核桃(Juglans regia L.)MicroRNA实时荧光定量RT-PCR内参基因的筛选

RT-qPCR是目前应用最广泛的基因表达分析方法,选择合适的内参基因对数据进行标准化至关重要。结合geNorm、Normfinder和RefFinder 3个软件分析了8个候选miRNA内参基因在核桃不同分化期花芽与叶芽、不同组织及不同品种中的表达稳定性。结果显示,jre-miR394a,jre-miR159a和jre-miR159c可作为不同分化期花芽中基因表达分析的内参;5.8S rRNA和jre-miRn3可作为不同分化期叶芽中基因表达分析的内参;5.8S rRNA,jre-miRn3、jre-miR159b-3p和jre-miR159c可作为不同组织中基因表达分析的内参;jre-miR159b-3p,jre-miR159c和jre-miR159a可作为不同品种中基因表达分析的内参。5.8S rRNA不适合作为不同分化期花芽和不同品种中基因表达分析的内参。本研究为核桃miRNA表达分析中的数据标准化提供数据支持和理论参考。     

彩色马蹄莲不同品种和组织qRT-PCR内参基因筛选

为筛选出彩色马蹄莲不同品种和组织最佳内参基因,以彩色马蹄莲不同品种和不同组织为研究材料,运用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)结合3个内参基因稳定性分析软件(geNorm, NormFinder和BestKeeper),对彩色马蹄莲6个候选内参基因(18S rRNA, ACT, EF1α, GAPDH, LEU和TUB)的表达稳定性进行了分析。通过geNorm软件计算出彩色马蹄莲不同品种和组织的最适内参基因数目均为3个;综合3个软件的分析结果,筛选出彩色马蹄莲不同品种中稳定性最好的3个基因为18S rRNA、LEU和GAPDH;不同组织中稳定性最佳的3个基因为ACT、EF1α和18S rRNA。本研究为彩色马蹄莲品种间叶片表型差异、种球发育、赤霉素敏感差异等机理研究提供参考依据。     

百合体胚诱导、发育及不同组织实时定量PCR内参基因筛选

本研究筛选观赏百合(Lilium oriental×Trumpet hybrid)体胚诱导、发育不同时期及不同组织中稳定表达的内参基因,以观赏百合品种‘Conca D'Or’为研究对象,采用实时荧光PCR分析百合8个候选内参基因(18S,ɑ-TUB,GAPDH,UBQ,b HLH,ACT,EIF,EF1)在体胚诱导不同时期、体胚发育不同阶段及不同组织中的扩增效果,并采用Genorm、Norm Finder和Best Keeper三种软件对候选内参基因在百合中的表达稳定性进行综合评价。结果表明:b HLH在体胚诱导、发育及不同组织中的稳定性优于其他基因;GAPDH及ACT在观赏百合‘Conca D'Or’上扩增效果差。将体胚诱导不同时期、体胚发育不同时期及不同组织的扩增数据放在一起分析,Ge Norm和Norm Finder软件评估最适内参基因为b HLH和EIF,Best Keeper软件评估最适内参为EF1和b HLH。本研究建立了观赏百合实时荧光定量PCR内参基因的筛选体系并选出观赏百合体胚诱导、发育及不同组织表达最稳定的前三个内参基因分别为b HLH、EIF和EF1。     

大白菜-结球甘蓝易位系实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了提高实时荧光定量PCR分析大白菜基因表达的准确性,选取添加结球甘蓝4号染色体片段的大白菜-结球甘蓝易位系营养生长阶段的幼苗期、莲座期、包心期、结球期的叶片和不同大小花蕾,及生长素(Indole-3-acetic acid,IAA)和生长素抑制剂(2,3,5-triiodobenzoic acid,TIBA)处理后的叶片为材料,运用ge Norm和Norm Finder这2种分析方法,对Apr、BcTIP41、U34559、EF1α、TUB4、CYP、DNAJ、HIS、TUA5、UKN1、SKIP16、CAC、ACTIN、ACTIN-1、ACTIN-2、GAPDH、UBC30、UBQ、PPR、PP2A、MDH共21个内参基因进行稳定性鉴定。结果表明,不同发育时期、不同组织部位的材料,以及在不同激素处理条件下,大白菜-结球甘蓝易位系qRT-PCR最适内参基因各不相同。在营养生长阶段(从幼苗到结球),内参基因UKN1和TUB4表达最为稳定。在大白菜-结球甘蓝易位系包心期利用生长素IAA处理后,最稳定的内参基因为BcTIP41和ACTIN;生长素抑制剂TIBA处理后,最稳定的内参基因为UKN1和BcTIP41。在花发育的6个等级大小花蕾中,发现DNAJ、ACTIN和PP2A最为稳定。研究结果为大白菜-结球甘蓝易位系基因表达量的精确分析奠定了基础,同时也为芸薹属其他植物不同发育时期及激素处理对内参基因的选择提供了参考。     

梨花芽休眠进程中microRNA实时定量PCR内参基因的筛选

本研究通过分析候选内参基因的表达稳定性,筛选出适合梨花芽休眠进程中microRNA实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的内参基因。本研究以休眠不同时期的砂梨花芽为材料,挑选了15个候选内参基因,用qRT-PCR技术检测候选基因在休眠不同时期的表达量,利用geNorm、Norm Finder和Best Keeper软件进行表达稳定性综合分析。研究结果表明,梨花芽休眠不同时期中表达最稳定的单个内参基因是miR3.0_22782,最稳定的内参基因组合是miR3.0_22782和miR171。本研究为准确探究梨花芽休眠进程中miRNAs的表达及进一步研究提供科学依据。     

沙地云杉种子内参基因的筛选与验证

为筛选出沙地云杉(Picea mongolica)种子成熟过程中均可稳定表达的内参基因,本研究以沙地云杉种子不同发育时期的样本为研究对象,采用RT-qPCR技术,检测沙地云杉种子转录组数据库中GAPDH、EF1α、CYC、Actin等8个候选内参基因在种子发育过程中呈现的综合表达水平,并通过内参基因分析软件(geNorm, NormFinder, BestKeeper)对其稳定性统一评估。结果表明,候选内参基因中稳定性最好的是CYC、EF1α和GAPDH。分别以CYC、EF1α和GAPDH作为内参基因对沙地云杉胚胎发育关键调控基因LEA1(Late embryogenesis abundant protein)和WOX9 (WUSCHEL related homebox)进行了定量分析,其表达趋势基本一致。本研究结果将对沙地云杉及近缘物种的分子育种研究提供参考。     

菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择

实时荧光定量PCR具有灵敏度、特异性和重复性好等优点,是植物中常用于基因表达和转录分析的重要手段。在分子生物学的研究中,选择表达相对稳定的内参基因是分析实时荧光定量实验数据的前提。本研究以菊芋(Helianthus tuberosus)开花时期的幼根、嫩茎、叶片、块茎和花瓣为材料,运用荧光定量PCR方法分析了18S rRNA、EF1α、Actin、β-actin、GAPDH、25S rRNA和UBQ5 7个内参基因的表达量,通过Ge Norm、Norm Finder和Best Kkeeper软件的综合分析,发现25S r RNA的稳定性最好,可用于菊芋基因表达的内参基因。而GAPDH在不同样品中稳定性最差,不适合作为内参基因。本研究为菊芋实时荧光定量PCR中内参基因的选择提供了参考。     

文冠果实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为筛选适用于文冠果(Xanthoceras sorbifolium Bunge)性别分化过程研究和不同器官的内参基因,本研究以文冠果性别分化关键期的顶芽和侧芽、根、茎、叶、种仁、雌能花和雄能花为材料,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)鉴定7个候选内参基因(Actin,UBQ,EF-1α,TUB,eIF-4α,18S rRNA和GAPDH)在各样品中的表达量,并评价7个基因的表达稳定性。结果表明,7个候选内参基因在不同样品中的表达量存在明显差异,各基因在雌能花中的表达均显著高于其他材料,在雄能花中的表达处于较低水平;适用于文冠果性别分化过程的最优内参基因为UBQ和eIF-4α,适用于不同器官的最优内参基因为EF-1α和GAPDH。研究结果将对今后进行文冠果性别分化过程研究和不同器官中的基因表达分析提供参考。     

地黄实时定量PCR内参基因的筛选

本文通过RT-qPCR分析了地黄中7个传统内参基因18S、EF-1?、ACT11、UBQ10、UBQ5、TUB5、GAPDH和4个新报道的内参基因PP2A、RPⅡ、HSP90、TIP41的mRNA表达差异情况,分别利用Ct值比较,GeNorm、NormFiner和BestKeeper软件分析它们在两个发育时期、八种不同组织器官中表达稳定性。结果表明：在地黄花器官中（花瓣、花托、雄蕊、雌蕊、子房）,TIP41和UBQ10表达稳定;在地黄生殖生长期和营养生长期不同器官中（根、茎、叶）,TIP41和UBQ5表达稳定。因此,以上两组基因分别适宜作为不同营养器官的内参基因。     

Expression Analysis of PpKO Gene in Pear Shoots Apical Tissue by Real-time Fluorescent Quantitative PCR

以黄金梨不同发育时间的新梢茎尖为试材,应用实时荧光定量PCR技术,对18S rRNA、Actin、GAPDH和S19这4个常用内参基因在梨茎尖组织中的表达稳定性进行了评估.GeNorm软件分析显示,它们表达稳定度的平均值(M)依次是0.365,0.392,0.457和0.517,即表达稳定性从高到低的排序是:Actin＞18SrRNA＞GADPH＞S19.选择Actin作为校正内参基因,对处于不同发育时期的新梢茎尖组织中贝壳杉烯氧化酶基因PpKO的表达量进行研究,发现该基因在新梢生长过程中出现2次表达高峰,基本与春梢、秋梢的快速生长期吻合,且秋梢中的表达量远高于春梢.     

甜椒小孢子发育的细胞学观察

为研究甜椒小孢子发育时期的染色鉴定方法以及探讨小孢子发育时期与花器形态的相关性,采用不同染色方法进行甜椒小孢子的细胞学观察,并对小孢子发育期的细胞学特征以及小孢子不同发育时期与花器外观形态的关系进行研究。结果表明,甜椒小孢子经酒精盐酸处理后,用醋酸洋红染色液的染色效果最佳;甜椒小孢子的发育经历四分体期、单核早期、单核中期、单核后期、双核期直至花粉粒成熟期,各时期的特征明显;甜椒小孢子各发育时期与花蕾外部形态具有密切的相关性。     

红花檵木实时荧光定量PCR分析内参基因的选择

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)是目前基因定量表达分析的重要方法,而适宜内参基因的选择对目的基因表达特征的准确分析至关重要。本研究以红花檵木‘大叶红’（ L. chinense var．Rubrum ‘Dayehong’）的芽、嫩茎、叶、花瓣、种子和愈伤组织为材料,采用qRT-PCR 技术比较了4个常用看家基因微管蛋白基因(α-tubulin)、肌动蛋白基因(β-actin)、18S 核糖体 RNA(18S rRNA)与甘油醛-3-磷酸-脱氢酶基因(GAPDH)的表达情况,结果表明：（1）4个看家基因均能特异扩增并显示较高的扩增效率;（2）经 geNorm 和 NormFinder 程序综合分析,当采用qRT-PCR分析红花檵木不同器官和组织中的基因表达差异时,以GAPDH表达最为稳定,可选择作为校正内参基因;在比较不同发育阶段的叶片及明暗处理的愈伤组织中的基因表达差异时,β-actin表达最为稳定,可以选择作为校正内参基因。     

SSCP Marker Development and Analysis of Candidate Restorer Gene Rf1 for Cotton Cytoplasmic Male Sterility

[Objective] Locating the cotton cytoplasmic male sterility (CMS) restorer gene Rf₁ is important for investigating restorer gene mechanisms and improving restorer lines. In our previous study, a gene cluster, with nine Pentatricopeptide repeat(PPR) genes and nine other genes, was found within the 160-kb Rf₁ target region in Scaffold 333. The objective here was to improve the density of Rf1-linked markers in the target region and determine the expression profiles of candidate genes. [Method] Using the sequences of the 18 genes, we designed 155 single-strand conformation polymorphism (SSCP) primers covering all of the gene sequences to identify the polymorphic SSCP markers between the fertile and sterile pools. Additionally, real-time polymerase chain reaction(PCR) was performed to analyze the expression profiles of eight candidate genes in the four developmental stages of buds of sterile, maintainer and restoring lines, respectively. [Result] In total, 15 polymorphic primers were identified. A genotype analysis of the F₂ population was conducted using the 15 primers and 3 other polymorphic simple sequence repeats (SSR) markers. The markers were distributed in a 4.8 cM range. In addition, owing to the influence of sterile cytoplasm or restorer genes, most of the genes showed different expression patterns in the four developmental stages of the three lines' buds. [Conclusion] SSCP markers tightly linked to Rf₁ were identified and the expression profiles of candidate genes were determined. This study provides a basis for the further fine mapping of restorer genes and for candidate gene screening.     

矮牵牛DFR-A基因的克隆与表达分析

通过分离矮牵牛DFR-A基因,研究其在不同部位的表达规律和酶活性变化,为花色素苷合成的结构基因分离及其他研究奠定基础。基于已公布的矮牵牛DFR序列,直接从矮牵牛花瓣中分离了DFRA基因序列,利用实时荧光定量PCR技术研究其在不同器官中的表达特性,同时测定了不同器官中的DFR酶活性。（1）矮牵牛DFR-A基因cDNA序列为1473 bp,该基因最大开放阅读框为1143 bp,编码380个氨基酸。（2）DFR-A基因在矮牵牛各种器官中均有表达,但不同组织中表达量存在差异,在花药中的表达量最高,其次是初开和盛开花瓣中,各期花蕾中的表达量都较低,而在叶中表达量最低。（3）DFR酶在叶片及花药中几乎无活性。在初开花瓣中达到最高峰。（4）除花药以外的部位,DFR酶活性与DFR mRNA浓度存在线性相关性。矮牵牛DFR酶活性主要受转录调控,活性在初开花瓣中最高。     

生长素响应报告基因转化棉花及GUS检测

通过构建以GUS为报告基因的生长素响应表达载体的遗传转化,开展了棉花生长素的原位研究。经棉花叶片瞬时表达分析,证实该报告基因在棉花中有效。采用农杆菌子房注射法将该报告基因转化至湘杂棉21号后,经筛选检测,获得了3株阳性转基因棉花植株。对转基因棉花胚珠及花原基进行的GUS检测表明在棉花受粉前2 d(-2 DAP,Dayafter pollination)至受粉后2 d(2 DAP)的胚珠发育期间,棉花胚珠表面生长素水平呈现"V"形变化过程,且在受粉2 DAP后,GUS染色更集中分布在分化了的纤维细胞中。说明在棉花受粉前的胚珠发育早期,表层细胞中含有较高浓度水平的生长素,维持着表层细胞的持续分裂。而在胚珠表层纤维细胞分化期生长素浓度降低,GUS着色变浅。受精后,纤维细胞开始伸长突起,伸长的纤维细胞中有更强的GUS着色,证明分化了的纤维细胞中具有较高浓度的生长素分布,这可以促进纤维细胞的伸长生长。胚珠表层相邻细胞的低水平的生长素对棉花纤维细胞的分化突起可能起关键作用。对花原基的GUS染色观察,生长素主要集中分布在分化的花组织细胞分裂活跃的区域,表明生长素在促进花器官的发育和器官建成方面有重要作用。     

油菜育性相关多聚半乳糖醛酸酶基因MF6的获得及表达分析

本研究目的在于利用化学杀雄剂"化杀灵WP1"诱导甘蓝型油菜R121产生雄性不育,并对花蕾中的差异表达基因进行分离、筛选及定量表达分析。首先,通过抑制消减杂交技术(SSH)和反向Northern斑点杂交技术,分离和筛选出在雄性不育花蕾中差异表达的基因片段。然后,将差异片段测序后在NCBI数据库中进行同源性比对及功能分析。最后,对差异表达基因进行反转录荧光定量表达(RT-QPCR)分析。本研究从筛选出来的6个阳性克隆中获得一个与多聚半乳糖醛酸酶基因(MF6)100%同源的基因片段,该基因被认为与花粉生长发育及花粉成熟密切相关。对MF6基因在不同长度及不同育性花蕾中的表达量进行了定量分析,结果显示,MF6基因在雄性可育花蕾中的表达量均高于雄性不育花蕾,且在蕾长1.00mm～1.50mm和3.50mm～4.00mm时分别达到了18.53倍和43.15倍的差异。因此,我们推测"化杀灵WP1"主要通过抑制花粉母细胞减数分裂时期中MF6基因的表达,使花粉产生败育;同时,MF6基因的表达可能也与花丝的伸长生长有关。     

棉花GhPIF4调控高温下花药败育机制初探

PIF4属于PIF家族(PHYTOCHROME INTERACTING FACTORS FAMILY),是一个响应温度变化的关键性转录因子,广泛参与植物热信号传导和激素信号通路。本研究从陆地棉‘YZ1’中克隆获得GhPIF4基因,亚细胞定位结果表明, GhPIF4是一个核蛋白。qRT-PCR分析和proGhPIF4:GUS转基因棉花GUS染色结果显示, GhPIF4基因在棉花花药中高量表达,且其表达在高温敏感型材料‘H05’中受到高温的显著诱导。在棉花中超量表达GhPIF4,不同的转基因株系表现不同的育性,表达量高的3个转基因系(OE5、OE7和OE19)开花当天的花药不开裂,花粉的活力均低于对照‘YZ1’,而超表达程度略低的OE10,花药正常开裂,花粉活性正常,表明GhPIF4导致的花药败育具有剂量效应。对OE7和OE19在9～14 mm (绒毡层降解期)、14～19 mm (有丝分裂I期)中生长素的含量以及生长素合成关键基因GhTAA1、GhYUC2、GhCYP71A13的表达分析发现基因的表达与生长素含量下降变化一致。推测超表达GhPIF4在花药后期可能部分模拟棉花的高温响应状态...     

温室大樱桃需冷量监测及扣棚时间分析

为研究设施栽培大樱桃的较小需冷量以及最合适的扣棚时间,进行设施栽培大樱桃需冷量监测试验。试验选取鲁中山区的3个大樱桃温室,进行从秋季开始直至大樱桃采收结束期间温度等气象要素观测。同时结合温室外部天气变化对3个温室大棚的扣棚时间进行分析。结果表明：在需冷量的监测中,7.2模型的最小需冷量为1070 h,0~7.2模型的需冷量为484 h;当外界温度下降到-19.1℃时,花芽冻坏率为30%,应选择在较强冷空气来临之前扣棚。     

薰衣草芳樟醇合酶基因的克隆、表达及酶活性检测

从高油薰衣草品种“杂花”中克隆得到芳樟醇合酶基因LIS1和LIS2,并对其进行了生物信息学和表达模式分析、原核表达和酶活性检测,以低油品种“法国蓝”为对照。结果表明,LIS1基因编码602个氨基酸,LIS2基因编码564个氨基酸。LIS1蛋白与阔叶薰衣草、一串红的芳樟醇合酶亲缘关系相近,LIS2蛋白与狭叶薰衣草、杂薰衣草的芳樟醇合酶亲缘关系相近。LIS1基因在“杂花”花器官半开期、盛开期和衰败期的表达量均高于“法国蓝”;LIS1基因在“杂花”花萼中的表达量最高,且仅在“法国蓝”雄蕊中少量表达。LIS2基因在“杂花”花器官不同组织和不同发育时期表达量均低于其在“法国蓝”中表达量,该基因在“杂花”花器官衰败期和“法国蓝”花器官半开期表达量最高,在2个品种花萼中高表达。LIS2基因在2个品种不同发育时期及组织中的表达量均明显高于LIS1基因。LIS1和LIS2重组蛋白具有单萜合酶活性,且均参与合成芳樟醇。