紫花苜蓿根瘤菌分子分型和生物型划分研究

根据表型和共生效应,对种内根瘤菌划分生物型,为苜蓿与根瘤菌高效共生育种提供理论依据。以分离自甘肃省3个栽培区域5个苜蓿品种植株不同部位的根瘤菌株为材料,进行16SrRNA测序、多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)、表型数值分类和共生效应测定。结果表明,78株初筛菌经16SrRNA和MLST分析有20株属于Rhizobium radiobacter;表型特征数值分类将其聚为7个群。接种5个苜蓿品种,选择对共生效率贡献率最大的地上干重进行多重比较。当接种处理地上干重显著高于未接种处理CK时标记共生效应为A,与CK差异不显著时标记为B,显著低于CK时标记为C。以苜蓿品种为甘农3号、甘农9号、陇中、清水和WL168HQ的顺序,将各菌株共生效应结合,形成6种共生模式。结合表型和共生模式,20株R.radiobacter被划分为14种生物型,WL168HQ、甘农3号和陇中苜蓿品种内生物型多样性丰富,甘农9号和清水苜蓿品种内生物型单一。综上所述,根据表型特征和共生模型可以进行种内根瘤菌株的生物型划分,苜蓿品种内根瘤菌生物型多样性丰富。     

低磷土壤条件对不同苜蓿品种的生长和磷效率的影响

为探究不同苜蓿品种对低磷土壤条件的适应性,以甘农3号、甘农5号、甘农9号、甘农10号、WL358HQ、WL343HQ、WL363HQ、WL354HQ、金皇后9个苜蓿品种为研究对象,采用盆栽试验方法,对不同苜蓿品种的株高、生物量、磷含量、磷吸收和利用效率进行了研究,并采用灰色关联度对不同品种苜蓿的表现进行综合评价.结果表明:低磷条件下,结合鲜重和干重,WL343HQ品种生长速度较其他品种快;9个苜蓿品种的磷含量排序为:甘农10号>WL354HQ>WL343HQ>WL358HQ>WL363HQ>金皇后>甘农3号>甘农5号>甘农9号;WL343HQ磷吸收效率最高,为1.32 mg/pot,金皇后最低,为0.58 mg/pot,总体表现为WL343HQ>WL358HQ>甘农5号>甘农9号>WL363HQ>甘农10号>甘农3号>WL354HQ>金皇后;甘农3号磷利用效率最高,为0.84 g/mg,甘农10号最低,为0.53 g/mg.灰色关联度综合评价得出WL343HQ、WL358HQ、WL354HQ和甘农5号为低磷土壤条件下表现较好的4个品种,适宜在土壤有效磷含量较低的土壤上种植.     

接种红色荧光蛋白标记根瘤菌对苜蓿幼苗生长及结瘤能力的影响

将含有红色荧光蛋白(RFP)基因质粒的荧光标记根瘤菌S.LZgn5-rfp2,S.12531-rfp4、S.LH343-rfp3接种于甘农5号和WL343HQ紫花苜蓿,分别测定2个苜蓿品种幼苗的生物量、生长指标、固氮酶活性等指标。结果表明:RFP标记根瘤菌与出发菌相比对苜蓿幼苗生长无显著影响,与不接菌的苜蓿幼苗相比有明显的促生效果,能稳定的在苜蓿幼苗体内表达,并具有与出发菌无差异的促生能力,2个苜蓿品种间也无特异性。     

播种当年不同苜蓿品种根系形态特征研究

为了对播种当年18个苜蓿品种根系形态特征进行评价,试验测定了苜蓿根颈直径、入土深度、分枝数、主根直径、主根长度、侧根直径、侧根数、侧根深度等指标。结果表明:各品种苜蓿根系形态指标差异明显。利用根系形态特征的8个指标对18个苜蓿品种进行聚类,可分为四类,第一类根系形态相近的包括巨能551(Magna551)、驯鹿(AC Caribou)、标靶(PGI427)、甘农3号和55V12;第二类根系形态相近的包括骑士-2(2010)、甘农6号和56S82;第三类根系形态相近的包括敖汉苜蓿、陇中苜蓿、挑战者(Survivor)、WL343HQ;第四类根系形态相近的包括54V09、55V48、康赛(Concept)、WL440HQ、WL168HQ、WL363HQ。     

蓟马取食诱导对紫花苜蓿次生代谢物含量及防御酶活性的影响

以抗蓟马苜蓿品种甘农 9 号(Medicago sativa cv. Gannong No. 9)、感蓟马苜蓿品种甘农 3 号 (Medicago sativa cv. Gannong No. 3)和高感蓟马苜蓿品种 WL363HQ(Medicago sativa cv. WL363HQ) 为试验材料,紫花苜蓿苗期接种不同头数(0、4、5、6 头/枝条)的蓟马成虫,取食 5 d 后比较不同抗性苜蓿品种叶片中次生代谢物质(黄酮、单宁、木质素)含量和防御酶(过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶 (PAL)、多酚氧化酶(PPO))活性的变化。结果表明：随着蓟马头数的增加,供试苜蓿品种的黄酮、单宁和木质素含量均显著高于 CK(P＜0. 05)。5、6 头/枝条处理时,甘农 9 号的单宁含量分别较甘农 3 号显著提高了 53. 49%,47. 70%;较 WL363HQ 分别显著增加了 71. 52%,58. 60%(P＜0. 05)。甘农 9 号的木质素含量在 5、6 头/枝条处理下均显著高于甘农 3 号和 WL363HQ,增幅分别为 5. 60%,3. 50% 和 6. 13%,3. 96%(P＜0. 05)。蓟马取食胁迫显著提高了供试苜蓿品种的 POD 和 PAL 活性,显著降低了 PPO 活性(P＜0. 05)。甘农 9 号的 POD 和 PAL 活性在 5 头/枝条处理下较甘农 3 号分别显著增加了 2. 60%,1. 09%;较 WL363HQ 分别显著提高了 1. 36%,3. 54%;6 头/枝条处理后甘农 9 号的 POD 和 PAL 活性均显著高于甘农 3 号(5. 19%,9. 36%)和 WL363HQ(2. 58%,11. 18%)(P＜0. 05)。     

甘农3号和陇东苜蓿高效共生根瘤菌菌株的筛选

本研究结合温室盆栽和大田试验,研究了接种不同根瘤菌菌株对甘农3号(Medicago sativa cv.Gannong No.3)和陇东苜蓿(M.sativacv.Longdong)幼苗生长及结瘤特性的影响,并进一步分析了接种根瘤菌后陇东苜蓿的光合特性及其生物量构成因素的变化。结果表明,盆栽条件下,甘农3号接种17767菌株后,生物量、株高、分枝数和叶数分别增长了102%、100%、17%和18%;陇东苜蓿接种17625菌株后,生物量、株高、分枝数和叶数分别增了187%、48%、80%和47%。而在大田条件下,甘农3号接种17650菌株后,生物量和株高分别增长了21%和13%;陇东苜蓿接种17574菌株后,生物量和株高分别增长了348%和70%。盆栽条件下,相比未接种处理,接种6-3、17537、129、17670、17582、17578、17650菌株均不同程度地提高了陇东苜蓿的水分利用效率,仅接种17578、17582菌株提高了其光合速率。综合盆栽与田间试验,与甘农3号最佳共生匹配的根瘤菌菌株为B2;而与陇东苜蓿最佳共生匹配的根瘤菌菌株为17650。     

黄河三角洲耐盐紫花苜蓿品种(系)筛选

为探明苜蓿成株期耐盐性评价方法并筛选耐盐苜蓿资源,采用多个鉴定指标对30份苜蓿品种进行耐盐性综合评价。试验采用大田鉴定法,以株高、鲜重产量、综合评价等3个指标为评价依据,以无棣苜蓿为对照,对30份紫花苜蓿种质的耐盐性进行了综合评价。结果表明:供试的30个苜蓿品种中,耐盐之星、WL366HQ、WL354HQ、WL656HQ、WL525HQ、WL903、WL168HQ、WL363HQ、WL353LH、巨能995、WL440HQ、维多利亚、巨能7、中苜6号、中苜3号、WL298HQ、WL712、SR4030和WL319HQ的产量与无棣苜蓿相比增产比较高,耐盐性较好,适合在黄河三角洲推广应用。     

磷酸二氢钾对苜蓿幼苗体内根瘤菌运移及定殖的影响

试验以WL343HQ紫花苜蓿(Medicago sativacv.WL343HQ)及3株青色荧光蛋白(CFP)标记根瘤菌株Rzhizobium LH3436f(3436f)、Ensifermeliloti 12531f(12531f)和Rzhizobium GN5f(gn5f)为材料,添加不同浓度磷酸二氢钾(KH2PO4)于3株标记根瘤菌菌液内,分别筛选出3个有利于各标记根瘤菌生长的KH2PO4浓度,并分别将选定浓度的KH2PO4与相应的标记根瘤菌组合接种于苜蓿幼苗根部。检测根瘤菌侵入根系后在苜蓿幼苗体内运移及定殖的动态变化和对苜蓿幼苗生长的影响,探讨KH2PO4促进根瘤菌运移和定殖的适宜浓度及根瘤菌运移和定殖的效果。结果表明:50mg/L KH2PO4促使3436f长期稳定的大量定殖于苜蓿根系,定殖数量最高达到27075.12cfu/g,显著高于其他处理(P0.05),并快速运移至上部茎和上部叶中,数量分别为19.20cfu/g、9.94cfu/g;50mg/L KH2PO4促使12531f大量定殖于根系,也可运移至上部茎,数量为53.45cfu/g;200mg/L KH2PO4促使gn5f稳定定殖于根系和茎内,接种45d时下部茎内仍有定殖,数量为33.29cfu/g。添加KH2PO4接种可明显提高苜蓿单株结瘤数和单株根瘤重,增加苜蓿叶片数、株高、根长、地上鲜重和根鲜重,显著促进了标记根瘤菌侵染根系并进入苜蓿体内运移和定殖。结合苜蓿体内根瘤菌运移和定殖以及苜蓿生长各指标优化状况,筛选出标记根瘤菌株与KH2PO4的优良组合为3436f+50 mg/L KH2PO4,12531f+50 mg/L KH2PO4和gn5f+200mg/L KH2PO4,为苜蓿接种目标根瘤菌并促使其在体内运移和定殖至种子,构建目标根瘤菌与苜蓿良种种子共生体奠定基础。     

公农5号紫花苜蓿与根瘤菌共生匹配组合的筛选

为了研究紫花苜蓿与不同品种根瘤菌之间的共生匹配性,获得高效根瘤菌用于接种,试验在吉林省大安地区、农安地区和黑龙江地区采集15株苜蓿根瘤菌与公农5号紫花苜蓿进行共生匹配,分别在土壤盆栽及大田试验条件下,测定15株苜蓿根瘤菌与公农5号的各生长效应指标,并进行了固氮性分析。结果表明:HLCC3002菌株与公农5号能很好地共生匹配,从而确定HLCC3002菌株为与公农5号紫花苜蓿相匹配的高效根瘤菌。     

公农二号紫花苜蓿与根瘤菌优化共生匹配的筛选

为了获得与公农二号紫花苜蓿匹配的根瘤菌,试验采用15株不同的根瘤菌对公农二号紫花苜蓿进行接种,并对其结瘤和生长指标进行测定。结果表明:接种后,紫花苜蓿的结瘤数和粗蛋白含量比对照组分别提高了67%~933%和1.54%~69.01%;株高和干重分别提高了6.26%~30.79%和85.71%~771.43%。接种根瘤菌可使紫花苜蓿的生长在各个方面都有显著提高,盆栽试验初步筛选出的与紫花苜蓿匹配优良的菌株为NACC1001、NACC1004、NACC1005、DACC2001、DACC2003、HLCC3001、HLCC3002和HLCC3003,田间试验最终选出的优良共生匹配组合为公农2号-HLCC3002。说明苜蓿品种和苜蓿根瘤菌之间存在相互选择性,通过盆栽试验进行初步筛选、再利用田间试验进行复筛可筛选出苜蓿品种和苜蓿根瘤菌的优良共生组合。     

苜蓿-根瘤菌复合盐高效抗性共生体系构建

为构建具有盐渍土环境竞争力与遗传稳定性的苜蓿(Medicago)-根瘤菌高效共生体系,以12个苜蓿品种为材料,进行了复合盐种子萌发、种子内生根瘤菌抗盐碱筛选及接种试验。结果表明,不同品种间种子复合盐抗性差异较大,成活率以中苜1号最高,甘农7号、新疆大叶次之,但三者间无显著差异;种子内生根瘤菌复合盐抗性以甘农1号最强,菌株数目最丰,为2.58×106,中苜1号次之,为2.49×106,根瘤菌固氮酶活性以中苜1号最高;以新疆大叶种子接种中苜1号根瘤菌匹配度为最佳,共生体系地上生物量、茎叶粗蛋白含量以及固氮酶活性均为最高。     

3株紫花苜蓿内生根瘤菌功能差异性分析

以3株紫花苜蓿(Medicago sativa)内生根瘤菌株(LP3、WLP2和WLG1)为材料,进行抗逆和促生能力研究,并采用试管砂培法对WL168HQ苜蓿(M.sativacv.WL168HQ)进行接种试验,以不含根瘤菌的培养液为对照,分析菌株的共生固氮能力。结果表明,菌株WLP2能耐受除红霉素和庆大霉素外的所有抗生素≥300μg·mL~(-1);能在6%NaCl、pH 5~11和温度8~40℃的环境下生长,对盐、pH和温度的适应范围广;能溶解有机磷和无机磷,分泌IAA能力强。菌株WLG1接种,单株结瘤数、地上干重和地下干重显著高于对照处理(P0.05),分别比对照增加了208.16%、72.35%和122.33%;单株有效根瘤重、根长和单株叶片数明显高于对照处理,分别比对照高了6.68%、9.57%和53.59%。综上所述,菌株WLP2对抗生素、盐、pH和温度的抗性以及促生能力较强,菌株WLG1对WL168HQ苜蓿接种效果最佳,共生固氮能力强。     

9个苜蓿品种引种对比试验研究

为满足畜牧业发展的要求,选育出适宜哈密地区两县一市种植的紫花苜蓿品种,2005～2007年对引自国内外的9种紫花苜蓿品种进行引种对比试验,通过物候期、株高、产量、干鲜比、茎叶比等各个指标的观测得出:甘农三号苜蓿、新牧一号杂花苜蓿、敖汉苜蓿产量较高,美国金皇后苜蓿、三得利苜蓿、美国WL232苜蓿次之,中牧一号苜蓿最低;三得利和美国WL232苜蓿茎叶比较高,甘农三号苜蓿最低;综合评价:9个苜蓿品种中,甘农三号苜蓿、新牧一号杂花苜蓿、敖汉苜蓿、美国金皇后苜蓿、三得利苜蓿、美国WL232苜蓿的综合性状好,产量高且稳定,草质好,适宜哈密地区推广种植。     

40个苜蓿品种对炭疽病的苗期抗性评价

三叶草炭疽菌(Colletotrichum trifolii)是引起苜蓿炭疽病的重要致病菌,发生严重时可导致苜蓿毁灭性危害。采用孢子悬浮液喷雾接种法,以发病率和病情指数为指标,对40个苜蓿品种开展抗三叶草炭疽菌的苗期抗性评价。结果表明,供试品种中,威纳尔、阿尔冈金、巨能2表现高抗,WL363HQ、巨能7、拉迪诺、4030、4010、润布勒、亮牧表现中抗,新牧4号、甘农4号、驯鹿等15个品种表现中感,新疆大叶、甘农6号、甘农9号等15个品种表现高感。抗性品种占供试品种的25%,感病品种占75%,高抗与高感品种间抗性差异显著(P < 0.05)。     

接种根瘤菌对不同品种紫花苜蓿生产性能及营养价值的影响评价

对甘农3号、三得利、旱地、WL343、巨能601、威神等6个紫花苜蓿(Medicago sativa)品种开展根瘤菌接种试验,以越冬率、分枝数、株高、干草产量、粗蛋白、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、相对饲喂价值等为评价指标,采用灰色关联法分析行评价接种根瘤菌对紫花苜蓿生产性能及营养价值的影响。结果表明：接种根瘤菌可显著提高紫花苜蓿品种的越冬率、株高、干草产量和粗蛋白含量(P<0.05),对紫花苜蓿的分枝数、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维、相对饲喂价值的影响不显著(P>0.05),可促进紫花苜蓿提前接瘤,促进提高苜蓿产量和饲草品质,是提高苜蓿产草量和饲草品质的有效措施,可大面积推广应用。     

40个苜蓿品种对炭疽病的苗期抗性评价

三叶草炭疽菌(Colletotrichum trifolii)是引起苜蓿炭疽病的重要致病菌,发生严重时可导致苜蓿毁灭性危害.采用孢子悬浮液喷雾接种法,以发病率和病情指数为指标,对40个苜蓿品种开展抗三叶草炭疽菌的苗期抗性评价.结果表明,供试品种中,威纳尔、阿尔冈金、巨能2表现高抗,WL363HQ、巨能7、拉迪诺、4030、4010、润布勒、亮牧表现中抗,新牧4号、甘农4号、驯鹿等15个品种表现中感,新疆大叶、甘农6号、甘农9号等15个品种表现高感.抗性品种占供试品种的25％,感病品种占75％,高抗与高感品种间抗性差异显著(P<0.05).     

宁夏地区26个主栽苜蓿品种的抗蓟马能力评价

运用为害指数法,对宁夏地区主栽的26个苜蓿品种进行了室内蓟马抗性评价试验。田间蓟马种类以牛角花齿蓟马(Odontothrips loti)为主,占混合种群数量的75%,室内试虫群体结构与大田相仿。结果表明:供试26个苜蓿品种中,先行者、甘农9号、WL298HQ、耐盐之星、三得利5个品种的为害指数小于25.00%,对蓟马表现出较强的抗性;而皇后、盐宝、阿迪娜、WL354HQ 4个品种为害指数大于40.00%,对蓟马表现出较弱的抗性。同时从株高、分枝数及干草产量等方面对不同苜蓿品种抗性进行了初步研究。试验表明,蓟马为害后,抗性较强的苜蓿品种其株高绝对增长率、分枝相对增长率及干草产量损失率均高于抗性较弱的苜蓿品种。     

干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种根系形态及解剖结构的影响

以强抗旱陇中苜蓿、中抗旱陇东苜蓿和弱抗旱甘农3号紫花苜蓿为试验材料,采用营养液沙培法,以-1.2 MPa PEG-6000模拟干旱胁迫,比较不同胁迫时间(0、3、6、9、12和15 d)对不同抗旱性苜蓿品种幼苗根系形态及解剖结构的影响。结果表明:随胁迫时间的延长,陇中苜蓿的根尖数、根系干重、根系总长度、根系总表面积和木质部面积不断增大;陇中苜蓿和陇东苜蓿的维管束直径、维管束面积和韧皮部面积均不断增大;甘农3号的根系总长度、根系总表面积及皮层占根系直径比例不断增大,而其根系干重、原生和次生木质部导管直径、维管束直径及维管束面积不断减小。胁迫6 d后,陇中苜蓿和陇东苜蓿的根系总长度、根系总表面积和根体积均显著高于甘农3号;胁迫9 d后,陇中苜蓿根系平均直径、根体积、根系干重、维管束面积、木质部面积和次生木质部导管数目均显著高于陇东苜蓿和甘农3号。供试苜蓿均可通过增加根系总长度及次生木质部导管数目响应干旱胁迫。此外,陇中苜蓿可通过增加根体积、根尖数和改善根系解剖结构来适应干旱;陇东苜蓿通过增加维管束直径、维管束面积和韧皮部面积来适应干旱。相比之下,胁迫时间超过9 d时,甘农3号内部输导组织结构的变化削弱了其输导水分的能力。     

干旱胁迫对不同抗旱性苜蓿品种根系形态及解剖结构的影响

以强抗旱陇中苜蓿、中抗旱陇东苜蓿和弱抗旱甘农3号紫花苜蓿为试验材料,采用营养液沙培法,以-1.2 MPa PEG-6000模拟干旱胁迫,比较不同胁迫时间(0、3、6、9、12和15 d)对不同抗旱性苜蓿品种幼苗根系形态及解剖结构的影响。结果表明:随胁迫时间的延长,陇中苜蓿的根尖数、根系干重、根系总长度、根系总表面积和木质部面积不断增大;陇中苜蓿和陇东苜蓿的维管束直径、维管束面积和韧皮部面积均不断增大;甘农3号的根系总长度、根系总表面积及皮层占根系直径比例不断增大,而其根系干重、原生和次生木质部导管直径、维管束直径及维管束面积不断减小。胁迫6 d后,陇中苜蓿和陇东苜蓿的根系总长度、根系总表面积和根体积均显著高于甘农3号;胁迫9 d后,陇中苜蓿根系平均直径、根体积、根系干重、维管束面积、木质部面积和次生木质部导管数目均显著高于陇东苜蓿和甘农3号。供试苜蓿均可通过增加根系总长度及次生木质部导管数目响应干旱胁迫。此外,陇中苜蓿可通过增加根体积、根尖数和改善根系解剖结构来适应干旱;陇东苜蓿通过增加维管束直径、维管束面积和韧皮部面积来适应干旱。相比之下,胁迫时间超过9 d时,甘农3号内部输导组织结构的变化削弱了其输导水分的能力。     

五种苜蓿染色体核型分析

为了给苜蓿的种质资源利用和杂交育种研究提供细胞学依据,试验应用染色体制片方法,分析了龙牧801、WL319HQ、WL343HQ、阿迪娜和先驱者5个国内外苜蓿品种的染色体核型。结果表明:5个供试苜蓿的染色体数目均为2n=32,龙牧801核型组成为2n=32=16m+14sm+2st,WL343HQ核型组成为2n=32=20m+10sm+2st,WL319HQ、阿迪娜、先驱者核型组成均为2n=32=20m+12sm;染色体类型划分阿迪娜为2B型,其他苜蓿为2C型。