催青温度对家蚕二化性品种滞育激素受体基因表达的影响及基因的结构特征

家蚕二化性品种的卵滞育与否受上代环境影响,25℃高温明催青将产滞育卵,而15℃低温暗催青将产非滞育卵。为探究催青温度调控二化性家蚕滞育的分子机制,对从家蚕卵巢细胞中克隆的家蚕滞育激素受体基因(Bmdhr)的5种cDNA进行生物信息学分析,结果表明Bmdhr基因的5种cDNA由相同的mRNA转录本通过不同的剪接方式而来,其中Bmdhr mR-NA-1与Bmdhr mRNA-2编码的氨基酸序列相同,Bmdhr mRNA-4编码的氨基酸序列与家蚕滞育激素BmDHR-1的序列相似度达99.2%。将家蚕二化性品种秋丰的蚕卵用蛾区半分法分成2组,分别以15℃暗催青和25℃明催青,利用实时荧光定量PCR分析催青温度对家蚕不同发育时期及蚕体组织中Bmdhr基因mRNA转录的影响。结果显示:Bmdhr mRNA-1主要在蛹期卵巢中表达,在对滞育激素最敏感的化蛹后4 d时,其转录水平急速上升至峰值,并且高温催青的转录水平高于低温催青;Bm-dhr mRNA-4主要在各发育时期的蚕体血液中表达,特别是在高温明催青条件下,其在蛹期血液中的转录水平是低温暗催青的7.7倍,说明BmDHR-4可能是决定家蚕二化性品种卵滞育与否的关键因子之一;Bmdhr mRNA-5在化蛹后2～3 d的卵巢中转录水平高,且低温催青的转录水平高于高温催青,化蛹后3 d其转录水平开始下降,至化蛹后4～5 d 2种催青处理间的转录水平无显著差异。研究结果为阐明家蚕滞育的分子机制积累了实验数据。     

家蚕不同化性品系间DNA甲基转移酶基因转录特性及胚胎早期甲基化水平差异分析

DNA甲基化修饰参与昆虫胚胎发育。家蚕是典型的胚胎滞育昆虫,为探明家蚕DNA甲基化在胚胎发育及滞育调控中的作用,以不同化性家蚕品系为材料,包括一化性品系安康4号(V¹AK4)和鲁一(V¹Lu1)、二化性品系秋丰(V²QF)和P50(V²P50)、有滞育多化性品系四海(V³SH)、无滞育多化性品系Nistari (V³Nistari),利用qRT-PCR技术分析家蚕甲基化酶基因BmDnmt在家蚕不同化性品系的表达水平,并利用免疫荧光法测定胚胎发育早期DNA甲基化水平。结果显示,在胚胎发育早期BmDnmt1和BmDnmt2在V¹AK4、V²P50和V³Nistari品系中表达水平较高,在V³Nistari品系中BmDnmt1的表达水平显著高于V³SH品系;在幼虫期,BmDnmt1和BmDnmt2在多化性家蚕卵巢或精巢组织中表达水平显著高于二化性家蚕,且...     

家蚕滞育激素基因的克隆及在多化性和二化性品种间的表达差异

在之前的试验中给家蚕多化性品种马富(MF)的蛹体注射滞育激素仍无法诱导其产下滞育卵,为探究其原因,从该品种5龄第3天幼虫头部组织克隆了滞育激素基因(Bm DH)的全长c DNA,BLAST比对显示该基因编码氨基酸序列与NCBI数据库中来自家蚕二化性品种大造的Bm DH氨基酸序列(Gen Bank登录号:BAA059713)的相似度为90.1%,但存在差异的序列不包含滞育激素作用的功能区域。运用半定量RT-PCR与实时荧光定量PCR技术检测Bm DH基因在3个不同化性家蚕品种蛹期头部和卵巢的转录水平存在差异,转录水平从高到低依次为二化性家蚕品种C108,多化性品种MF、尼斯塔里;Bm DH在多化性家蚕品种MF的5龄期雌性和雄性幼虫的头部、血液、生殖腺3个组织中有转录,在中肠、丝腺、马氏管、表皮、脂肪体5个组织中没有检测到转录。研究结果初步提示:家蚕无滞育现象可能与体内滞育激素不足有关;但多化性品种MF不能被蛹期体外注射滞育激素诱导产生滞育卵与Bm DH基因的转录表达水平并无直接的关系。     

家蚕滞育激素受体基因(BmDHR)的分子克隆及定量分析

家蚕滞育激素受体(BmDHR)能特异性地识别滞育激素(DH),参与滞育激素信号的转导,在家蚕滞育发动过程中发挥重要作用。采用RT-PCR方法克隆出BmDHRcDNA,其开放阅读框长1 311 bp,编码436个氨基酸,属于一种G蛋白偶联受体,含有7个跨膜结构域。同源性及系统进化分析表明,BmDHR蛋白序列与玉米夜蛾性信息素合成激活肽受体(HzPBANR)和家蚕性信息素合成激活肽受体(BmPBANR)蛋白序列具有较高的同源性,分别为46.0%和40.9%。定时半定量分析显示,BmDHR基因表达水平在不同条件催青的二化性5龄幼虫、蛹体中存在差异。     

家蚕Polycomb家族基因BmEsc功能结构域编码序列的克隆及表达分析

Polycomb蛋白(polycomb group proteins,PcG)主要包含PRC1和PRC2 2个核心蛋白质复合体,其中PRC2在靶基因转录抑制起始阶段发挥作用,ESC作为PRC2的一个关键蛋白质,通过参与组蛋白H3K27me3的修饰来抑制基因转录。为了研究家蚕PcG蛋白的功能,克隆了长度为876 bp的家蚕Esc基因(BmEsc)WD40功能结构域编码序列,构建重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,成功表达并纯化了目的蛋白质,可用于进一步的抗体制备和功能研究。利用实时荧光定量PCR检测BmEsc基因在家蚕不同发育时期的表达特征:非滞育卵中该基因的表达水平在卵期1~5 d相对较高,而滞育卵中该基因在卵期1~2 d的表达量低于非滞育卵,卵期6~9 d的表达量却高于非滞育卵,并保持较稳定水平;该基因在各龄幼虫龄中期的表达量较低,在5龄1~3 d和化蛹前的一段时期表达量较高,在蛹期的表达水平变化不大。初步推测BmEsc可能在家蚕早期胚胎发育、滞育卵中的靶基因沉默以及在幼虫蜕皮前后和化蛹变态前的组织分化过程中发挥重要作用。     

家蚕葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶家族基因BmGMCβ2的克隆及序列与表达分析

葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(glucose-methanol-choline oxidoreductases,GMC)家族是昆虫体内一大类以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅酶的氧化还原酶类,家蚕基因组中含有43个GMC家族基因。以家蚕5龄幼虫cDNA为模板克隆到一个家蚕GMC家族基因,命名为BmGMCβ2(GenBank登录号:JQ965926)。该基因cDNA全长1 875 bp,编码624个氨基酸,预测蛋白质分子质量为69.3 kD,pI为6.21,定位于家蚕16号染色体的nscaf3058上,编码蛋白质含GMC家族共有的ADP-bindingβ-α-β折叠结构域。系统发育分析表明该基因是家蚕GMC家族β亚家族基因成员。RT-PCR检测家蚕不同发育时期和5龄第3天幼虫不同组织中BmGMCβ2基因mRNA转录水平,以5龄盛食期最高,并且主要在表皮、脂肪体和气管中转录表达;Westernblotting分析BmGMCβ2蛋白主要在5龄第3天幼虫的脂肪体中表达。将BmGMCβ2克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,转化E.coli BL21表达菌株,IPTG诱导表达BmGMCβ2融合蛋白,通过His-亲和层析得到纯化的融合蛋白并制备多克隆抗体,为后续研究该蛋白在家蚕生长发育过程中的功能奠定了基础。     

家蚕浅暗化型突变的初步探究

安徽省农业科学院蚕桑研究所家蚕育种组在培育暗化型家蚕品系580的过程中,发现并分离出了在发育各阶段黑化程度均比正常暗化型家蚕黑化程度浅的品系——浅580。试验通过克隆比较家蚕品系580与浅580暗化相关基因BmiAANAT与BmiAANAT2的碱基序列和相对表达量对浅580的发生原因进行了初步探究。结果发现,家蚕品系580与浅580克隆的暗化突变基因Bmi AANAT均存在2种突变类型且碱基序列相同,它们的Bmi AANAT2的碱基序列也无差异;蛹期第7天时家蚕品系580暗化相关基因BmiAANAT与BmiAANAT2的相对表达量分别是浅580的8. 3倍和3. 0倍。表明家蚕品系浅580的发生并不是暗化相关基因BmiAANAT与BmiAANAT2碱基序列突变造成的,而与2个基因的差异表达有关联。     

家蚕滞育机理研究进展

滞育是昆虫适应环境的重要生理特性,家蚕的滞育还与其经济性状有着密切关系,相关生物学问题一直是研究热点。家蚕滞育发生于胚胎早期,为卵滞育型,受遗传和环境的共同支配。家蚕二化性品系卵的滞育性由亲代卵期即胚胎发育时期所处的环境条件决定。本文就近年对家蚕滞育及解除过程中生理生化机制、分子机制和遗传机制方面的有关研究进展进行了综述,包括滞育过程中涉及的色素、酯酶A4、多巴胺、氧化循环过程的物质变化,二甲亚砜对解除家蚕滞育的影响以及滞育激素作用过程中瞬时受体电位通道亚家族成员对家蚕滞育非遗传多型性的分子调控机制的最新研究成果。     

家蚕二化性品种(品系)转基因用蚕卵的预处理技术研究

家蚕为卵滞育昆虫,二化性家蚕品种(品系)的化性由上代卵期温度与光照等调控。将若干个二化性家蚕品种(品系)以17~18℃温度催青诱导子代蚕卵非滞育,筛选出1个经济性状较优的实用品种"秋丰"、1个突变品系P33,二者非滞育卵圈比例分别达到96.4%和89.6%,正常催青的良卵实用孵化率分别达到96.11%和98.58%,解决了采用显微注射法以家蚕实用品种构建转基因系统过程中因蚕卵滞育不能及时孵化的难题。另对利用20%盐酸-2%甲醛混合液刺激解除蚕卵滞育的方法以及非滞育蚕卵表面用70%乙醇消毒的方法进行了尝试,前者可以获得96%以上的孵化率,后者可以缩短蚕卵预处理时间。     

家蚕HSP20·8基因体外表达及荧光原位杂交研究(英文)

前期研究发现,相对于其它组织器官,有一种低分子量热激蛋白在家蚕肾型卵中高量表达,并命名为低分子量热激蛋白HSP20.8。为了进一步阐明家蚕低分子量热激蛋白HSP20.8的基因结构、表达特性及其在家蚕染色体上的分布,根据HSP20.8基因cDNA序列设计特异引物,进行了克隆、表达及荧光原位杂交研究。结果表明,该基因含有1个561碱基对的开放阅读框(open reading frame,ORF),与cDNA序列比较分析发现该基因无内含子序列。重组蛋白的分子量在20 kD左右。热激蛋白基因HSP20.8在家蚕基因组中为单拷贝基因,其位点在染色体近中部区域。     

家蚕核苷二磷酸激酶基因的克隆和原核表达

核苷二磷酸激酶(NDPK)基因在进化中高度保守,却又呈现复杂多样的生物学功能。该酶除了催化腺苷三磷酸(ATP)和核苷二磷酸(NDP)之间高能磷酸基团的转移外,还具有NDP激酶活性和蛋白磷酸转移酶活性,并参与转录调控和信号转导。从家蚕蛹cDNA文库中获得家蚕核苷二磷酸激酶的cDNA序列,该cDNA序列长575bp,含465 bp的开放阅读框序列,编码154个氨基酸残基的核苷二磷酸激酶。将克隆的家蚕核苷二磷酸激酶基因插入pET-28 a构建重组质粒,转化大肠杆菌后诱导表达重组蛋白,经镍离子亲和层析柱纯化得到重组家蚕核苷二磷酸激酶。     

家蚕黄血近等基因系SSH文库的构建及部分EST的序列分析

以家蚕黄血品系KY和白血品系HB构建家蚕黄血近等基因系。用回交18代的家蚕黄血基因(Y)近等基因系群体中的黄血个体和白血个体中肠为材料,构建了家蚕黄血近等基因系抑制消减杂交(SSH)cDNA文库。从该抑制消减杂交cDNA文库随机挑选出46个阳性克隆进行测序,并用CAP3软件聚类拼接,得到4个假定基因(contig)和9个已知功能基因(unigenes)。通过BLAST比对和对所得表达序列标签(EST)的同源分析表明,这些基因主要涉及能量代谢因子、RNA分子水平相关调节因子、酶类、结构蛋白等,由此初步探明了参与黄血基因(Y)协同作用的相关基因表达蛋白的种类和数量,可为进一步研究蚕茧着色的分子机制及通过遗传选择培育天然有色茧品种提供基础信息。     

家蚕无滞育期多化性品种的高效益省力化保育技术研究

家蚕品种资源是遗传育种的重要原始材料,为了减少每年对多化性家蚕品种的保育代数,减少劳动强度与保育成本,探讨了滞育激素对多化性品种蚕蛹的影响,试验结果表明：对无滞育期多化性蚕品种的蚕蛹注射微量滞育激素（DH）,可以使蚕蛾产下滞育卵,翌年解除滞育后,恢复无滞育期多化性状,且主要形态特征和经济性状都保持不变.滞育激素最佳注射时期为化蛹后24～ 86 h,蚕蛹注射DH的最佳剂量为2.0μg/个.使用这种方法,可以减少2～3个世代的人工饲料饲育,为无滞育期多化性蚕品种的保存提供了安全有效、省时省力的方法.     

家蚕SoxE基因的全长cDNA克隆和表达谱分析

Sox基因家族是在动物中发现的一类重要的转录调控因子。基于生物信息学和RACE策略,从家蚕胚胎中克隆了一个与果蝇E族Sox基因成员同源的基因的全长cDNA,命名为BmSoxE(GenBank登录号:HQ728280)。BmSoxE的cDNA序列全长为1 398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白序列含有典型的HMG-box结构域和数个磷酸化位点。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕生殖腺中高量表达;时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,Bm-SoxE基因的表达维持在较高水平,暗示BmSoxE基因在家蚕性别决定和分化中可能发挥了调控作用。     

家蚕类免疫球蛋白(hemolin)基因的克隆及表达特征和抗菌活性研究

Hemolin是昆虫的一种重要先天性免疫蛋白,属于免疫球蛋白超家族。克隆了家蚕hemolin基因,其序列全长5 100bp,含有5个外显子和4个内含子,基因cDNA编码含410个氨基酸的蛋白质,预测蛋白的分子质量约44.79 kD,pI 5.12。对该基因表达规律和生物学活性的结果研究表明:该基因只在家蚕蛹期脂肪体内特异性转录和表达,并能够被细菌和病毒诱导在幼虫期表达;该基因体外表达获得的重组蛋白具有抗菌生物学活性,能够有效抑制苏云金芽孢杆菌等的生长,由此暗示家蚕Hemolin蛋白可能在蚕体抵御病毒与细菌的感染过程中发挥重要作用。     

家蚕体节极性基因(Bmdpp)的克隆与表达研究

体节极性基因dpp是昆虫发育过程中的关键基因。采用生物信息学的方法,利用家蚕EST数据获得了家蚕dpp基因(Bmdpp)cDNA序列。该cDNA序列全长1 206 bp,ORF1 146 bp,编码381个氨基酸,预测蛋白分子质量38.6 kD,等电点9.18。将克隆的Bmdpp基因完整CDS序列亚克隆到pET-28a(+)表达载体,转化、诱导后经SDS-PAGE电泳检测到约40 kD与预测分子质量相符的目的蛋白条带。对Bmdpp在家蚕胚胎不同发育时期的表达分析发现,该基因在受精6~14 h的表达量很低,甚至没有表达。这一表达模式和果蝇dpp基因在胚胎发育过程中的表达模式相似,推测Bmdpp在家蚕早期胚胎发育的背-腹轴分化中起作用。     

二化性家蚕卵低温和常温催青的胚胎期蛋白质表达差异分析

家蚕二化性品种的滞育性受上代胚胎期环境条件调控,查找家蚕胚胎期滞育关联蛋白,可为最终阐明家蚕滞育的分子机制提供实验依据。以家蚕二化性品种秋丰的蚕卵为材料,分别在25℃常温和18℃低温条件下催青,提取胚胎不同发育时期蚕卵的易溶性和难溶性蛋白,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和图像分析技术,研究蚕卵在胚胎不同发育时期的蛋白质差异表达谱。在易溶性和难溶性蛋白图谱中分别检测到5个和7个差异显著的蛋白点。对这些差异蛋白点进行质谱鉴定,有8个蛋白点得到可信的最佳匹配蛋白报告,共鉴定出卵特异蛋白、卵黄原蛋白、表皮蛋白和丙酮酸脱氢酶激酶4种蛋白。这些差异表达蛋白可能导致蚕卵胚胎中物质代谢和能量代谢的不同,据此推测低温和常温催青可能在蚕卵胚胎中诱导了不同的生理生化反应。     

家蚕感染BmCPV相关未知功能蛋白LOC101742613的基因克隆及表征特征分析

在感染家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrovirus,BmCPV)的家蚕中肠组织中发现一个表达量明显下调的未知蛋白LOC101742613,与棉铃虫(Helicoverpa armigera)的未知蛋白LOC110378285的序列一致性为51%。利用PCR技术克隆获得了编码该蛋白质的cDNA,其序列全长为1 114 bp,最大开放阅读框(ORF)为993 bp,编码的蛋白质由330个氨基酸残基组成,预测蛋白质分子质量为36.6 kD,等电点为4.31。实时荧光定量PCR分析发现目的基因主要在家蚕的脂肪体、精巢、卵巢和头部组织中表达,且家蚕中肠感染BmCPV后48 h和72 h其mRNA的表达量显著下调,分别为对照组的7.3%和2.1%。通过构建重组表达载体pET28a/BGIBMGA014203对去掉信号肽的目的蛋白进行原核表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现重组蛋白主要在包涵体中,分子质量约为37 kD。研究结果为进一步阐明目的基因的生物学功能奠定了基础。     

家蚕滞育生物钟蛋白质EA4基因的cDNA克隆和序列分析

家蚕滞育生物钟是依赖卵内酯酶A4(EA4)的倒计时型生物钟。EA4是具时间间隔测定酶(time interval measuring enzyme,TIME)功能的蛋白质。根据家蚕EA4测定的氨基酸序列,以第3天龄雌蛹脂肪体和卵巢总RNA为模板,利用简并引物RT-PCR方法,得到308 bp的部分ea4序列,其1-144 nt和145-308 nt分别与家蚕全基因组鸟枪序列(whole genome shotgun sequence,WGS)AADK01019126.1的5595-5738 nt及WGS AADK01014467.1的8636-8473 nt有95%和98%的一致性。根据获得的ea4基因片段序列,利用生物信息学方法和家蚕基因组数据预测了ea4基因的完整cDNA序列,设计特异引物,以雌蛹脂肪体和卵巢RNA为模板,进行RT-PCR得到完整的cDNA。ea4基因的cDNA全长519 bp,其中1-48 bp为信号肽序列,49-519 bp编码的氨基酸与蛋白质纯化后测序EA4部分的一致性为98%,C末端存在3个氨基酸的差异,其中第156位为新确定氨基酸。     

家蚕G蛋白γ亚基BmGγ30A的克隆及其原核表达

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究G蛋白在家蚕中的生理功能及其作用机理,运用生物信息学方法预测到家蚕Gγ的一段序列,通过设计特异性引物、PCR和RACE技术,克隆得到家蚕Gγ30A的序列。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+),并导入E.coli BI21宿主菌中进行诱导表达。家蚕Gγ30A重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Western blot分析,在相对分子量约38 KDa处,出现特异性蛋白条带,表达方式分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达;试验结果说明我们已成功克隆到家蚕Gγ30A基因(GeneBank登录号:HQ699664),并在E.coli BL21中高效表达。