羊口疮LAMP诊断方法的建立及其初步应用

根据GenBank中的羊口疮B2L基因序列,设计合成2对引物,通过对环介导等温扩增条件的优化,敏感性、特异性试验,成功建立了羊口疮LAMP诊断方法.敏感性结果显示,建立的LAMP诊断方法最低核酸检测量为0.50pg/L,而PCR诊断方法最低核酸检测量为50pg/L,特异性结果显示,羊大肠杆菌、羊沙门氏菌、口蹄疫病毒、山羊痘病毒的扩增结果均为阴性.对195份自然感染病羊样品的检测结果表明,该LAMP方法检测结果与PCR检测结果符合率为96.4％.整个扩增反应可在30min内完成,结果肉眼可见,为羊口疮的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法,从而满足基层现场快速检疫需要.     

一例绵羊传染性胸膜肺炎、羊口疮及溶血性曼氏杆菌混合感染的研究

以新疆某羊场疑似传染性胸膜肺炎和羊口疮混合感染的绵羊作为研究对象,对其感染情况和发病症状进行调查记录;对死亡的羊只进行解剖;无菌采集病羊肺脏组织后,通过细菌分离鉴定和绵羊支原体PCR以及羊口疮病毒PCR的方法进行实验室病原诊断。结果表明:死亡羊只嘴角结痂、口腔糜烂,胸膜与心包膜、胸膜发生粘连,肺实质发生肝变,切面呈大理石样,具有典型的羊口疮和胸膜肺炎的特征;绵羊支原体、羊口疮病毒和曼氏杆菌PCR检测结果均为阳性,小反刍兽疫和口蹄疫核酸检测结果为阴性。该病例最终诊断为绵羊肺炎支原体、羊口疮病毒和溶血性曼氏杆菌的混合感染。本研究通过对绵羊支原体肺炎、羊口疮和溶血性曼氏杆菌的临床症状、病理变化、实验室诊断等方面的介绍,可为今后该病的防控工作提供指导和借鉴。     

羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用

根据羊口疮病毒(ORFV)H2L基因序列,设计合成1对引物,通过确定最佳的PCR反应条件,建立了检测羊口疮病毒DNA的PCR检测方法.结果显示,用这1对引物均能扩增出羊口疮病毒507 bp的特异性片段,同时检测口蹄疫病毒和山羊痘病毒,结果均为阴性,最小检出量为5 pg.该方法具有良好的特异性和敏感性,可对临床组织病料中的ORFV进行快速检测.     

小反刍兽疫病毒RT-nPCR检测方法的建立

为了建立一种适用于临床快速诊断的小反刍兽疫病毒(PPRV)RT-nPCR检测方法,试验依据GenBank公开的PPRV基因序列,针对F基因设计了2对引物,经过反应成分与条件的优化等方法对检测小反刍兽疫病毒的RT-nPCR方法进行了研究。结果表明:该方法检测的极限为4.362×10~(-5) ng·μL~(-1),羊口疮病毒、山羊痘病毒、口蹄疫病毒和蓝舌病病毒检测为阴性,临床28份样品检测结果有4份样品为阳性,阳性率14.3%。说明成功建立了一种高度特异、灵敏的检测PPRV的RT-nPCR方法。     

宁化县羊口疮病的诊治及其感染检测与分析

为进一步了解宁化县羊群感染羊口疮病毒的情况,该研究采用PCR方法对随机采自宁化县6个乡镇各1个羊场（户）的样品进行检测,根据羊口疮病毒核酸检测结果诊断是否患羊口疮病,对确诊患病的羊只及时治疗。结果 6个被检羊场中4个为阳性场,场阳性率为66.67%;不同羊场羊口疮病毒阳性感染率高低不一,高的达22.92%;随机所采的373份样品中,平均阳性感染率为8.04%;在6个被检羊场中,种羊、羔羊和育肥羊的阳性感染率分别为5%、 12.23%和3.2%,可见羔羊为该病毒主要感染群体。以上结果表明,宁化县羊群中羊口疮病毒的感染率较高,应引起有关部门的高度重视,羊口疮病防控决策的制定还需科学依据的支持。     

牛传染性鼻气管炎及病毒性腹泻流行病学调查及防控建议

为了解牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻在昆明地区的感染情况和流行趋势,该研究于2021—2022年采用实时荧光PCR方法对昆明市16个乡镇61家肉牛规模殖场的1394份棉拭子样品进行牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻病毒核酸检测。结果显示,2021年,牛传染性鼻气管炎病毒核酸个体阳性率0.23%、场群阳性率为2.78%,牛病毒性腹泻病毒核酸个体阳性率0.35%、场群阳性率为2.78%;经及时指导养殖场淘汰阳性病牛,2022年牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻病毒核酸全部为阴性。可见,及时发现并积极防控对根除牛传染性鼻气管炎和病毒性腹泻具有重要意义。     

A型塞内卡病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

为建立一种利用逆转录环介导等温核酸扩增(RT-LAMP)快速检测A型塞内卡病毒(SVA)的方法,从SVA细胞培养液中提取总RNA,根据SVA VP1基因序列,设计一套对应目的片段6个区域的4条特异性引物进行核酸扩增,建立RT-LAMP检测方法。利用建立的RT-LAMP检测方法对口蹄疫病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒与塞内卡病毒进行特异性试验。将SVA VP1质粒10倍梯度稀释液作为模板(1×10~0～1×10~7拷贝)进行RT-LAMP和RT-PCR反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。采集疑似发病猪的鼻腔拭子和水疱液共126份样品,应用RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化鉴定。结果表明,与传统RT-PCR相比,RT-LAMP检测方法灵敏度高1 000倍,且与其他病毒无交叉反应,具有高度敏感性和特异性。临床样品检测结果显示,鼻腔拭子样本SVA阳性率为29.6%,水疱液样本SVA阳性率为100.0%,2种方法检测结果一致,符合率为100%。综上所述,本研究建立的RT-LAMP检测方法准确、简便、经济有效,尤其适用于现场和基层实验室对SVA的快速诊断。     

口蹄疫病毒实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

基于口蹄疫病毒聚合酶3D蛋白基因的序列分析,设计合成了特异的引物和探针,通过反应条件的优化,建立了实时TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法.试验表明,实时TaqMan荧光定量RT-PCR能特异性检测A、O、Asia Ⅰ 3种血清型的口蹄疫病毒,对猪水泡病、猪瘟、蓝耳病等猪常见病原检测结果均为阴性.对比检测试验表明,实时TaqMan荧光定量RT-PCR的检测敏感性比常规的多重RT-PCR提高达105倍,对口蹄疫病毒细胞增殖病毒液的检测灵敏度可达0.063个TCID50·对临床样品的检测试验证实,该方法可以有效检测临床样品中的猪水泡皮、组织、血清及O-P液中的口蹄疫病毒.     

山羊痘的分子生物学诊断

为山羊痘的防控提供科学依据,对2010年2月贵州省龙里县醒狮镇某养羊户饲养的疑似山羊痘发病羊进行了流行病学调查、临床病例剖检病变观察、山羊痘ELISA血清抗体检测和山羊痘病原核酸PCR扩增及序列分析.结果表明,该病例具有明显的山羊痘流行特点、临床症状；未免疫羊群山羊痘血清抗体ELISA检测结果阳性率达40％；山羊痘病毒...     

北票市小反刍兽疫流行病学调查报告

正由于辽宁省北票地区是养羊业密集地区,而小反刍兽疫又是最重要的羊传染病之一,对其进行有效综合防制显得非常重要。本研究应用竞争ELISA对辽宁省北票地区羊血清样品中的小反刍兽疫病毒抗体检测,以便对羊群抗小反刍兽疫病毒的免疫力进行评定和监测。应用荧光RT-PCR对羊鼻拭子样品中的小反刍兽疫病毒核酸进行检测,以便对小反刍兽     

一起输入性羊口疮疫情的处置体会

经过政府及业务职能部门多年防控,羊口蹄疫、羊三联等疫病的爆发流行已被有效遏制,但近年来羊痘、羊口疮疫情发生呈零星散发,其危害日趋严重。笔者通过对一起输入性羊口疮疫情案例的处置,简述了羊口疮疫情发生的原因、临床症状、鉴别诊断、防治措施。     

农业部、开发银行推进国家级农产品专业市场建设

口蹄疫诊断检疫新技术与试剂盒技术简介包括区别口蹄疫疫苗免疫动物与感染动物的非结构蛋白3ABC抗体检测ELISA试剂盒(FMDV NSP 3ABC-ELISA),与检测病毒核酸的多重RT-PCR试剂盒(Multi-RT-PCR)。前者,可以对群体的感染状况进行评估,是国际动物卫生组织(OIE)推荐用于评价有疫与无疫的方法之一;后者,适合于检测病毒含量低微样品的检测,如牛、羊咽喉/食道部分泌物(OP液),带毒肉品等的检疫,比单一引物RT-PCR     

把握细节，提高猪场非洲猪瘟荧光PCR检测结果的准确性

非洲猪瘟病毒荧光PCR检测在各猪场实验室已经普及,影响荧光PCR检测结果准确性的因素众多,为提升基层兽医实验室非洲猪瘟病毒核酸检测结果的准确性,对实验室设施、设备、人员、仪器、样本选择、核酸提取及操作细节等常见问题及注意事项进行梳理汇总,为基层开展日常非洲猪瘟病毒核酸检测提供参考。     

口蹄疫荧光抗体的制备与应用

用猪抗口蹄疫病毒IgG制备荧光抗体,检测口蹄疫病毒感染BHK-21细胞中的病毒抗原,结果表明,该方法可以检出口蹄疫病毒感染BHK-21细胞中的病毒抗原,荧光抗体的工作浓度确定为1：40,且这种荧光能被FMDV阳性血清特异性地抑制。用制备的荧光抗体检测感染口蹄疫病毒CS株和LB株的BHK～21细胞抹片和飞片,结果均为阳性,空白对照均为阴性。对于低代次的分离毒,即使感染细胞产生明显的CPE,采用反向间接血凝试验也不能检出收获细胞液中的病毒抗原,本试验弥补了这一缺陷。采用直接荧光抗体法可确定病毒在感染细胞中增殖的位置,可作为兽医临床诊断方法之一。     

新疆巴州地区绵羊肺炎流行病学调查

为了解巴州地区绵羊肺炎病原的流行情况,抽检240只患肺炎羊的脏器、血清、眼结膜拭子、鼻腔拭子样品,对脏器和鼻腔拭子进行细菌的分离培养鉴定,采用ELISA方法检测血清中支原体抗体、呼吸道合胞体病毒抗体、副流感病毒抗体、结核分枝杆菌抗体,采用荧光PCR方法对眼结膜拭子进行小反刍兽疫病毒核酸检测。结果发现,溶血性曼氏杆菌检出率27.1%,链球菌检出率21.6%,多杀性巴氏杆菌检出率17.9%,支原体抗体检出率16.7%,呼吸道合胞体病毒抗体检出率40.0%,副流感病毒抗体检出率18.8%。溶血性曼氏杆菌检出率显著高于多杀性巴氏杆菌、支原体、结核分枝杆菌检出率,呼吸道合胞体病毒抗体检出率显著高于副流感3型病毒抗体检出率。表明巴州地区绵羊肺炎为多种细菌、病毒混合感染,呼吸道合胞体病毒、溶血性曼氏杆菌为其主要致病源。     

一起羊口疮病的诊断以及防治

羊口疮主要是由于羊感染了羊口疮病毒而发生的一种疾病，羔羊易感染。主要症状是在口腔粘膜、唇部等出现水泡、脓疮等，在口唇部发病时会影响羊的采食，危害性较高，给养羊业带来了一定的经济损失。本文介绍了2020年5月安徽省六安市金寨县某养羊场出现疑似羊口疮病例，根据临床症状以及实验室PCR检测，最终确诊为羊口疮病。如何预防以及治疗羊口疮，大部分的养殖户缺乏这一方面的知识，不能即使的发现该疾病以及不能提供一个很好的治疗方案。本文对该病发生的原因进行了分析以及提出了如何防治的一些建议，希望对相关人员有一定的帮助。     

技术市场

<正>口蹄疫诊断检疫新技术与试剂盒技术简介包括区别口蹄疫疫苗免疫动物与感染动物的非结构蛋白3ABC抗体检测ELISA试剂盒(FMDV NSP 3ABC-ELISA),与检测病毒核酸的多重RT-PCR试剂盒(Multi-RT-PCR)。前者,可以对群体的感染状况进行评估,是国际动物卫生组织(OIE)推荐用于评价有疫与无疫的方法之一;后者,适合于检测病毒含量低微样品的检测,如牛、羊咽喉/食道部分泌物(OP液),带毒肉品等的检疫,比单一引物RT-PCR     

口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ型定型诊断胶体金免疫层析方法的建立

【目的】建立一种从田间样品中快速、灵敏、简便检测O、A、Asia I型口蹄疫病毒抗原的胶体金免疫层析方法（GICA）。【方法】采用柠檬酸三钠还原制备胶体金颗粒,标记纯化的标准株O、A、Asia I型口蹄疫抗体。将纯化的口蹄疫流行株O/China99,A/AF72 and AsiaⅠ/China05抗体和羊抗豚鼠抗体分别包被在硝酸纤维素膜上,作为检测带与质控带。经试验条件优化,组装形成胶体金定型诊断试剂盒。【结果】本试验研制的口蹄疫定型试剂盒具有良好的灵敏度,可检测到7.8×104 LD50（1﹕128倍稀释乳鼠毒）的病毒量。同时对阳性及阴性样品进行3次重复检测结果完全相同,说明其有较好的重复性;特异性试验证实该方法在检测口蹄疫临床症状相似病原,如猪水疱病抗原（SVD）、水泡性口炎（VS）、水泡性疹（VES）等病毒时无交叉反应;试剂盒对206份已知血清型田间及实验室样品的符合率试验,O、A、AsiaⅠ型和阴性样本的符合率分别为92.45 %、91.66%、92.75%、100%定型准确率94.58%。试剂盒在4℃下可保存6个月。【结论】本试验研发的口蹄疫病毒胶体金定型诊断试剂盒是一种快速、灵敏、特异的FMD抗原检测方法,对基层现场具有广泛应用价值。     

牛精液中IBRV荧光PCR检测方法的建立及精液带毒与血清抗体的关系

【目的】建立牛精液中牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光PCR检测方法,并分析精液带毒与血清抗体的关系,为牛精液中IBRV的荧光PCR诊断和判定提供技术依据。【方法】采用Sephycral S-400凝胶过滤法和蛋白酶K预消化法,分别对新鲜牛精液和冻存牛精液进行处理,用DNA Zol方法提取病毒核酸,通过PCR反应条件的优化,建立了牛精液中直接检测IBRV的荧光PCR方法,对该方法进行特异性和重复性检验;最后用该方法分别对120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液进行检测,同时用普通PCR方法和病毒分离方法加以对比;并对其中的10头牛定期采集精液、鼻腔拭子和血清样品,用该荧光PCR方法进行病原检测,对血清样品进行IBRV抗体检测。【结果】建立的荧光PCR方法具有较好的特异性,重复性和稳定性很好。用该方法可检测到新鲜牛精液中0.002 TCID50的病毒粒子,检测到冻存牛精液中0.02 TCID50的病毒粒子,检测时间在3 h之内,是OIE已报道方法灵敏度的40~400倍,是病毒分离方法灵敏度的100倍。120份新鲜牛精液和40份冻存牛精液中,检测到阳性样品25份,用普通PCR检测得到阳性样品15份,病毒分离检测得到阳性样品12份。检测结果表明,精液为阳性的牛血清抗体不一定为阳性,血清抗体阳性的牛精液中也不一定携带病毒。【结论】建立了牛精液中IBRV的荧光PCR检测方法;通过分析精液带毒与血清抗体的关系,进一步表明不能简单地以血清抗体阴阳性作为精液是否带毒的依据。鼻腔拭子带毒具有间歇性。     

利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪场中感染猪肺炎支原体研究(英文)

[目的]2012年3月至12月从江苏泰州某猪场采集303份鼻拭子样品,利用巢式PCR和荧光定量PCR比较检测猪肺炎支原体的感染情况。[方法]采集7、14、21、28、30和35日龄的猪的鼻拭子,4℃浸泡于PBS过夜,TIANamp?细菌DNA提取试剂盒提取DNA。然后进行Mhp183的荧光定量PCR及P36的巢式PCR检测。[结果]通过巢式PCR检测,12.5%(38/303)份样品为猪肺炎支原体阳性,用荧光定量PCR检测,50.2%(152/303)的样品为阳性。两种方法检测均为阳性的样品为22份,占7.3%,两种方法检测均为阴性的样品为127份,占41.9%。两种检测方法的感染模式相同,均在7日龄和35日龄的小猪中感染率最高,巢式PCR的感染率分别为15.6%和18.4%,荧光定量PCR的感染率分别为53.1%和56.6%。[结论]两种PCR方法均适用于猪场感染状态的检测。