接种大豆孢囊线虫4号生理小种诱导GmHs1pro-1基因的表达分析

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines,Soybean cyst nematode,SCN)是严重危害世界大豆生产的害虫,大豆对孢囊线虫的抗性由多个基因控制,发掘和利用抗病基因对于SCN抗病品种的有效选育至关重要。本研究以大豆(Glycine max)感病品种中黄13和抗病品系中品03-5373为研究材料,对包含线虫抗病基因相关结构域Hs1pro-1_N和Hs1pro-1_C的候选基因GmHs1pro-1的表达特征进行实时荧光定量PCR分析,以期明确该基因与SCN抗性之间的关系。研究发现接种SCN4号生理小种(SCN4)后1d该基因的相对表达量出现明显的上调,比对照样品高13.4倍,其后的各时间点其表达量仍然保持持续上调的趋势,在接种6d后其上调趋势有所减弱。方差分析表明,接种与未接种相对表达量之间的差异均达到显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)水平,说明SCN4侵染条件下,GmHs1pro1基因被诱导表达,该基因对SCN4具有一定的抗性作用。     

外源乙烯利诱导玉米化学防御作用的时间和浓度效应

为探明外源乙烯利对玉米化学防御作用诱导的浓度和时间效应,本文采用化学和分子生物学相结合的方法,研究了不同浓度乙烯利处理玉米后,叶片乙烯释放量及其合成调控关键基因ACS和ACO表达的变化,典型化感物质丁布的含量及其关键调控基因BX1和BX9表达的变化,以及其他调控次生代谢物的关键基因表达的时间动态。结果表明,外源乙烯利处理玉米12h时,玉米叶片中丁布含量明显增加;24h后,丁布含量反而大量降低,48h后对丁布含量影响不大。外源乙烯利对合成丁布的调控基因BX1没有诱导作用,但处理12h和24h对BX9有明显诱导作用。外源乙烯利处理12h能够使ACS和ACO表达量上升,浓度为40μL&#183;L^-1和60μL&#183;L^-1乙烯利处理使玉米叶片丁布含量大量降低,BX1和BX9的表达量有所下调。外源乙烯利能够使蛋白酶抑制剂MPI表达量升高,且乙烯利浓度越高,诱导作用越明显,但对调控挥发物的FPS和TPS基因表达没有影响。说明外源乙烯利能够启动玉米体内的乙烯途径,诱导玉米启动化学防御过程,但这种作用很可能是负反馈型的。     

大豆孢囊线虫大豆和烟草群体的转录组比较分析

大豆孢囊线虫(Heterodera glycines,soybean cyst nematode,SCN)为植物专性内寄生线虫,主要危害大豆(Glycine max)等豆科植物,烟草(Nicotiana tabacum)是其非寄主。但近年来,本课题组在山东地区发现一个特殊的SCN群体(简称SCN_T),其可以寄生烟草,但对大豆的致病性很差。为揭示SCN_T与普通大豆孢囊线虫群体(SCN)对同一寄主致病性存在显著差异的分子机制,本研究采用Illumina平台Hi Seq~(TM)2500高通量测序技术对两个群体的2龄幼虫(second stage juvenile,J2)进行转录组测序和生物信息学分析,并采用q RT-PCR对转录组测序结果进行验证。结果表明,SCN和SCN_T共检测出1 628个差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs),其中1 347个基因在SCN_T中上调表达,281个下调表达。对DEGs进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析发现,被注释到分子功能的核糖体结构组成的DEGs数目最多,高达284个;其次是生物学进程的翻译过程,为211个;京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析表明,639个DEGs定位到277个代谢途径分支,其中参与到核糖体和氧化磷酸化途径的差异基因最多。另外,与线虫生长发育和寄生相关的代谢途径以及一些编码食道腺细胞分泌蛋白的DEGs同样被显著富集。q RT-PCR分析数据与转录组测序结果相关性较好(R~2=0.98),说明转录组测序数据可靠。本研究首次研究了不同致病力群体SCN和SCN_T在转录水平上的差异,为进一步解析SCN致病性差异形成的分子机制提供科学依据。     

HMMER及同源比对预测大豆病程相关蛋白

病程相关蛋白（pathogenesis related proteins,PRs）是病理或病理相关环境下诱导产生的一类蛋白,它的产生与积累是植物体应答生物或非生物胁迫的主要特征之一。近年来大量PR蛋白被鉴定,根据它们的结构特征,生物功能以及进化关系等将PR蛋白分为14个家族。然而,在重要的粮食和油料作物的大豆中发现的PR蛋白却很少,本文通过搜索拟南芥、水稻、玉米以及豆科植物所有的已有的PR蛋白,根据其保守结构域利用BLAST程序和HMMER程序同时预测大豆中可能存在的PR蛋白,通过两种方法的预测和比较整合,共得到大豆9个家族的36个PR蛋白序列。并对它们的连锁群分布、基因结构、基因长度及进化关系进行了详细的分析。发现PR家族成簇分布于Gm05、Gm10、Gm13、Gm15、Gm17、Gm19和Gm20等几个连锁群,基因普遍存在序列较短,大部分都小于1000bp,且内含子数目较少,结构相对简单的特点。在PR4家族中,其家族成员亲缘关系都非常相近,而PR1-4和PR1-3等与该家族其它成员亲缘关系较远的情况。本研究结果预测的PR蛋白为大豆抗病育种以及抗病基因工程研究提供了良好的基础,同时为大豆中其它家族基因预测研究以及其它物种基因家族研究提供参考方法。     

大豆抗胞囊线虫4号小种转录组测序及分析

大豆胞囊线虫(soybean cyst nematode,SCN)(Heterodera glycines)是一种世界性的大豆(Glycine max)病害.本研究以抗SCN4号生理小种的黑豆为研究对象,对大豆胞囊线虫侵染后的两个发育时期进行转录组测序和生物信息学分析,宏观了解大豆的抗病机制.通过Illumina HiSeqTM2500测序共获得1.96× 1010 bp的数据.经过分析后,接种后第9天(第一时期)和接种后第17天(第二时期)分别得到2 180个和4 210个差异表达基因,同时,对差异表达基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)注释,蛋白质直系同源簇(Clusters of Orthologous Groups of proteins,COG)注释,结果显示,GO注释和COG注释分别将差异表达基因分为了58和25个功能类别.另外,京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析结果表明,可将两个时期的差异表达基因分别定位到83和105个具体的代谢途径分支.其中,参与到激素信号转导途径,苯丙氨酸代谢,能量代谢等过程中的差异基因最多,这些数据为进一步筛选抗病关键基因及功能验证等研究提供了依据.     

枯萎病菌侵染后香蕉乙烯形成酶基因MaA CO及乙烯响应因子MaERF1表达水平分析

香蕉与枯萎病互作机理研究一直是近年来研究的热点,目前对枯萎病菌的致病机理及香蕉的感、抗病机理还不清楚。本文利用前期表达谱分析结果克隆了乙烯合成及调控途径中的关键酶基因乙烯形成酶基因（MaACO）和乙烯响应因子基因（MaERF1）,通过RT-PCR检测,对这两个基因在感、抗病香蕉种质中的表达水平进行研究。结果表明,MaACO和MaERF1基因对机械损伤非常敏感,尤其在损伤初期（3h）的表达水平远高于后期;对于枯萎病菌侵染处理的植株,尤其在感染初期（3h）MaACO和MaERF1的表达水平在抗性植株中的表达量均比感病植株中的低;抗性种质中乙烯途径可能受到抑制,香蕉的感病性可能与侵染初期对乙烯信号的敏感性相关。本研究为利用乙烯抑制剂进行香蕉抗枯萎病新方法的研究奠定了基础。     

两个植物特异性转录因子调控SA合成与系统获得性抗性

系统获得性抗性(SAR)是植物在长期对抗病原菌侵染过程中逐步形成的一种防卫机制。水杨酸(SA)在该机制中扮演着中心角色,它通过调控下游的NPR1以及转录因子TGA2、TGA5和TGA6而激活植物的SAR反应。已有的研究表明,EIN3和EIN3-LIKE1通过抑制SID2编码的ICS1表达而负调控病原菌诱导的SA合成,而ICS1表达的正调控因子则未知。最近研究发     

大豆籽粒大小遗传调控研究现状

籽粒大小是大豆产量和外观品质的重要构成要素,具有巨大的经济价值,一直以来都是育种的主要目标之一。大豆籽粒大小由胚、胚乳和种皮发育共同协调决定。目前已报道的与大豆籽粒重相关的QTL位点309个,但大多位点尚未进行功能验证。已发现的与大豆籽粒大小相关的基因有17个,多数与母本种皮发育调控相关,其它与合子组织和植物激素调控途径相关。其中,发挥正向和负向调控作用的基因分别有12个和4个。在不影响大豆品质情况下,PP2C-1、Gm20OX和CYP78A等基因在植物个体发育过程中对籽粒大小的调节发挥关键作用,有望成为大豆分子设计育种中的优良靶点。本文重点从连锁分析和关联分析方法,介绍了已鉴定的与大豆籽粒大小相关的QTL及其位点,综述了大豆籽粒大小调控分子机制的研究进展,并根据现阶段的研究探讨了未来的研究热点和研究方向,以期为大豆籽粒分子调控机制全面解析和高产育种技术创新提供理论参考。     

毛白杨抗病相关转录因子基因PtWRKY1的表达特性分析

WRKY转录因子作为植物特有的一类重要转录调控因子,广泛参与植物对生物和非生物胁迫的应答反应及形态发育和组织衰老等,已引起人们的关注。本文以前期克隆得到的毛白杨WRKY转录因子基因（命名为PtWRKY1）为研究对象,开展其基因枪介导洋葱表皮细胞瞬时表达、外源信号分子（水杨酸SA,茉莉酸MeJA,脱落酸ABA）诱导表达、转PtWRKY1基因烟草植株的烟草花叶病毒（TMV）接种实验以及抗病相关基因表达的实时荧光定量RT-PCR（qRT-PCR）分析等研究。结果表明,PtWRKY1基因编码蛋白定位于细胞核,SA、ABA及MeJA处理均可诱导PtWRKY1基因表达,但不同诱导因子对PtWRKY1表达量的影响存在一定差异;同时,TMV侵染实验发现外源PtWRKY1表达能增强转基因烟草抗TMV能力,qRT-PCR分析表明PtWRKY1基因及膜保护性酶（POD,SOD,CAT）基因均受TMV诱导而增强表达。本文研究结果可为后续开展毛白杨转录因子PtWRKY1的功能鉴定及应用奠定基础。     

根系分泌物抑制连作障碍线虫病的根际调控机制及其应用

作物长期连作极易出现连作障碍(再生病害),本文围绕因传统耕作模式和种植习惯而诱发的新疆棉花、黑龙江大豆、河南花生、山东设施蔬菜、两广香蕉等连作障碍问题,对全国连作现象进行系统分析,发现全国连作现象普遍。按照耕地面积将连作障碍划分为五个等级,其中华北三省和东北的黑龙江省连作障碍等级最高,且各省连作现象均以大田经济作物为主。以香蕉、大豆(大田经济作物)、黄瓜(设施园艺作物)和三七(中草药)为代表,比对最低产量和正常产量在连作年份的变化,表明连作障碍发生规律成抛物线式,防控连作障碍需找到问题关键时期。单一根系分泌物介导的微生物多样性降低、病原菌富集,植物寄生线虫危害和土壤弱化是导致连作障碍的主要原因,其中线虫对植物的侵染危害作为土传病害是防治连作障碍中最难解决的问题之一,尤其是在设施蔬菜上。线虫在长期进化过程中形成了具有识别、寻找和侵染寄主的生物学功能,而不同植物根系分泌物对线虫发育和对宿主的识别侵染能力有不同的调控作用。针对根系分泌物–线虫互作为诱因的线虫病害,深入探讨易感作物和抗性/非寄主植物根系分泌物对线虫发育和对植物侵染的生物学机制,提出根际调控措施。在J2时期利用抗性/非寄主植物根系分泌物,调控根结线虫Mi-16D10、Mi-flp-18等基因和孢囊线虫的Hg-rbp-2等基因的表达控制线虫的发育、侵染和迁移,通过生物源功能物质定向防控线虫侵染作物。这些结果加深了我们对生物活性物质调控植物寄生线虫机制的认识。未来,以筛选和鉴定抗性或非寄主作物特异根系分泌物对线虫侵染的调控为依据,配置生物功能型肥料,利用植物源活性物质替代传统农药控制线虫病害的根际调控措施,定向调控植物根际生物学过程将成为国内外研究热点。此文将为未来深入系统地研究根系分泌物–线虫的相互作用及克服连作障碍提供理论基础,进而促进土壤健康和作物优质高产高效,对实现绿色农业和可持续发展具有重要的理论和实践指导意义。     

水杨酸在赭曲霉毒素A诱导的拟南芥毒性中的作用

赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)是一种分布广泛的真菌毒素,会对谷物、动物饲料、动物性食品等造成污染。OTA对多种动物具有较强的肾毒性和肝毒性,并有致畸、致突变和致癌作用。对植物的研究表明,OTA还具有植物毒性。本实验研究了植物中重要的内源信号分子水杨酸(Salicyli cacid,SA)在OTA对拟南芥(Arabidopsis thaliana)毒性中的作用。利用高效液相色谱测定了拟南芥叶片在OTA处理下SA含量的变化,结果显示,OTA胁迫促进了SA含量的上升;通过实时荧光定量PCR测定了OTA对SA途径中重要的病程相关蛋白1基因(pathogenesis-related gene1,PR1)相对表达量的影响,结果显示,OTA能诱导PR1的表达,并且这种诱导作用与OTA胁迫时间有关;SA与OTA同时处理拟南芥叶片后,观察到SA能造成OTA引起的叶片坏死斑的加重,相对电导率和活性氧含量的测定结果表明,SA能加重OTA对叶片的伤害,促进OTA诱导的活性氧的上升。本研究表明,SA参与了OTA诱导的拟南芥毒性过程,SA和OTA共同处理能增强OTA的植物毒性。     

水杨酸诱导玉米对大斑病抗性的研究

外施SA可以显著减轻玉米大斑病的病害症状。表现为玉米叶片的病斑数目和病斑大小明显降低,诱抗效果超过56%。SA诱导玉米抗病机制研究表明：SA预处理,减缓了玉米大斑病菌侵染速度,表现为由侵入钉长出新菌丝,菌丝充满侵染细胞以及向邻近细胞扩展的时间推迟。SA预处理加速了病菌侵染过程中侵染点及周围玉米细胞的死亡。SA处理或SA预处理后接菌,明显增强了玉米叶片中PAL、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶活性;增加了玉米叶片内木质素、丁布的含量;而单独接菌,这些酶活性及物质含量均无明显改变。SA处理后接菌,增加了玉米叶片内H2O2含量。     

荧光假单胞菌诱导番茄抗枯萎病的ISR研究

本文采用实时荧光定量PCR技术对荧光假单胞菌PEF-5#18诱导番茄系统性抗性(ISR)的作用机理进行了研究,包括了诱导进程中番茄根系病程蛋白基因PRs族、GR等重要防卫基因以及乙烯、水杨酸、茉莉酸等诱导信号调控路径的关键基因的表达情况。结果表明,尖孢镰刀菌Forl和荧光假单胞菌PEF-5#18对番茄植株分别具有SAR和ISR诱导抗性能力,而在"Forl-番茄-PEF-5#18"互作模式下,番茄植株受诱导所产生的抗性则受到SAR和ISR共同作用的影响;与对照相比,Forl或荧光假单胞菌PEF-5#18均能诱导番茄病情蛋白基因PRs (PR1、PR4、PR5、PR6)与GR、POX、PAL等相关防卫基因的表达进行上调,而相关受诱导基因的表达程度与动态变化则与所诱导的SAR和ISR抗性反应类型以及诱导时间有关;此外,对于调控路径的分析结果显示出尖孢镰刀菌Forl对番茄SAR诱导抗性主要依赖于水杨酸路径进行调控,而荧光假单胞菌PEF-5#18对番茄ISR诱导抗性则主要依赖于茉莉酸和乙烯路径来调控。     

水杨酸诱导对玉米大斑病抗性的影响

外施水杨酸(SA)可以显著减轻玉米(Zea mays)大斑病的病害症状.外施SA后玉米叶片的病斑数目和病斑大小明显降低和缩小,诱抗效果超过56%.SA诱导玉米抗病机制研究发现,SA预处理减缓了玉米大斑病菌侵染速度,表现为由侵入钉长出新菌丝,菌丝充满侵染细胞以及向邻近细胞扩展的时间延迟;SA预处理加速了病菌侵染过程中侵染点及周围玉米细胞的死亡.SA处理或SA预处理后接菌,明显增强了玉米叶片中苯丙氨酸解氨酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的活性;增加了玉米叶片内木质素、丁布的含量;SA处理后接菌,增加了玉米叶片内H2O2含量;而单独接菌,这些酶活性及物质含量均无明显改变.     

防治大豆胞囊线虫病的土壤真菌的筛选

以辽宁省大豆田土壤中分离筛选获得的39株真菌菌株为研究对象,通过测定不同真菌菌株代谢产物浸出液在不同处理时间对大豆胞囊线虫二龄幼虫(J2)的抑制作用,评价不同菌株对大豆胞囊线虫的生防效果,从而进一步筛选出生防效果较好的菌株。结果表明,与对照相比不同菌株对大豆胞囊线虫的抑制作用具有显著差异。39株被测菌株中有7株表现出较强的抑制作用。其中真菌snf 2455-2的浸出液对大豆胞囊线虫有较强的致死作用。随着处理时间的延长,大多数菌株的抑制效果增强,同时具有抑制效果的菌株也增多。在处理72 h时,与对照相比有17株菌株抑制效果达到了显著水平。     

乙烯利处理对棉花子叶DNA表观遗传变化的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析

棉花(Gossypium hirsutum L.)叶片早衰影响棉花产量和棉纤维质量,而乙烯利是一种重要的植物生长调节剂,对促进植物组织衰老有重要作用。DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分,在高等植物的基因表达调控中发挥了重要作用。本研究应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,探讨在不同乙烯利水平处理下,棉花子叶DNA甲基化水平和甲基化变化模式。结果显示,经300、500和700 mg/L乙烯利处理后,棉花子叶DNA甲基化比值分别为32.99%、35.45%和37.49%,都低于对照组(37.92%);和对照组相比,经不同浓度乙烯利处理后,棉花子叶DNA发生甲基化变化位点的比率分别是2.71%、3.63%和4.88%,而去甲基化位点的比率分别为10.66%、9.84%和9.23%,并且随着乙烯利浓度的增加,棉花子叶DNA甲基化位点与去甲基化位点之比逐渐提高;本研究鉴定了17个MSAP差异基因片段,这些片段与NCBI中已知的功能基因存在同源性,包括果胶甲酯酶基因、细胞色素P450、乙醇脱氢酶基因、肌动蛋白解聚因子、翻译延伸因子等和乙烯利诱导棉花子叶衰老相关基因。研究结果提示,在乙烯诱导棉花子叶衰老的进程中,DNA甲基化参与了棉花子叶衰老的调控,为从基因组水平上揭示乙烯诱导棉花衰老的调控机制提供理论依据。     

不同品种苹果叶片对外源水杨酸的生理响应

为探究富士和嘎啦对外源水杨酸的生理响应机制,采用叶片喷雾法,测定外源水杨酸(SA)对苹果叶片中丙二醛(MDA)含量、防御酶活性及病程相关蛋白(PR)基因表达的影响。结果表明,0.2mmol·L~(-1)SA处理后,富士和嘎啦叶片中MDA含量变幅较小且均与对照无显著差异;SA处理显著提高了叶片中过氧化氢酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,富士和嘎啦叶片中各酶活性峰值分别是对照的1.31倍~2.06倍和1.16倍~3.13倍。SA诱导后苹果叶片中PR5和PR8的表达明显上调,富士于处理后第3天基因表达量达到高峰,而嘎啦于处理后第1天基因表达量最高。研究表明,外源SA可提高苹果叶片中防御酶活性并诱导PR基因上调表达,但富士和嘎啦中酶活性水平和持续时间及PR基因的应答反应存在差异。本研究为利用植物诱导抗病性防治苹果叶部病害提供了科学依据。     

玉米||大豆间作对AMF时空变化的影响

为探究农田生态系统中不同种植模式下丛枝菌根真菌(AMF)生长发育及产生孢子和球囊霉素状况,本试验设置两种结构的间作模式(6M6S:6行玉米与6行大豆间作; 3M3S:3行玉米与3行大豆间作)以及单作玉米(CKM)和单作大豆(CKS)4个处理,分析不同种植模式对AMF生长时空变化的影响。结果表明:菌根侵染率、侵染密度和菌丝密度随着AMF与作物共生期延长逐渐增加,丛枝丰度呈现先增加后减少的趋势。两年试验中,玉米乳熟期(大豆鼓粒期), 3M3S处理的菌根侵染率、侵染密度和丛枝丰度,土壤孢子密度、易提取球囊霉素含量和总球囊霉素含量均显著高于单作。在作物生育期内, AMF的孢子密度从269.40个·(100g)~(-1)增加至1 484.20个·(100g)~(-1),易提取球囊霉素含量从430.88μg·g~(-1)增加至600.78μg·g~(-1),总球囊霉素含量从942.59μg·g~(-1)增加至1 304.03μg·g~(-1)。玉米乳熟期,间作边行玉米的菌丝密度、孢子密度、易提取球囊霉素和总球囊霉素含量最高;大豆鼓粒期,间作边行大豆的菌丝密度和易提取球囊霉素含量最高,孢子密度最低。相关性分析表明,总球囊霉素和易提取球囊霉素与菌丝密度呈极显著正相关,相关系数分别达0.71和0.73;孢子密度和菌丝密度与侵染率呈极显著正相关,相关系数分别达0.72和0.75。因此,农田生境中AMF能与根系建立良好的共生关系,并随着季节变化和作物生长呈现周期性变化。间作促进了AMF的侵染,增加了球囊霉素和孢子的产量,间作处理中AMF与各行作物共生表现出边际效应。3M3S处理是最有利于AMF生长的种植模式。     

大豆发状根乙醇诱导表达系统的建立及验证

为在大豆中建立目的基因表达可控的化学诱导表达系统,本研究构建了基于乙醇诱导表达系统(ALCA switch)的GUS和GmFT2a表达载体,利用发状根农杆菌介导的根系转化体系,分别获得转ALCA-mini35S-GUS和ALCA-mini35S-GmFT2a的发状根,通过检测GUS的表达情况和GUS酶活性高低评定该系统在大豆发状根中的诱导效率,并通过检测GmFT2a表达水平加以验证。结果表明,在非诱导条件下,ALCA-mini35S-GUS发状根中未见GUS表达,而在培养基中添加乙醇后组织化学染色效果明显,说明GUS基因表达。乙醇诱导表达的效率与乙醇浓度有关,当乙醇浓度为0.05%、处理60 h时GUS相对表达量达到最高值,处理72 h时GUS酶活性最高;0.05%乙醇处理72 h时,ALCA-mini35S-GmFT2a发状根中GmFT2a相对表达量平均值约为诱导前的150倍,个别样本可达初始值的400倍。综上所述,乙醇诱导表达系统可以在大豆发状根中发挥作用,该系统不仅可用于大豆基因功能研究,而且可为培育外源基因表达可控的转基因大豆品种提供新的技术手段。