脑心肌炎病毒灭活疫苗佐剂的筛选及其效力评价

采用ISA201、ISA15A、GEL、CP940和1313佐剂分别与脑心肌炎病毒(EMCV)灭活抗原混合,配制成5种疫苗,采用BALB/c小鼠进行免疫保护试验。结果显示,5种佐剂疫苗对小鼠无明显不良反应,均能够诱导机体产生抗EMCV特异性ELISA抗体、中和抗体和淋巴细胞增殖反应,其中ISA15A、ISA201和GEL佐剂组抗体水平和淋巴细胞增殖转化刺激指数都显著高于抗原对照组(P0.01),而且,ISA15A佐剂组免疫应答反应高于ISA201和GEL佐剂组(P0.05)。采用EMCV强毒攻击,ISA15A、ISA201和GEL佐剂组免疫保护率均达90%,表明用ISA15A、ISA201和GEL这3种佐剂配制的EMCV灭活疫苗具有较高的免疫疫保护效力,为该病灭活疫苗研制奠定基础。     

猪圆环病毒2型合成肽疫苗佐剂筛选与免疫保护性研究

【目的】筛选更安全高效的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)合成肽疫苗佐剂。【方法】将IMS 251C VG、GEL 02 PR、ISA 15A VG、ISA 206 VG、ISA 61 VG、台湾细菌鞭毛、卡波姆、多糖共8种佐剂与适量PCV2多肽抗原按照特定方法配制成不同疫苗,并验证其物理性状,采用小鼠试验初步检验疫苗安全性及免疫效果,筛选出较优的佐剂进行仔猪免疫攻毒保护试验,进一步评估各疫苗的免疫保护效果。【结果】物理性状显示,所有疫苗稳定性均较好,4℃保存期均超过12个月。ISA 61 VG油佐剂黏度较高且乳滴粒径较大,ISA 15A VG、ISA 206 VG双相佐剂次之,其余水佐剂均较低较小。小鼠试验结果显示,除台湾细菌鞭毛佐剂外其他佐剂安全性均良好;小鼠ELISA抗体水平检测结果显示,ISA 61 VG、GEL 02 PR、ISA 206 VG组免疫效果明显高于其余疫苗组;综合评定安全性和免疫效果,筛选ISA 61 VG、GEL 02 PR、卡波姆、多糖、ISA 206 VG共5个佐剂组进行仔猪免疫攻毒保护试验。仔猪免疫攻毒保护试验...     

3种TLR配体对猪圆环病毒2型病毒样颗粒疫苗佐剂活性的比较

为比较3种TLR配体对猪圆环病毒2型(PCV2)病毒样颗粒(VLP)疫苗的佐剂活性,本研究利用重组大肠杆菌表达脑膜炎奈瑟菌Ag473脂蛋白、创伤弧菌FlaB鞭毛蛋白和结核分枝杆菌热应激蛋白70(Hsp70),采用镍亲和柱纯化获得该3种重组蛋白;分别将相同剂量(10μg)3种重组蛋白、ISA206佐剂(100μL)和不完全弗氏佐剂(FIA)(100μL)与PCV2 VLP疫苗(50μg)混合,肌肉注射免疫小鼠,初免后14 d加强免疫1次;初免后每周采血分离血清,采用ELISA检测抗原特异抗体;加强免疫后14 d利用PCV2攻毒,攻毒后7 d和14 d采血分离血清,采用荧光定量PCR检测病毒DNA拷贝数;攻毒后14 d迫杀小鼠,制备并培养其脾细胞,经PCV2 VLP疫苗刺激后,采用试剂盒检测细胞因子的表达。SDS-PAGE分析结果显示,3种TLR配体在重组大肠杆菌中均获得正确表达,纯化重组蛋白的纯度大于90%。从初免14 d起,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的PCV2抗体水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异不显著(p0.05)。在PCV2攻毒前,3个分子佐剂组中Ag473佐剂组的小鼠脾细胞TNF-α和IFN-γ表达水平最高,但低于ISA206佐剂组却高于FIA组,差异显著(p0.05);Hsp70佐剂组的IL-4表达水平最高,Ag473佐剂组次之,但均高于ISA206和FIA组。在攻毒后第7 d,5个免疫组小鼠的病毒拷贝数均较对照组显著下降(p0.05),但免疫组间差异不显著;在攻毒后第14 d,5个免疫组小鼠的病毒拷贝数进一步下降,免疫组间差异不显著。研究结果表明在测试的3种分子佐剂中,Ag473脂蛋白具有较强的总体免疫佐剂活性,有望进一步开发为PCV2等病毒的亚单位疫苗佐剂。     

5种塞内卡病毒灭活疫苗佐剂的比较研究

为研究比较5种塞内卡病毒疫苗佐剂,分别用4种自主研发佐剂和进口ISA206佐剂配制塞内卡病毒灭活疫苗,检测疫苗的理化性质、安全性及免疫效力,并对检测结果进行对比分析。结果显示,进口ISA206佐剂疫苗黏度为43.02 cP,自主研发佐剂疫苗黏度均在27.88 cP以下,其他理化性质无差异;5批疫苗安全性试验均未见明显异常;5批疫苗免疫动物后均可诱导机体产生中和抗体,二免后14 d抗体滴度在2¹¹以上,4批自主研发佐剂疫苗免疫组抗体滴度水平高于进口ISA206佐剂疫苗约1个滴度,攻毒保护结果均在4/5以上,2批自主研发佐剂疫苗免疫组保护率可达5/5。结果表明,用4种自主研发佐剂制备的塞内卡病毒灭活疫苗质量不低于用进口ISA206佐剂制备的塞内卡病毒灭活疫苗。     

3种不同类型佐剂的猪圆环病毒2型亚单位灭活疫苗免疫效果的比较研究

为制备猪圆环病毒2型商品化亚单位疫苗选择良好的佐剂,对由水性佐剂GEL 01、白油佐剂以及氢氧化铝胶佐剂分别制备的3种猪圆环病毒2型亚单位疫苗的免疫效果进行比较研究。本实验选取3~4周龄猪圆环病毒2型抗体阴性猪30头,根据试验疫苗接种情况分为6组,分别为:3种不同佐剂制备的亚单位疫苗(A组、B组和C组)、商品化疫苗(D组)以及空白对照组和攻毒对照组,然后进行临床观察、抗体水平监测和免疫效力评价,观察各组仔猪的不良反应情况、抗体水平以及攻毒保护情况。结果显示:3种不同类型佐剂制备的猪圆环病毒2型亚单位疫苗接种猪后均无任何不良反应、能刺激机体产生良好的ELISA抗体水平和免疫效果,但水性佐剂GEL 01制备的疫苗与另外2种佐剂制备的疫苗相比,综合抗体水平、免疫效果等因素,水性佐剂GEL 01制备的疫苗在临床使用上更具优势,为商品化亚单位疫苗佐剂的选择提供了重要的数据支持。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗佐剂选择

用水包油佐剂Merckinade SDA 25、HS1010和双向佐剂Montanide ISA 206三种不同佐剂分别制成猪圆环病毒2型灭活疫苗，对三种疫苗的稳定性、黏度、免疫仔猪后的安全性及效力进行了比较。试验结果表明，以3 000 r/min离心15 min，三种疫苗均无水析出；三种疫苗的黏度均低于200 cP；三种疫苗按2.0 mL/头的剂量接种21日龄健康易感猪，试验猪体温、采食、饮水、精神状况均正常，均无不良临床反应，剖检后各脏器均无病理变化；加强免疫后21d，各组试验猪采血，检测猪圆环病毒2型抗体效价，结果表明，佐剂MontanideISA206相较MerckinadeSDA25可诱导更高水平抗体效价。攻毒试验结果表明免疫组可以得到100%的保护。根据以上试验结果，确定猪圆环病毒2型灭活疫苗使用Montanide ISA 206。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫佐剂的比较试验

以猪圆环病毒2型(PCV2)遗传标记毒株为毒种,经细胞培养传代,优化了病毒增殖条件,获得较高滴度的病毒培养物用于PCV2灭活疫苗的研制。为了比较不同免疫佐剂的效果,本试验对国产矿物质白油和铝胶两种佐剂以及赛比克公司提供的MONTANIDETMISA206、ISA15VG、IMS1315VG3种佐剂配制的灭活疫苗进行了猪体免疫试验。通过临床观察、血清抗体效价测定,确认ISA15VG佐剂配制的疫苗在增强免疫效果方面优于其它佐剂。按5种佐剂免疫效果排序为ISA15VG、IMS1315VG、铝胶、ISA206、国产白油。ISA15VG佐剂属于水包油剂型,可刺激接种动物产生快速免疫应答反应,抗体产生效价高、持续时间长,有可能成为新型PCV2灭活疫苗佐剂的候选。     

口蹄疫纳米乳疫苗免疫持续期的试验研究

试验用同一批次相同抗原含量的口蹄疫病毒灭活抗原,分别采用纳米乳佐剂和ISA206佐剂配制口蹄疫O型、A型双价灭活疫苗,并对仔猪进行免疫,免疫后6个月内用液相阻断ELISA方法检测O型、A型免疫抗体效价(lg)。结果:免疫后6个月内纳米乳疫苗免疫猪产生的抗体lg平均值均高于ISA206佐剂疫苗,抗体水平在免疫后1个月达到最高。免疫后第6个月,纳米乳疫苗O型抗体lg平均值为2.19,A型抗体lg平均值为2.175,按液相阻断ELISA试剂盒的判定标准免疫猪抗体lg≥1.8,具有99%以上保护效力,纳米乳疫苗属于完全保护范围,而ISA206佐剂疫苗属于不完全保护范围。     

猪圆环病毒2型-肺炎支原体二联灭活疫苗佐剂的筛选

为了筛选出理想的猪圆环病毒2型(PCV2)-肺炎支原体(Mhp)二联灭活疫苗免疫佐剂,试验用灭活的PCV2病毒液和猪Mhp菌液,分别与进口白油佐剂、SEPPIC MONTANIDE ISA 206佐剂和卡波姆佐剂制成三种抗原含量相同的PCV2-Mhp二联灭活疫苗免疫仔猪,比较三种疫苗对仔猪的安全性和免疫效力。安全性试验结果表明:矿物白油佐剂疫苗免疫仔猪后,试验猪体温反应较大,部分试验猪注射部位出现肉芽肿;ISA 206佐剂疫苗和卡波姆佐剂疫苗免疫仔猪后,试验猪全身和局部反应较小。免疫效力试验结果表明:卡波姆佐剂疫苗PCV2部分的免疫效力优于矿物白油佐剂疫苗和ISA 206佐剂疫苗,保护率达100%;在Mhp保护方面,卡波姆佐剂也表现出明显的优势,卡波姆佐剂疫苗免疫后对仔猪的肺炎病变减少率达78.6%。说明卡波姆佐剂可作为PCV2-Mhp二联灭活疫苗进一步研究的佐剂。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30(SY株)不同佐剂灭活疫苗免疫效果的研究

为研究利用不同佐剂制备的猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30(NADC30-PRRSV)SY株灭活疫苗的免疫效果,本研究对由ISA201VG和ISA70VG佐剂分别制备的2种NADC30-PRRSV SY株疫苗的免疫效果进行比较研究.本研究选用35日龄PRRSV抗体和抗原均为阴性的健康仔猪15头,随机分为3组:ISA20...     

猪圆环病毒2型灭活疫苗(YZ株)的制备及对仔猪免疫效力的评价

运用不同佐剂,并配合不同剂型,制备猪圆环病毒2型(PCV2)灭活疫苗(YZ株),然后评价各疫苗对仔猪的免疫效力。制备的灭活疫苗包括:用10号白油制备油包水(W/O)剂型疫苗;用Montanide~(TM)ISA 206 VG佐剂制备水包油包水(W/O/W)剂型疫苗;分别用Montanide~(TM) ISA 15A VG和ISA 35 VG佐剂,制备水包油剂型(O/W)剂型疫苗;用Montanide~(TM) IMS 251C VG佐剂,制备水(W)剂型疫苗。除白油组外,其余4组疫苗安全性较好。5组疫苗免疫效力试验表明,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗组首免后2周和3周PCV-2荧光抗体水平显著高于白油(W/O)和IMS 251C VG(W)疫苗组(P0.05);攻毒后猪血清中病毒PCR检测,ISA 206 VG(W/O/W)疫苗组14 d均为阴性,其他免疫组21~28 d转为阴性;猪淋巴结免疫组化检测,ISA 206 VG(W/O/W)、ISA 15A VG(O/W)疫苗组均未出现PCV-2阳性,且该两组中仔猪均未出现连续2 d以上的高热症状。以上结果表明,ISA 206 VG(W/O/W)PCV2灭活疫苗(YZ株)对仔猪具有较好的免疫保护效力,可进行后续的临床扩大试验。     

不同佐剂伪狂犬病病毒主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫小鼠安全性及免疫效力测定

为了评价不同佐剂猪伪狂犬病病毒(PRV)SA株gB蛋白主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫小鼠的安全性和免疫效力,以PRV SA强毒株基因组为模板扩增gB基因保守区域,连接pET-28a载体构建pET-28a/gB表达质粒,并经基因测序和Western blot鉴定;制备的抗原与不同佐剂配比分别制备亚单位疫苗,开展不同佐剂gB蛋白主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫昆明小鼠免疫效力评估,测定免疫后不同时间体液免疫抗体水平,进行免疫攻毒保护试验,测定免疫保护力。结果表明,不同佐剂gB蛋白主要抗原决定簇gBb亚单位疫苗免疫昆明小鼠后能够产生较高的抗体水平,模式动物昆明小鼠攻毒免疫保护率达到60%,为PRV新型亚单位疫苗的研制提供了依据。     

猪捷申病毒Swine/CH/IMH/03株免疫原性的研究

为确定猪捷申病毒(Porcine Teschovirus,PTV)Swine/CH/IMH/03株免疫原性,本研究将该PTV分离株灭活后分别与氢氧化铝佐剂和Montanide ISA 50V2佐剂混合,制成油佐剂疫苗,并采用不同免疫程序接种实验猪后对病毒抗体进行检测。抗体检测结果表明:PTV Swine/CH/IMH/03分离株能够诱导实验动物产生较高抗体水平,并显著高于对照组;与氢氧化铝佐剂混合制成的佐剂疫苗免疫效果优于Montanide ISA 50V2佐剂;而且一次免疫组与二次免疫组没有明显差异。通过PTV Swine/CH/IMH/03株免疫原性的研究,为后续猪捷申病的预防工作提供技术支持。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗种毒株的筛选

为筛选满足猪圆环病毒2型灭活疫苗制苗要求的毒株,选择河南省8个地区的8株猪圆环病毒2型分离株进行抗原性分析,将各分离株培养后用不同滴度的病毒原液和其分别稀释至同一滴度(4.233×10⁴拷贝/μL)的病毒液分别制成油佐剂灭活疫苗,免疫小鼠后采血测定其抗体动态水平,以进行免疫效力评价。结果显示,8株圆环病毒2型分离株中8#和12#分离株原液制备的疫苗免疫后诱导产生的抗体水平较高,二免后1周抗体水平即高于1∶800,达到猪圆环病毒2型灭活疫苗的国家质量标准要求,3周时达到高峰,比对照商品疫苗诱导产生的抗体水平更高;其分别稀释130倍和463倍后制备的疫苗诱导产生的抗体水平在二免后3周也能达到1∶800。提示,猪圆环病毒2型8#和12#分离株毒价高,免疫效力良好,是理想的疫苗候选株。本研究丰富了猪圆环病毒2型灭活疫苗毒株的种毒资源,为研制高质量的猪圆环病毒2型疫苗奠定了基础。     

羊源致病性柠檬酸杆菌4种佐剂灭活疫苗的免疫效果比较

为筛选羊源弗氏柠檬酸杆菌灭活菌体疫苗的合适佐剂,本研究以灭活羊源弗氏柠檬酸杆菌LK-1株为抗原分别制备其矿物油疫苗、铝胶疫苗、GEL疫苗和ISA201疫苗。将4种不同佐剂疫苗分别背部皮下免疫小鼠(0.2 mL/只)和颈部肌肉免疫羊(2 mL/只)进行疫苗安全性试验。用4种不同佐剂疫苗分别背部皮下免疫小鼠(0.2 mL/只)两次后使用3 LD50的LK-1株进行腹腔攻击;颈部肌肉免疫羊(2 mL/只)两次后使用2个致死剂量的LK-1株进行耳静脉攻击,比较4种不同佐剂疫苗对小鼠和羊的保护率并对小鼠和羊免疫血清进行微量凝集抗体检测。疫苗安全性试验结果显示,矿物油疫苗导致接种动物出现严重的精神沉郁、食欲减退、以及接种部位发生肿胀坏死和疫苗残留等不良反应;其它3种佐剂疫苗不良反应较轻微。动物免疫试验结果显示,4种佐剂疫苗对小鼠的攻毒保护率分别为85%、50%、80%、100%,对羊的保护率分别为100%、75%、0、100%。4种佐剂疫苗综合比较,ISA201疫苗使接种动物产生最轻微的副反应,而且能产生较高的抗体水平和最强的保护力。本研究为进一步开发羊柠檬酸杆菌病的灭活疫苗奠定基础。     

重组H5N3亚型禽流感细胞毒灭活疫苗免疫佐剂效果的评价

为评价佐剂对疫苗免疫效果的影响,本试验以反向遗传学技术拯救的重组H5N3亚型禽流感病毒为种毒,对国产矿物油以及赛比克公司提供的MontanideTM ISA 70M VG(简称7OM)和MontanideTM ISA 206 VG(简称206)3种佐剂制备的灭活疫苗进行了SPF鸡免疫攻毒试验.结果表明国产矿物油佐剂组与70M佐剂组都能对SPF鸡100%保护,206佐剂组仅能保护40%,攻毒的SPF鸡发病,但不死亡;从抗体水平上比较发现70M佐剂组稍好于国产矿物油佐剂组,但两组之间差异不显著,而这两组与206佐剂组差异极显著.这3种佐剂组免疫鸭均能够诱导产生较高的抗体水平,70M佐剂组优于国产矿物油佐剂组和206佐剂组,但3者差异不显著.用70M系的8种佐剂MontanideTM ISA 70 essai Mi(i-1-8)(简称70Mi)佐剂乳化的疫苗免疫SPF鸡,结果表明70M佐剂组效果最好.攻毒后免疫鸡不排毒,而且无临床症状;统计学分析显示70M佐剂组与所有70Mi佐剂组差异均显著.这些结果表明70M佐剂可以作为新型疫苗佐剂用于禽流感疫苗的制备.     

两种进口佐剂对绵羊肺炎支原体灭活疫苗免疫小鼠抗体水平影响的研究

为了筛选绵羊肺炎支原体(MO)灭活疫苗的佐剂,试验采用绵羊肺炎支原体新疆分离株扩大培养后得到灭活抗原,分别与两种不同佐剂ISA 201和ISA 206混合乳化制备灭活疫苗,再以不同剂量免疫健康成年小鼠,最后用MO间接血凝的方法分别测定二免后第7,14,21,28天血清抗体效价。结果表明:ISA 206佐剂疫苗0.3 m L剂量组在第14天抗体效价就达到较高水平,第21天后开始下降;ISA 206佐剂疫苗0.2 m L剂量组在二免后第14天抗体效价达到高峰(1∶128),且在第21天仍维持抗体高峰,第28天开始下降;ISA 201佐剂疫苗0.3 m L剂量组在二免疫后第14天抗体效价达到高峰,维持1周后开始下降;ISA 201佐剂疫苗0.2 m L组免疫应答较慢,在二免后第21天才达到最高抗体效价(1∶64)。说明ISA 206佐剂诱导产生MO抗体较快,维持时间长,优于ISA 201佐剂,可作为MO灭活疫苗的优选佐剂。     

不同免疫佐剂对猪PCV2灭活疫苗效果的影响

分别用ISA11R、ISA35和ISA28三种水包油型佐剂制备PCV2灭活疫苗样品,并依次小鼠腹腔注射进行免疫效果比较。临床观察、血清抗体检测及免疫攻毒保护试验结果表明:相比矿物油佐剂ISA11R以及矿物油与非矿物油混合佐剂ISA28而言,非矿物油佐剂ISA35制备的疫苗免疫安全性好,免疫保护率高,可作为PCV2灭活疫苗理想的候选佐剂。     

PCV2-HPS二联亚单位疫苗对小鼠免疫保护效果的评价

为评价猪圆环病毒2型-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗(以下简称二联苗)对小鼠的免疫保护效果，本研究将猪圆环病毒2型(PCV2) cap基因克隆至p MAL-c5X载体中，并通过原核系统表达了重组Cap蛋白(rCap)。通过western blot检测显示原核表达的r Cap与PCV2单克隆抗体发生特异性结合，表明r Cap具有良好的反应原性。利用本研究室已经纯化并保存的副猪嗜血杆菌(HPS)重组蛋白r Cdt B、r Afua和r OPPA，与r Cap蛋白以及佐剂ISA201VG混合乳化后制成PCV2-HPS二联亚单位疫苗，疫苗中各蛋白(rCdtB、r Afua、r OPPA、r Cap)浓度均为50μg/300μL。将60只6周龄BALB/c小鼠随机均分成免疫组和对照组，采用背部多点注射方式免疫，首免后间隔14 d二免。一免后以及二免后的14 d分别通过颌下采血方法采血，通过间接ELISA方法检测各组小鼠血清中的特异性抗体，结果显示，二免后14 d，免疫组小鼠血清中CdtB、OPPA、Afua抗体水平分别与PBS+ISA201VG对照组和免疫之前比较均极显著提高(P<0.0001...     

不同圆环病毒2型疫苗对生长育肥猪影响的研究

为评估不同圆环病毒2型疫苗对生猪生长肥育期免疫效果,本试验选择国产和进口两种疫苗,对同一批23日龄断奶长大二元杂交去势仔猪360头,随机分成A、B、C三组,每组120头,A组免疫国产SEPPIC佐剂PCV2a全病毒灭活疫苗（WH株）、B组免疫进口水质佐剂亚单位疫苗（PCV2a Cap蛋白）,C组不做任何处理。结果显示,与国产圆环病毒2型疫苗相比,进口疫苗在生长性能、抗体水平及免疫保护期等方面均表现出了较强的优势,经济效益较为显著。