准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

转GhMAPK基因烟草植株的获得及其耐盐性分析

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在植物生长发育和多种生物、非生物胁迫信号转导过程中起着关键作用.GhMAPK是首个在棉花(Gossypium hirsutum)中克隆的MAPK基因,为了进一步研究其功能,本研究利用农杆菌介导法将GhMAPK转入本氏烟草,Northern杂交和Western杂交分析证实,在转基因植株中GhMAPK能够高效表达.烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株种子萌发率高于野生型烟草,苗期转基因株系能正常生长;进一步试验证明,转基因植株中的抗氧化酶(POD、SOD)活性也有明显提高.这些结果表明,GhMAPK过表达的转基因植株可以通过有效清除活性氧来提高植物对盐胁迫的抗性,GhMAPK可能参与了植物高盐胁迫信号传递过程.     

超量表达CsADH17基因提高烟草抗旱性及香气成分分析

乙醇脱氢酶是植物香气物质合成的脂肪酸代谢等途径中的关键酶之一,对茶叶芳香物质的形成有着重要作用,因此探究CsADH17基因有利于茶树的生长发育与品质提升。以本课题组前期筛选的CsADH17基因为研究对象,克隆CsADH17基因并构建植物表达载体,遗传转化烟草,对转基因烟草非生物胁迫下CsADH17的表达量和相关生理指标进行测定与分析。结果表明,对转基因与野生型烟草进行模拟干旱胁迫后,转基因烟草植株在干旱胁迫处理下的CsADH17基因相对表达量比野生型植株高。野生型烟草植株和CsADH17转基因烟草植株在干旱胁迫处理21 d后,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)的活性均高于野生型烟草;胁迫处理后,野生型烟草叶片中丙二醛(MDA)含量显著高于转基因烟草。香气成分分析,转基因烟草苯甲醛比野生型含量提高了44.4%,而烟碱含量比野生型提高不到5%。CsADH17基因在烟草干旱胁迫下具有抗旱作用,同时影响烟草的香气成分,为进一步揭示CsADH在茶树生长发育以及抗逆响应中提供参考。     

农杆菌介导的辽宁碱蓬胆碱单氧化酶基因CMO转化烟草提高抗氧化胁迫的研究

通过农杆菌介导的遗传转化,将来自辽宁碱蓬的甜菜碱合成关键基因－胆碱单氧化酶基因CMO 转入烟草,以提高烟草耐受氧化胁迫的能力,并对得到抗生素抗性植株进行了分子检测和百草枯诱导 的氧化胁迫。Southern 和Northern 检测表明CMO 已经整合到烟草基因组中,并得到了正确的表达,但 不同转基因株系中的拷贝数不同,株系T1、T2、T6 为单拷贝;株系T4、T5 为双拷贝;株系T3 为3 个拷 贝。在10 μM 和20 μM百草枯胁迫24 h 的情况下,转基因植株表现了较强的耐受氧化胁迫能力,各转 基因株系和野生型相比具有较低的丙二醛含量和较高的超氧化物歧化酶活性。这可能是转基因植物 中甜菜碱的积累诱导或保护了抗氧化酶的活性,使得转基因植株受到的氧化胁迫较低,转基因植株中 较低的电导率也证明了这一点。转CMO 基因烟草耐氧化胁迫能力的提高,说明CMO 基因可以进一步 在玉米、水稻等重要农作物中应用以提高其耐受干旱、低温等非生物胁迫的能力。     

烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

NAC作为植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草NtNAC080在非生物胁迫响应中的功能,利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下NtNAC080的表达模式,结果表明,NtNAC080的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导;以NtNAC080基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料,分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明,与野生型相比,2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强;干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型,而丙二醛含量显著低于野生型。相反地,异源表达NtNAC080的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(NtDREB1A、NtKAT2、NtNHX1等)在NtNAC080基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,NtNAC080在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用,这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。     

转入反义ScP5CS基因烟草植株对PEG和NaCl处理的反应

以转入甘蔗脯氨酸合成酶基因ScP5CS反义片段的转基因烟草与野生型烟草为材料,研究PEG6000与NaCl处理对转基因与野生型烟草植株生长及其T0代种子萌发的影响。结果表明,在17mmol/L NaCl与1%PEG6000胁迫下转入ScP5CS反义基因片段的烟草植株矮小,叶片容易发黄,根系发育迟缓,根长缩短;转基因烟草T0代种子在200mmol/L NaCl胁迫时其发芽率明显受到抑制,并随着盐胁迫处理时间达到第55天时,在50mmol/L NaCl胁迫下其叶片严重黄化,而野生型与转入空载体株系则相反。PEG6000处理对转基因烟草T0代种子萌发影响不大。可见,甘蔗ScP5CS基因在烟草中的反义表达,部分抑制了烟草P5CS基因的活力。     

转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应

为探索普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1在植物渗透胁迫中的作用,本研究应用农杆菌介导法,将PvP5CS1基因转入拟南芥,获得6株阳性转基因株系;通过检测转基因植株与野生型植株在干旱和盐胁迫下种子发芽率,幼苗脯氨酸含量、株系电导率、相对根长和成株死亡率,分析了PvP5CS1基因的表达对改善拟南芥抗渗透胁迫的效应。结果表明,在150 mmol L^-1 NaCl和150 mmol L^-1甘露醇渗透胁迫下,转基因植株平均相对发芽率分别是野生型的1.6倍和1.62倍;150、250 mmol L^-1甘露醇和150 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因拟南芥植株平均脯氨酸含量分别是野生型的2.68、1.30和1.30倍;平均相对电导率分别是野生型植株的85%、77%和85%;平均相对根长分别是野生型植株的1.2、1.3和1.2倍;300 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因植株的平均死亡率为42%,显著低于野生型(90%)(P<0.05);干旱胁迫下,转基因植株的平均死亡率为56%,显著低于野生型(70%)(P<0.05),说明PvP5CS1基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。     

过表达二穗短柄草BdDREB1-like基因提高烟草的抗氧化能力

为了研究二穗短柄草BdDREB1-like基因在转基因烟草中的功能,克隆了该基因,并进行了生物信息学分析。该基因开放阅读框684 bp,编码228个氨基酸,编码蛋白的分子量为24.178 ku,只含有一个典型的AP2结构域,属于AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-responsive element binding protein)超家族的DREB家族。多序列比对与进化分析显示它与黑麦ScCBFI的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明,BdDREB1-like基因定位于细胞核。将其构建到植物表达载体上,并通过农杆菌介导法转入烟草中。PCR和RT-PCR筛选鉴定显示BdDREB1-like基因不仅整合到烟草基因组中而且还能稳定表达。过氧化氢胁迫条件下,转BdDREB1-like基因烟草幼苗具有较高的发芽率。为了进一步确定BdDREB1-like基因与氧化胁迫的关系,又对一个月大的转基因烟草进行氧化胁迫(MV,甲基紫精)处理。结果表明,在正常生长条件下,T3转基因株系除了SOD含量外,测定的其他各种生理指标均与野生型无显著差异,T1转基因株系中只有POD和叶绿素含量与野生型中的有显著差异;而在氧化胁迫处理条件下,转BdDREB1-like基因的烟草植株相对于野生型具有较高的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和叶绿素的含量和较低的丙二醛和过氧化氢含量。这些结果表明,过表达BdDREB1-like基因增强了植物对氧化胁迫的耐受性。     

玉米ZmMGT0基因过表达载体的构建及拟南芥遗传转化研究

CorA/MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白在维持植物镁离子平衡中具有重要作用。为探讨一个表达受缺镁胁迫诱导的玉米MRS2/MGT-型镁离子转运蛋白基因ZmMGT10在缺镁胁迫中的功能,构建了ZmMGT10的过表达载体并遗传转化拟南芥,获得了转基因拟南芥株系。同野生型拟南芥植株相比,过表达ZmMGT10增加了低镁胁迫生长下转基因植株的生物量、根长和叶绿素浓度。进一步研究表明,在低镁生长条件下,转基因植株的根和叶中积累的镁离子含量均明显高于野生型植株。此外,在低镁生长条件下,转基因植株根对镁离子的吸收能力明显强于野生型植株。结果表明,过表达ZmMGT10基因可以增强转基因拟南芥植株对低镁胁迫的抵抗。     

超表达OsPup1基因可提高烟草低磷胁迫及减轻铝毒性

磷是植物生长的必需元素之一,对植物生长发育、生理代谢、产量与品质形成起着十分重要作用。研究耐低磷植物,有助于提高作物产量,降低化肥用量,提高化肥利用率。本研究通过在不同供磷条件下对转OsPup1基因植株的形态进行研究,阐明该基因在不同供磷水平对植株生长特性的影响。通过农杆菌介导法将OsPup1基因遗传转化烟草,经抗性筛选和PCR鉴定获得转基因植株。对不同转基因烟草株系,设置4个磷水平处理进行耐磷性及铝毒性分析。结果显示,转OsPup1基因烟草以0.25 mmol/L KH2PO4作为低磷处理较适合,与野生型植株相比,转基因株系植株根系数量增多,主侧根增加。在低磷胁迫及三氯化铝(Al Cl3)处理条件下转OsPup1基因烟草的生长情况明显优于野生型植株。说明转OsPup1基因对环境中的低磷胁迫逆境能产生明显应答,初步推断OsPup1基因的表达,具有增加植株根系,改善植株生长状态和延缓铝毒的生物学功能。本研究表明,OsPup1基因在介导植株不同供磷水平下的根叶形态建成发挥着重要作用。     

高粱Na~+转运蛋白基因SbSKC1的克隆及其在烟草中的抗盐功能鉴定

钠离子转运蛋白基因在植物抵御逆境胁迫中起重要作用,本研究克隆了高粱钠离子转运蛋白基因SbSKC1(XM_002457691.1),其完整开放阅读框包含1497个核苷酸,编码498个氨基酸残基。氨基酸序列比对及进化树分析表明,SbSKC1与玉米(Zea mays)LOC100382359(NP_001162576.1)具有高度相似性。构建pSH-SbSKC1植物表达载体,利用农杆菌介导法将SbSKC1转入烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)。转基因植株经PCR验证后进行300 mmol L~(–1)NaCl胁迫处理,转基因植株的存活率高于野生型,其根长显著高于野生型,而且转基因烟草保持了较高的钾钠离子比。盐胁迫后,转基因烟草的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型,而过氧化氢(H_2O_2)含量比野生型烟草低37.7%。根据以上结果推断,过量表达SbSKC1基因能够提高烟草的抗盐性。     

镉胁迫对河岸带草本植物种子萌发及幼苗生长的影响

本研究以青葙、紫花地丁、酸模叶蓼、短叶水蜈蚣、含羞草、白花鬼针草种子为材料,通过测定发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数、根长、芽长等指标,研究不同浓度镉胁迫对这6种河岸带草本植物种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明:1)除低浓度Cd~(2+)(10 mg·L~(-1))处理组,酸模叶蓼的发芽势小幅上升(p0.05),含羞草活力指数有所上升(p0.05)外,其他所有处理组植物的发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数均随着Cd~(2+)浓度升高而出现不同程度的下降,其中,青葙、酸模叶蓼在镉胁迫条件下表现相对稳定。2)高Cd~(2+)浓度明显抑制6种草本植物幼苗根、芽的生长,低浓度Cd~(2+)(10 mg·L~(-1))有利于含羞草和外来植物白花鬼针草幼苗的生长,Cd~(2+)浓度超过100 mg·L~(-1)后,短叶水蜈蚣已达到致死剂量。综上所述:青葙、酸模叶蓼、含羞草、白花鬼针草等草本植物可作为河岸带生态恢复优先考虑的物种。     

转甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草抗旱及耐盐性

将甜菜碱醛脱氢酶（BADH）基因与组成型启动子CaMV 35S启动子融合,构建了植物表达质粒pBIBB。通过根癌农杆菌介导将BADH基因导入烟草,经PCR、Southern杂交、Northern杂交证明BADH基因已整合到烟草基因组中并在转基因植株中转录和表达。测定转基因植株叶片中甜菜碱醛脱氢酶活性,结果显示对照植株没有BADH酶活性,转基因植株的各个株系间甜菜碱醛脱氢酶比活力差异较大,范围在0.1~1.0 U mg-1间。转BADH基因的烟草在盐胁迫和聚乙二醇（PEG）胁迫条件下生长状态良好,生长势强于未转基因植株,说明BADH基因能在异源植物中正常翻译、表达和用于植物抗旱、耐盐基因工程的研究。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。     

过表达截形苜蓿液泡膜H~+-PPase基因提高马铃薯的抗旱性

本研究以过表达截形苜蓿类型ⅠH~+-焦磷酸酶编码基因MtVP1的转基因马铃薯为材料,对其抗旱性进行了检测。结果显示:(1)在正常生长条件下,与野生型植株相比,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性差异均不显著,而脯氨酸含量均高于野生型植株,其中OE2株系脯氨酸含量显著高于野生型植株。随着干旱胁迫的持续,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量的下降趋势平缓,其含量均显著高于野生型对照,且两个转基因株系的脯氨酸含量和SOD活性显著高于野生型对照,而转基因株系的MDA含量显著低于野生型植株。(2)转MtVP1马铃薯表现出表皮毛增多的新表型,茎和叶表面的表皮毛明显比野生型植株多。以上结果表明,Mt VP1基因的过表达提高了马铃薯的渗透调节能力,从而增强了马铃薯的抗旱性;还表明植物类型ⅠH~+-焦磷酸酶基因可能参与调控其他的代谢通路,具有更复杂的生理功能。     

腐植酸钠对铅、镉胁迫小麦种子萌发及生长的影响

为研究不同浓度腐植酸钠对主要重金属(铅,镉)胁迫下小麦种子萌发及生长的影响,以小麦品种‘鲁麦21号’为材料,用不同浓度Pb~(2+)溶液、Cd~(2+)溶液处理小麦种子,观察记录不同浓度Pb~(2+)、Cd~(2+)溶液对小麦种子萌发和生长的影响,筛选出Pb~(2+)、Cd~(2+)胁迫浓度,在胁迫浓度下观察不同浓度的腐植酸钠对小麦种子的萌发及生长的影响。研究结果表明:铅、镉胁迫会降低小麦种子的发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数,使小麦幼苗的芽和根的生长受到抑制,其中以400 mg/L(Pb~(2+))、100滋mol/L(Cd~(2+))处理最明显。一定浓度的腐植酸钠处理提高了该Pb~(2+)、Cd~(2+)胁迫下小麦种子的发芽率、发芽势、发芽指数和活力指数等指标,促进了小麦幼苗芽和根的生长,部分缓解了铅、镉对小麦种子萌发及幼苗生长的破坏和抑制作用。但随着腐殖酸钠浓度的增大,其对铅、镉胁迫的缓解效应逐渐减弱,甚至与铅、镉起协同作用,反而加重了对小麦的毒害。本研究初步阐明了腐植酸钠对铅镉胁迫下小麦种子萌发及生长的影响,可为重金属污染农田的作物生产活动以及相关基础研究提供一定参考。     

转betA基因增强小麦的干热风抗性

甜菜碱是细胞内重要的渗透调节物质,其积累能有效提高植物对非生物逆境的抗性。以转betA基因小麦和未转基因的野生型为材料,在灌浆期模拟干热风胁迫处理植株3 d,研究干热风对植株生长和籽粒产量的影响。胁迫处理后,转基因植株保持较好长势,叶片青枯失水较少,旗叶持绿面积显著大于野生型。各株系植株的光合作用能力和蔗糖磷酸合成酶(SPS)及蔗糖合成酶(SS)活性在胁迫处理后都下降,转基因植株的净光合速率下降到2.3~3.7 μmol CO₂ m^-2 s^-1,而野生型下降到1.2 μmol CO₂ m^-2 s^-1;野生型植株的SPS和SS活性的下降幅度分别为处理前56.8%和53.9%, 而转基因株系的下降幅度分别为62.3%~69.8%和56.5%~64.5%。干热风胁迫使得各株系植株的旗叶甜菜碱含量升高,但转基因株系的叶片甜菜碱含量比野生型的高18%~87%。在甜菜碱保护作用下,转基因植株在胁迫条件下能够维持较高的光合速率,合成较多的碳水化合物,使得百粒重和单株产量均高于野生型。因此,通过转betA基因可显著提高小麦在干热风处理条件下的甜菜碱含量从而增强其抗干热风能力。     

异源表达盐单胞属(Halomonas)周质磷酸盐结合蛋白基因PBP降低转基因烟草砷积累研究

为探讨PBP基因在异源烟草中的生物学功能,筛选出低砷(As)积累亲本烟草种质。以转PBP基因烟草T₂代种子和野生型烟草(Nicotiana tabacum K326)种子为材料,利用Real-time PCR分析外源PBP的时空表达模式,测定As胁迫下转基因烟株抗氧化酶(AOEs)活性变化及分析转基因烟草株系中As积累差异。AOEs活性测定表明,As胁迫第5天时CK植株中SOD和POD酶活性达到极值,分别为80.25 U/g和152.02 U/g,显著高于转基因植株;在胁迫后期(3～5 d) CK植株中H₂O₂和MDA含量也显著高于转基因植株。另外,在第7天和14天时转基因植株中As含量比CK植株均显著降低。离子转运蛋白基因表达分析表明,As胁迫不仅诱导转基因植株PBP基因表达显著上调,而且也引起转基因和CK植株中HAK1和PHT4等通道蛋白基因的显著上调,且CK植株中HAK1和PHT4的平均表达水平为转基因植株的1.5倍和3.75倍。外源PBP基因导入可有效降低转基因烟草对As的积累。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

海藻糖酶基因RNA干扰载体对花烟草的转化

为了能够使花烟草更好地应用于园林美化,需要进一步提高其抵抗非生物胁迫的能力。海藻糖在植物抗逆性方面具有重要作用。利用RNA干扰技术抑制植物海藻糖酶基因的表达,可以阻断海藻糖降解过程,从而使植物体内海藻糖含量增加,有望以此提高植物抵抗非生物胁迫的能力。本实验利用叶盘侵染法将带有拟南芥海藻糖酶基因干扰载体(iTre-1285)的农杆菌导入花烟草中,经过抗生素筛选初步获得阳性植株后,对阳性植株提取DNA,完成了目的基因的PCR鉴定,初步证明目的基因已转入花烟草植株中。通过本试验,在建立起花烟草基因转化方法的同时,成功地将海藻糖酶干扰基因转入花烟草中。转基因花烟草植株的获得为后期能够进一步筛选出具有抵抗非生物胁迫的转基因植株奠定了基础。