家兔子宫内膜细胞炎症模型的建立

胶原酶消化法分离和培养家兔子宫内膜细胞,大肠杆茵细茵脂多糖(LPS)诱导子宫内膜细胞炎症,以培养细胞的形态学和传统炎症指标作为炎症发生和发展的判断标准.以不同浓度的LPS作用于细胞,收集不同时段培养上清液,ELISA法测定TNF-a、IL-1β的含量.结果表明,100 ng/ml LPS是体外培养的子宫内膜细胞诱导炎症的最适浓度.炎症模型组培养上清液中TNF-a、IL-1β的含量比同期空白组高(P<0.01),表明炎症模型建立成功.     

虾青素对牛子宫内膜细胞炎症损伤的保护作用

【目的】利用虾青素较强的抗氧化特性,通过探讨黏膜屏障重塑对脂多糖（LPS）诱导的牛子宫内膜细胞炎症的影响,为牛子宫内膜细胞炎的预防和治疗提供理论基础。【方法】培养液中添加1 μg·mL ^-1 LPS,培养子宫内膜细胞6 h,检测培养液中炎症因子TNF-α和IL-6含量,建立细胞的体外炎症模型。在此基础上去掉培养液,重新加入含1×10 ^-6 mol·L ^-1 虾青素的新鲜培养液,继续培养细胞24 h。对照组为不添加LPS或AST,LPS组为仅添加LPS,AST组为添加LPS和AST。采用ELISA法检测培养液中TNF-α和IL-6炎症因子分泌量以及细胞SOD和CAT酶活性,利用流式细胞仪检测细胞内活性氧簇（ROS）水平,利用免疫荧光染色检测细胞紧密连接蛋白Claudin、CDH1、TJP1的分布情况,利用荧光定量RT-PCR法和Western Blot法分别检测Claudin、CDH1、TJP1基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平。【结果】利用1 μg·mL ^-1 LPS培养子宫内膜细胞6 h,检测发现培养液中炎症因子IL-6和TNF-α分泌水平显著高于对照组（P小于0.05）,说明LPS诱导子宫内膜细胞产生炎症反应。与对照组相比,细胞内ROS水平显著增加（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著降低（P小于0.05）,说明LPS诱导的子宫内膜细胞炎症造成了氧化损伤。加入1×10 ^-6 mol·L ^-1 虾青素培养细胞24 h后,发现培养液中IL-6和TNF-α因子的分泌水平显著低于LPS组（P小于0.05）,同时ROS阳性细胞比率显著下降（P小于0.05）,SOD和CAT酶活性都显著升高（P小于0.05）。LPS组与对照组相比,细胞膜处Claudin、CDH1、TJP1蛋白的荧光信号减弱,这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著降低（P小于0.05）。加入1×10 ^-6 mol·L ^-1虾青素培养24 h后,与LPS组相比,在细胞边缘和细胞核内可以检测到荧光信号很强的Claudin、CDH1、TJP1蛋白,而且这3种紧密连接蛋白的mRNA和蛋白表达水平也都显著升高（P小于0.05）。【结论】虾青素通过降低子宫内膜细胞因炎症反应产生的氧化损伤,减轻炎症导致的子宫内膜细胞紧密连接结构损伤,对子宫内膜的物理免疫屏障起保护作用,为牛子宫内膜炎的预防和治疗提供理论借鉴意义。     

LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞炎症损伤模型的建立

采用LPS诱导子宫内膜上皮细胞炎症模型,通过研究细胞因子IL-1β、TNF-αmRNA的表达验证模型,为进一步对子宫内膜炎发病机理的研究和治疗药物疗效的评价奠定基础。经组织块原代培养和胰酶纯化分离得到奶牛子宫内膜上皮细胞,并通过免疫组化鉴定细胞纯度。采用0、10、30、50、100μg/mL的LPS分别在3、6、9、12、18 h刺激纯化后的子宫内膜上皮细胞,采用MTT法筛选出最佳刺激浓度时间为30μg/mL,12 h,然后以最佳刺激浓度刺激子宫内膜上皮细胞,在12 h后收集细胞,最后通过荧光定量RT-PCR检测IL-1β、TNF-αmRNA的表达差异性。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞大都长梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达98%以上。说明该方法能够成功分离并得到高产量、高纯度、高增殖能力的子宫内膜细胞及平滑肌细胞。     

LPS诱导奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的建立

[目的]采用脂多糖(LPS)作为刺激源,建立奶牛子宫内膜上皮细胞(BEEC)氧化损伤模型.[方法]体外培养BEEC并进行细胞鉴定,用不同浓度的LPS刺激细胞,在不同时间点用CCK-8法测定细胞存活率,以确定BEEC氧化损伤模型条件.倒置显微镜下观察细胞形态学变化,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA检测细胞内活性氧(ROS)含量,比色法检测细胞中的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT).[结果]与空白对照组相比,当LPS浓度为80μg/mL,作用时间为12 h时,造成细胞损伤,其细胞凋亡率、ROS产生量和MDA含量明显高于对照组,SOD和CAT活性显著低于对照组.[结论]建立奶牛子宫内膜上皮细胞氧化损伤模型的条件为LPS作用浓度80 μg/mL,作用时间12 h.     

奶牛蹄真皮细胞卡拉胶炎症模型的建立

为了建立卡拉胶诱导的奶牛蹄真皮细胞炎症模型,以组织块培养法分离培养到的奶牛蹄真皮细胞为研究对象,用不同浓度的卡拉胶作用于奶牛蹄真皮细胞。采用MTT法检测卡拉胶作用后细胞的存活率,West-ern blot法检测NF-κB蛋白的表达,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α的浓度。结果表明:随着卡拉胶浓度的升高,对细胞的抑制作用加强,200μg/mL的卡拉胶对细胞的抑制率最接近10%。200μg/mL卡拉胶作用蹄细胞48h,NF-κB的蛋白表达升高,且细胞上清液中TNF-α的含量显著高于对照组(P<0.05)。即200μg/mL卡拉胶作用48h,可成功建立奶牛蹄真皮细胞的炎症模型。     

早孕小鼠子宫内膜ICAM-1的表达及意义

探讨细胞间粘附分子-1（ICAM-1）基因及蛋白在早孕小鼠子宫内膜的表达及其意义方法：收集妊娠1-5d的早孕小鼠子宫内膜,利用RT-PCR、免疫组织化和Western-blot方法检测ICAM-1基因及蛋白的表达及分布;着床期小鼠单侧宫角注射ICAM-1单抗,观察胚胎着床变化．结果：1．ICAM-1 mRNA孕D1到D3逐渐增高,D4达最高,D5开始降低;2．子宫内膜上皮细胞,基质细胞,血管上皮细胞均有ICAM-1的表达,阳性细胞数量、表达强度和表达时间呈现一定规律性;3．ICAM-1D1、D2、D3略有升高,D4有强表达,D5略有下降;4．单侧宫角注射ICAM-1单抗后,该侧胚胎发生流产．结论：ICAM-1在早孕小鼠子宫内膜的表达变化及分布,提示ICAM-1参与了胚泡着床,ICAM-1可能起调节子宫内膜的局部免疫作用．     

山羊子宫内膜基质细胞的分离培养及鉴定

对山羊子宫内膜基质细胞进行分离与体外培养,研究其生长特性,并对其进行免疫细胞化学染色鉴定。结果表明,山羊子宫内膜在37℃条件下,以2 g／L的胶原酶Ⅰ型消化3～4 h效果最好;采用过滤—低速离心—沉降相结合的方法分离山羊子宫内膜基质细胞效果较好,所得细胞在培养后0．5 h开始贴壁,培养12 h后,可见梭形和多角形2种形态的细胞,3～4 d呈网状铺满皿底,有明显的重叠生长现象;免疫细胞化学染色显示这2种形态的细胞均表达波形蛋白,阳性率可达95％以上,不表达角蛋白。说明采用本文所述的消化和分离方法可获得高纯度的子宫内膜基质细胞。     

虾青素对脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜细胞凋亡的影响

子宫内膜炎是奶牛养殖业常见的一种繁殖疾病,目前主要利用抗生素进行治疗.本试验利用已成功构建的子宫内膜细胞炎症模型,研究添加1μmol/L虾青素对脂多糖(LPS)诱导奶牛子宫内膜细胞调亡的影响,处理24 h后利用流式细胞仪检测细胞的凋亡比例,利用荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测Bax、Bcl-2、F...     

多胺代谢相关基因在小鼠子宫内膜细胞中的调节

利用鸟氨酸脱羧酶(ODC)siRNA干涉、ODC过表达、添加特异性ODC抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)处理小鼠子宫内膜上皮细胞和基质细胞,采用实时定量PCR对多胺代谢相关酶类mRNA水平进行检测。结果显示:在子宫内膜上皮和基质细胞中,ODC siRNA转染后可导致SSAT mRNA水平下降为对照组的71.78%和54.36%(P<0.01),SAMDC mRNA水平上升为对照组的1.666 6倍和3.036 6倍(P<0.01);ODC过表达造成SSAT水平为对照组的1.921 4和2.852 7倍(P<0.01),AZⅠmRNA水平为对照组的1.962 1和3.073 8倍(P<0.01);利用DFMO处理体外分离的上皮细胞和基质细胞,SSAT mRNA水平为对照组的1.626 7和1.773 3倍(P<0.01),SAMDC mRNA水平为对照组的1.630 0和1.730 0倍(P<0.01),AZⅠmRNA水平为对照组的71.00%和76.67%(P<0.01);DFMO处理后上皮细胞和基质细胞数目(31.00±3.00和43.67±7.51)和活力(0.26±0.03和0.36±0.05)都显著下...     

MMP-2、MMP-9在子宫内膜增生症和腺癌中的表达

目的 探讨基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9在子宫内膜腺癌发生、发展中的作用.方法 采用免疫组化法检测100例子宫内膜腺癌、30例子宫内膜增生症及30例正常子宫内膜中MMP-2、MMP-9表达.结果 MP-2、MMP-9 在正常子宫内膜增生期表达增加,而在早分泌期几乎无表达;MMP-2、MP-9在不典型增生及...     

survivin与PTEN、PCNA在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的观察survivin、PTEN、增殖细胞核抗原(PCNA)在子宫内膜癌(EMC)中的表达及临床意义。方法运用免疫组化S-P法检测survivin、PTEN、PCNA蛋白在48例EMC、19例子宫内膜不典型增生、23例正常子宫内膜组织中表达情况,及其在EMC不同临床分期、组织学分级、肌层浸润程度表达。结果survivin、PCNA和PTEN在正常子宫内膜、子宫内膜不典型增生及EMC中的表达不同,不典型增生组、EMC组与正常子宫内膜组比较,差异有统计学意义(P<0.05或0.01),不典型增生组与EMC组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。EMC临床Ⅱ期、ⅢⅣ期survivin表达与Ⅰ期有不同,Ⅲ~Ⅳ期PTEN、PCNA表达与Ⅰ期有不同,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同组织学G2、G3 survivin、PTEN、PCNA表达与G1有不同,差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。无肌层浸润或浸润程度≤1/2组PTEN、PCNA表达与浸润程度>1/2组不同,差异有统计学意义(P<0.05)。结论检测survivin、PTEN、PCNA三者的表达水平对判断EMC的恶性程度及预测预后具有一定的临床参考价值。     

苦参碱对奶牛子宫内膜上皮细胞抗炎作用及其机制

为探究苦参碱在抗炎方面的作用,本试验用LPS建立奶牛子宫内膜上皮细胞炎症损伤模型,通过MTT法测得LPS最佳刺激浓度为30μg/mL,作用12h;苦参碱的低中高浓度分别为5、10、20μg/mL。RT-PCR分别检测3、6、12h各组细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8)mRNA的表达变化,结果表明,苦参碱显著(P0.05)降低TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表达,具有较强的抗炎作用。     

阿魏酸抗LPS诱导的奶牛子宫内膜上皮细胞炎性作用

[目的]为了探明阿魏酸的抗炎机制.[方法]采用组织块培养法获得奶牛子宫内膜上皮细胞.用噻唑蓝(MTT法)检测细胞活力.采用荧光定量PCR方法,分别对对照组、模型组、药物作用高、中、低剂量组在LPS作用3h、6h炎症基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA变化进行检测.[结果]阿魏酸在一定浓度范围内对细胞增殖无显著影响.药物预处理细胞能够显著降低LPS诱导的IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA表达.[结论]阿魏酸能够显著降低LPS刺激细胞后炎症细胞因子的表达,说明阿魏酸是通过抑制炎症因子的表达发挥其抗炎作用.