。Bmserpin-6基因在家蚕各个发育阶段均有表达,在4龄眠期、5龄6d、吐丝48h(化蛹前)和化蛹6d的转录水平较高,在5龄4d、吐丝初期和蛹末期的转录水平较低。Bmserpin-6基因在5龄期家蚕精巢和卵巢中的表达均呈现先下降后上升的趋势。研究结果表明,Bmserpin-6基因mRNA的转录具有明显的时空特异性,推测其在家蚕不同的变态发育期执行不同的功能。     

家蚕CIb1基因启动子活性分析

用PCR方法从家蚕基因组DNA扩增了家蚕胰凝乳蛋白酶抑制剂b1基因(CIb1)4个不同长度的启动子片段,构建由其驱动的萤火虫荧光素酶基因报告质粒,在脂质体介导下转染家蚕BmN细胞,体外分析了该基因启动子的活性。结果表明,家蚕CIb1基因启动子在BmN细胞中有微弱的转录活性;野生型BmNPV感染能增强启动子活性;hr3增强的不同长度CIb1基因启动子片段的活性有显著差异,提示转录起始位点上游-74～-1nt包含了启动子的基本元件,而在-687～-465nt、-465～-317nt和-317～-74nt存在着主要的顺式元件。试验结果有助于阐明CIb1的表达调控机理和对家蚕天然性免疫的理解。     

家蚕卵巢肿瘤基因Bmotu及其可变剪接

已知卵巢肿瘤基因(ovarian tumor gene,otu)在果蝇(Drosophila melanogaster)卵巢发育过程中发挥极其重要的作用,该基因突变会扰乱卵子形成的正常过程。为探究家蚕(Bombyx mori)是否具有类似果蝇生殖发育相关基因otu的同源基因,以及基因存在的可变剪接形式,在电子克隆的基础上,应用RT-PCR从家蚕精巢组织中获得了4条不同长度的Bmotu cDNA片段(GenBank登录号:HQ831341,HQ831342,HQ999998,HQ831343),其中3条由于无义突变导致翻译提前终止;而从卵巢组织中仅获得了1条Bmotu cDNA片段,该片段序列与精巢中扩增的登录号为HQ831343片段序列的5'端相同。结果表明Bmotu基因存在可变剪接,且雌、雄之间的剪接方式可能存在差异。生物信息学分析发现Bmotu基因编码蛋白与果蝇Otu的结构类似,含有半胱氨酸蛋白酶结构域(Otu结构域)、Tudor结构域、脯氨酸基序。研究结果有助于进一步探讨家蚕生殖发育机制。     

荧光素酶基因在家蚕细胞中的表达

本文将含有萤火虫荧光素酶基因的质粒pGL3,用脂质体转染方法转染家蚕BmN细胞,加入检测底物后,检测到了荧光素酶基因的表达产物——荧光发射,并进行了荧光扫描测试,测定了在波长562nm处的荧光发射动力学图谱。     

家蚕五龄至预蛹期翅原基及造血器官的切片观察

通过家蚕翅原基石蜡组织切片H.E染色和DAPI荧光染色的方法对五龄至预蛹期家蚕翅原基及造血器官的形态结构进行显微观察。实验发现:翅原基在预蛹前变化不大,而到预蛹期发育加快。翅芽细胞在5龄初到蛹前一直保持着器官芽状态,细胞密集,核物质丰富,占细胞比例大。造血干细胞的细胞核较大,在化蛹前进行大量增殖,随造血器官的破裂造血干细胞并散落到体腔中。     

家蚕发育不齐的原因及应对措施

蚕的生长发育与其所处的环境条件密切相关,任何一个因素发生变化,与蚕的生理需求不符,都会导致其发育不齐。分析了目前生产上存在的诸多不利因素,提出了在蚕种补催青和饲育阶段促使蚕儿发育齐一的应对措施。     

家蚕P450基因CYP305B1的基因组序列克隆及结构分析

为了研究家蚕P450基因CYP305B1的结构,采用反向PCR技术克隆了家蚕CYP305B1基因的基因组序列,经序列测定,拼接得到家蚕CYP305B1全基因序列,发现家蚕CYP305B1的第1内含子位于5′端非翻译区序列(5′-UTR)中间。将家蚕CYP305B1与野桑蚕P450基因CYP305B1V1序列进行同源性比较的结果表明,二者在5′-UTR上游-400～-770 bp序列间的同源性只有40.4%,序列差异最大的是第1内含子和第6内含子。在第1内含子中,野桑蚕CYP305B1V1在翻译起始密码ATG上游-340之前存在330 bp的插入序列,在-110～-340 bp间二者的同源性也只有46.9%;在第6内含子中,家蚕CYP305B1比野桑蚕CYP305B1V1多了一段约300 bp的插入序列。研究结果有助于进一步探究该基因的转录和调控机制。     

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。     

家蚕脂肪酶基因Bmlipase-1在不同BmNPV抗性水平家蚕品种间的表达差异

家蚕脂肪酶Bmlipase-1在家蚕中肠组织特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(BmNPV)感染的活性。以对BmNPV具有不同抗性水平的6个家蚕品种为材料,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术,检测Bmlipase-1基因在不同家蚕品种5龄期健康幼虫中肠组织的表达水平及感染BmNPV后的5龄期幼虫中肠组织中该基因的表达水平变化,探究该基因表达水平与家蚕对BmNPV的抗性水平的关系。结果表明:不同家蚕品种间Bmlipase-1的表达水平差异显著,抗性较强的品种,其表达水平较高,6个供试品种5龄幼虫中肠组织中的Bmlipase-1表达水平依次为NIL.LVR>P50>CVDAR18>nsd.NIL>892>306,抗性较强品种NIL.LVR 5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306的8.2倍;BmNPV能够诱导Bmlipase-1的表达,但不同品种间该基因的诱导表达差异显著,仍表现为抗性较强的品种该基因的诱导表达水平较高,NIL.LVR经BmNPV感染诱导后Bmlipase-1在5龄期的平均表达量约为抗性较弱品种306平均诱导表达水平的12.4倍。推测Bmlipase-1的表达水平与蚕体自身对BmNPV的抗性水平有一定的关联性。     

ie-1和lef-1基因dsRNA表达元件转染及转化细胞对家蚕核型多角体病毒增殖的抑制

通过RNAi介导可以抑制病毒增殖,将相应的RNAi元件通过转基因转入宿主有可能使宿主对病毒产生一定的抗性。根据家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因组中的病毒复制必需基因ie-1、lef-1设计相应的RNA干扰区段,并构建相应的转基因载体转入家蚕BmN细胞中,瞬时表达结果显示转染了转基因RNAi载体的BmN细胞均对BmNPV有一定的抑制作用。IE dsRNA在病毒滴度为10-4时有抑制作用,在病毒滴度为10-5时有比较好的作用;LEF dsRNA则在病毒滴度为10-5时有抑制作用,在病毒滴度为10-6时有较好的抑制作用。通过转基因及G418筛选后,转基因IE dsRNA细胞在病毒滴度为10-4显示出一定的抑制作用,在病毒滴度为10-5表现了明显的抑制作用;而转基因LEF dsRNA细胞在病毒滴度为10-5有一定的抑制作用,但只维持了一个时段。     

两栖类早期发育的基因调控

在两栖类受精卵的植物极附近的皮 层下区有一种特殊的细胞质,称为生殖质,卵 裂后凡是含有这种生殖质的卵裂球就是原生 殖细胞,后者在不同动力的作用下以一定方 式进行迁移,最终形成生殖细胞。基因与个 体发育有复杂的关系,据近40年的生物化学 和遗传学的研究证实,基因不直接控制性状 发育,而是控制生化过程,从而影响到个体发 育和分化。文章从基因表达时的不同作用水 平对两栖类早期发育的基因调控进行了综 述,并且阐述了参与发育的基因家族的作用 方式与功能。     

CPT-1基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达研究

[目的]为了比较分析肉碱脂酰转移酶-1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT-1)基因在湘西黄牛不同组织中的发育性表达规律,以探讨CPT-1基因与肉牛脂肪代谢的关系。[方法]试验选取湖南德农牧业集团有限公司国家级保种场不同月龄(6月龄、18月龄和30月龄)湘西黄牛各4头,利用实时荧光定量PCR检测肝脏、背最长肌、皮下和腹腔脂肪组织CPT-1基因的相对表达量。[结果]结果表明,(1)CPT-1基因在湘西黄牛肝脏、背最长肌、皮下脂肪和腹腔脂肪的4个部位中的表达量随月龄增加依次极显著降低(P<0.01)。(2)在6月龄、30月龄时,CPT-1基因在湘西黄牛肝脏、背最长肌、皮下脂肪和腹腔脂肪的4个部位中的表达量无显著差异(P>0.05)。(3)在18月龄时,CPT-1基因在皮下脂肪中的表达量显著高于背最长肌(P<0.05),肝脏与腹腔脂肪中CPT-1基因的表达量与其他3个组织中CPT-1基因的表达量无显著差异(P>0.05)。[结论]说明CPT-1基因对湘西黄牛机体脂肪代谢具有重要作用,CPT-1基因在湘西黄牛主要脂肪代谢部位(肝脏、背最长肌、皮下脂肪和腹腔脂肪)均有表达,且CPT-1基因的表达量随月龄与部位的不同,存在月龄间差异性和组织间相似性与差异性。     

家蚕脂肪酶-1基因(Bmlipase-1)的启动子活性分析

家蚕脂肪酶-1(Bmlipase-1)在蚕体中肠组织中特异性表达,具有抵抗家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)侵染的活性。用PCR方法扩增了Bmlipase-1启动子的8个不同区域片段,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,分别构建重组家蚕杆状病毒并注射感染家蚕幼虫后,通过荧光观察、荧光定量PCR和ELISA方法,检测报告基因在家蚕中肠中的表达量,以明确对Bmlipase-1具有转录调控活性的启动子片段。结果表明:Bmlipase-1启动子-1 453~192 bp区域的活性最强;在-1 453~-679 bp区域有与Bmlipase-1在中肠组织特异性表达相关的启动子保守序列及1个CAAT box和大量的GATA序列等正调控元件,推测该区域可能与Bmlipase-1的组织特异性表达有关;-81~493 bp区域涵盖核心启动子区、第1外显子区和第1内含子区,含有大量Pbx-1转录因子结合位点、OTC序列和GATA序列,推测该区域发挥对Bmlipase-1转录的基础调控作用;-1 980~-1 452 bp区域存在负调控元件。研究结果有助于进一步揭示Bmlipase-1的转录调控机制。     

家蚕丝蛋白基因在不同发育时期表达量的变化

本文采用半定量RT-PCR方法,检测了家蚕4～5龄期丝腺中5个丝蛋白基因(Fib-H、Fib-L、Ser-2短片段、Ser-2长片段、Ser-3)在不同发育时期表达量的变化。结果表明,Fib-H、FIB-L及Ser-3基因的表达规律相似,总体上4龄期表达量明显低于5龄,但4龄眠期均有明显表达,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,至熟蚕或熟蚕后2d达到高峰,此后迅速下降;Ser-2基因两个转录本的表达规律基本一致,与以上3个基因相比,Ser-2基因在4龄期存在相对较高的表达量,但在4龄眠期表达量明显降低,从5龄起蚕以后表达量逐渐上升,Ser-2短片段和长片段分别从5龄96h和144h之后表达量开始降低,到熟蚕期基本达到最低值。