农杆菌介导甘蔗基因转化技术的优化

以甘蔗（Saccharum officinarum L.）品种ROC10为转化受体材料,以GFP基因为报告基因,通过对农杆菌介导遗传转化的一系列条件,包括农杆菌菌株及侵染菌液浓度、侵染时间、受体愈伤组织龄期、AS活化时间及使用浓度、共培养时间等进行优化,同时进行了便于vir基因活化和T-DNA转移的条件组合,如附加果糖和葡萄糖、酸性环境感染,低温共培养等,从而建立了一个可行、有效而又简便的农杆菌介导的甘蔗遗传转化体系。结果表明:农杆菌菌株EHA105优于LBA4404,其适宜侵染浓度D600为1.3752;适宜受体愈伤组织龄期为25℃暗培养25d;适宜侵染时间为30min;适宜AS活化时间为2h,使用浓度为200μmol·L-1;适宜共培养时间为4d。获得2株有荧光信号的植株,对这2株植株进行斑点Southern杂交检测,均有阳性反应,证明GFP基因已整合到甘蔗基因组中并得到了有效表达,表明该转化体系确实是有效的。      

马铃薯品种‘并薯6号’遗传转化体系的建立

以马铃薯品种‘并薯6号’无菌试管苗茎段作为外植体,通过对遗传转化过程中预培养时间、植物激素的种类及配比、筛选剂浓度和抗生素的种类及浓度进行研究,初步建立了马铃薯品种‘并薯6号’的愈伤再生转化体系。结果表明,预培养时间为2 d时,愈伤组织诱导率、出苗率及转化频率最高。最适外植体愈伤组织诱导的培养基配方为MS+2.0 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+0.5 mg/L 2,4-二氯苯酚代乙酚(2,4-D)+0.4 mg/L激动素(KT),愈伤组织的诱导率为86.7%,愈伤组织形态较紧密,为深绿色,茎段两端膨大呈哑铃状,表面的白色须状物和毛状根较少。最适愈伤组织分化的培养基配方为MS+1 mg/L 6-苄氨基嘌呤(6-BA)+1 mg/L赤霉素(GA_3)+1 mg/L玉米素(ZT),幼苗比较粗壮,长势良好。最适的植株再生及生根筛选剂为10 mg/L的潮霉素(Hygromycin B,Hyg),转化频率较高,为20.3%。农杆菌抑制剂的最适浓度为200 mg/L的特美汀(Timentin,TMT),且在愈伤组织诱导、分化及生根阶段都需要加入TMT。综上所述,通过对农杆菌介导的愈伤再生转化过程中各个因素的研究,初步建立了‘并薯6号’的遗传转化体系,为马铃薯分子育种发展提供一定的基础。     

农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化影响因素分析

为解决农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化效率较低的难题,以春小麦Bobwhite成熟胚为外植体,分析植物激素、愈伤组织预培养时间、侵染时间和共培养阶段干燥处理对小麦成熟胚愈伤组织遗传转化的影响,并在遗传转化处理中辅以3个组织再生相关基因(TaSERK1、TaSERK2、TaNiR)的qRT-PCR分析。结果表明,愈伤组织预培养阶段添加适量的2,4-D和Picloram均可诱导成熟胚愈伤组织的形成,但是2mg·L~(-1)Picloram培养基中愈伤组织的胚萌发率为20.78%,远高于2,4-D诱导的胚萌发率(11.38%);共培养阶段对农杆菌侵染的愈伤组织进行干燥处理能适当提高愈伤组织的转化效率;qRT-PCR分析发现再生相关基因TaNiR相对表达量的增加能适当提高愈伤组织的转化率。     

海马齿再生体系的优化及GUS基因的转化

以海马齿无菌实生小苗的叶片为外植体,对不同激素浓度和组合以及不同pH值等培养条件进行实验比较.结果表明:适于愈伤组织诱导的培养基为MS+2,4-D 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖3%,诱导率达100%;适于芽分化的培养基为MS+NAA 3.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L,分化率达到77.4%;诱导愈伤组织形成培养基的最适pH值为4.5,而诱导愈伤组织分化培养基的最适pH值为5.0.以小苗叶片为外植体材料和农杆菌介导的方法进行GUS基因的转化,组织化学染色检测发现共培养2 d后的外植体中有蓝色斑点产生,在转化2个月后的外植体上形成的愈伤组织也存在点状的蓝色斑点.说明GUS基因已转入海马齿外植体中.     

水稻成熟胚盾片诱导愈伤组织再生体系的建立

采用水稻成熟胚盾片诱导愈伤组织作为分化再生的外植体，通过优化激素组合和调节培养基渗透压，建立了适合水稻遗传转化的高效再生体系，将水稻成熟胚诱导愈伤组织分化再生的过程划分为3个不同时期，即成熟胚盾片愈伤组织诱导，胚性细胞诱导保持，胚性愈伤组织分化再生，以CultureI(LS 2,4-D2.0mg/L)诱导成熟胚盾片愈伤组织，愈伤组织剥离后接种于Culture II-3(LS 2,4-D 2.5mg/L 山梨醇3g/L)上诱导胚性愈伤组织，继代后接种于Culture Ⅲ-2(MS NAA 0.5mg/L 6-BA 1.0mg/L Kinetin 2.0mg/L 山梨醇8g／L）上分化成苗，培养结果表明，该再生体系所获得的胚性愈伤组织分化再生率均在60％－80％之间，利用本研究建立的高效再生体系建立水稻外源基因遗传转化系统，使转化过程中所得转化愈伤组织高效再生成苗，从而顺利获得转化植株，可以提高水稻外源基因转化的效率，为水稻品种的定向遗传改良提供优良的遗传转化技术体系。     

二穗短柄草成熟胚再生体系建立及农杆菌介导转化研究

为建立二穗短柄草组织培养及遗传转化体系,以二穗短柄草BD21-3成熟胚为外植体,对成熟胚愈伤诱导、分化以及农杆菌侵染条件进行了研究。结果表明,在含有2.5mg·L~(-1) 2,4-D的培养基上,愈伤组织出愈率最高为93.83%;在含有0.2mg·L~(-1) KT的分化培养基上,分化率最高为38.18%;对二穗短柄草胚性愈伤组织农杆菌转化和GUS染色结果表明,侵染的过程中农杆菌菌液浓度OD_(600)为0.6、侵染时间为5min时转化率最高。     

广东丰顺县青蒿产业化发展现状与对策

以剑麻无菌苗叶片为试材,研究了潮霉素(Hyg)、菌液浓度、侵染时间、乙酰丁香酮(As)及羧苄青霉素(Car)等因素对剑麻遗传转化的影响。结果表明,剑麻最适遗传转化体系为：Hyg选择浓度为25 mg/L,OD600＝0.6左右的农杆菌菌液,侵染时间为10～15 min,As浓度为200 μmol/L,Car浓度为400 mg/L。     

农杆菌介导的宁麦13成熟胚遗传转化体系的构建

宁麦13是目前生产中应用面积较大的弱筋小麦品种,以此品种建立农杆菌介导的成熟胚遗传转化体系有助于对该品种的个别性状进行针对性改良。本研究利用分别携带不同质粒pCXK1301和pAt-MYB12u的农杆菌株系GV3101对宁麦13成熟胚愈伤组织进行转化,通过对预培养时间、共培养时间和干燥处理等参数的研究,建立了农杆菌介导的宁麦13成熟胚遗传转化体系。宁麦13成熟胚转化体系的条件为:利用预培养6d的宁麦13成熟胚愈伤组织作为转化受体,使用含pAtMYB12u质粒的农杆菌株系GV3101,侵染菌液浓度OD600=0.6,侵染时间60min,采用干燥共培养4～5d(23℃,暗培养),诱导恢复培养10d,分化培养每4week继代一次,分化培养8week(12h光周期,25℃,2 000lx)。试验侵染2 600个宁麦13愈伤组织,获得127株再生植株,经分子检测,其中9株证实为阳性转化植株。     

热研7-33-97袋装苗叶片愈伤组织诱导培养研究

为扩大橡胶树组织培养外植体来源和建立高效稳定的橡胶树叶片离体再生体系,以1年生巴西橡胶树品种热研7-33-97袋装苗叶片为材料,研究叶片的预处理、0.1%升汞不同消毒时间、离体叶片切取部位、3种激素(6-BA、NAA、2,4-D)不同浓度配比对愈伤组织诱导的影响,筛选愈伤组织诱导最适培养基。结果表明:用液体培养基MS+3mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L NAA对橡胶树袋装苗叶片进行预处理,可诱导出愈伤组织;用0.1%升汞对袋装苗叶片消毒15 min,其存活率达2.47%,为最佳消毒方法;用含主脉叶块和含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分进行培养所诱导的愈伤组织质地较坚实、呈黄绿色,为橡胶袋装苗叶片培养的最适宜外植体;橡胶袋装苗叶片最佳愈伤组织诱导培养基是MS+3 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D+0.2 mg/L NAA+4%蔗糖+3 g/L植物凝胶,用此培养基对含主脉叶块和含主脉出愈叶块未出愈伤组织部分进行培养,其出愈率分别达49.07%和42.22%。结论:大田1年生橡胶树品种热研7-33-97袋装苗叶片经预处理后选择含主脉叶块为外植体,可诱导出理想的愈伤组织。     

甘蔗胚性愈伤高效诱导系列研究Ⅰ.幼叶离体培养直接诱导胚性愈伤发生

以ROC22心叶为外植体,研究了取材部位、培养基蔗糖含量等因素对甘蔗胚性愈伤发生的影响,重点探讨了不同植物激素和生长调节剂组合的作用,建立了无需继代、直接诱导高质量甘蔗胚性愈伤发生的体系。结果表明:顶端生长点以上5~6 cm区段最内层3片心叶为最适外植体;MS+2,4-D 3.0 mg/L+Dicamba 1.0 mg/L+6-BA 0.1 mg/L+DA-6 6.0 mg/L+CSN 4.0 mg/L+蔗糖40 g/L为最佳培养基;经28 d暗培养,心叶无需继代即可分化成为胚性愈伤,诱导率可达42.67%。所得胚性愈伤质量高、分化强,可用于甘蔗遗传转化研究。     

抗生素对巴西橡胶树花药愈伤组织生长与分化的影响

将巴西橡胶树花药胚性愈伤组织接种到添加不同浓度的羧苄青霉素、头孢霉素和特泯丁3种抑制农杆菌生长的抗生素培养基上,结果表明：除500mg/L特泯丁抑制胚性愈伤组织生长但促进体胚发生,其它抗生素均为促进愈伤组织生长但抑制体胚发生。潮霉素、卡那霉素和巴龙霉素3种筛选抗生素均抑制愈伤组织生长和体胚发生,三者抑制能力顺序为潮霉素〉卡那霉素〉巴龙霉素,但潮霉素完全抑制了体胚发生,而巴龙霉素则与对照相似即对体胚发生几乎没有抑制作用。故特泯丁可以作为农杆菌介导巴西橡胶树花药愈伤组织遗传转化的抑菌抗生素,500mg／L使用浓度效果较好,卡那霉素作为筛选抗生素,50mg／L使用浓度效果较好。     

狗尾草胚性愈伤高效农杆菌转化体系的建立

狗尾草是研究C4光合作用的优秀模型,具有热带植物的典型特征,也可作为研究热带作物的重要模型,高效的转基因技术是模式植物广泛服务于科研的基础,目前狗尾草作为模式植物的研究在国外越来越热门,但在国内还没有被关注。但作为模式植物狗尾草现有的转化技术还不完善,转化周期有待缩短,转化效率需要进一步提高。本研究以狗尾草ME34品系不同阶段胚性愈伤为外植体进行农杆菌转化体系研究,通过实验大大提高了狗尾草的转化效率,缩短了转化周期,为狗尾草转基因研究提供了新的技术方法,新方法主要包括以下技术环节:高效胚性愈伤诱导技术,受体胚性愈伤的选择,适宜转化的农杆菌株系及培养条件,浸染和共培养条件与方法,抗性愈伤筛选条件,抗性愈伤成苗条件等。     

甘蔗遗传转化中不同阶段潮霉素抗性筛选

以新台糖22的胚性愈伤组织为材料,在诱导培养基、分化培养基及生根培养基中,分别添加不同浓度的潮霉素(Hyg)为选择性试剂,以确定甘蔗遗传转化时的最佳筛选浓度。结果表明:潮霉素对不同阶段培养基的敏感性存在一定差异,在甘蔗遗传转化时3种培养基的抗性筛选浓度分别以50、30、30mg/L为佳;在分化培养基内的毒性作用比在诱导培养基内更快、效果更好,故遗传转化时可直接将Hyg用于分化培养基进行抗性芽筛选试验。     

Factors Affecting Agrobacterium-Mediated Transformation Efficiency in Rice

Several important factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated rice transformation were studied with several predominant commercial indica and japonica rice cultivars. As far as indica rice callus was concerned, CC medium was the best and the quality of callus was improved with the addition of 1.0 to 2.0 mg/L ABA. It decreased the percentage of browning calli and improved the callus growing state by addition of a certain amount of sorbitol to the subculture medium. NB medium was the best for callus initiation of japonica rice, but the improvement in the quality of callus of japonica subspecies was not obvious by adding ABA. During the period of subculture, to a certain degree, increasing the sucrose concentration could improve the proportion of hygromycin resistant calli. Furthermore, the transformation efficiency would be higher by applying selection pressure in the selection stage, removing selection pressure during the plantlet differentiation period and applying selection pressure again during seedling hardening period. Besides, suitable combination of plant hormones was beneficial for callus differentiation. An efficient /Agrobacterium-mediated rice transformation system had been established for several rice cultivars and a lot of transgenic rice plants had been obtained.     

Factors Affecting Agrobacterium-Mediated Transformation Efficiency in Rice

Several important factors affecting the efficiency of Agrobacterium-mediated rice transformation were studied with several predominant commercial indica and japonica rice cultivars. As far as indica rice callus was concerned, CC medium was the best and the quality of callus was improved with the addition of 1.0 to 2.0 mg/L ABA. It decreased the percentage of browning calli and improved the callus growing state by addition of a certain amount of sorbitol to the subculture medium. NB medium was the best for callus initiation of japonica rice, but the improvement in the quality of callus of japonica subspecies was not obvious by adding ABA. During the period of subculture, to a certain degree, increasing the sucrose concentration could improve the proportion of hygromycin resistant calli. Furthermore, the transformation efficiency would be higher by applying selection pressure in the selection stage, removing selection pressure during the plantlet differentiation period and applying selection pressure again during seedling hardening period. Besides, suitable combination of plant hormones was beneficial for callus differentiation. An efficient Agrobacterium-mediated rice transformation system had been established for several rice cultivars and a lot of transgenic rice plants had been obtained.     

根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化体系的优化

以13种不同基因型的大豆为材料,研究了大豆外植体再生过程中不同大豆基因型对丛生芽数目的影响,选取优势基因型为受体材料,比较了在草丁膦和潮霉素筛选压力下外植体的再生情况,并确定其合适的筛选浓度,在对农杆菌介导的子叶节转化体系优化的基础上进行了大豆转化效率的研究。结果显示:在相同的芽诱导条件下,山宁14产生的丛生芽最多,更适合于大豆子叶节转化;与其它筛选剂相比,采用潮霉素的梯度筛选更有利于抗性苗的成活,其最适筛选浓度为8 mg.L-1;通过检测GUS基因的表达和分子鉴定证明外源的GUS基因已插入到转基因植株的基因组中,转化效率达到3.2%。     

抗生素对剑麻愈伤组织生长和植株再生的影响

研究卡那霉素、潮霉素、头孢霉素和羧苄青霉素对剑麻愈伤组织生长、不定芽分化及生根的影响,并确定抑制农杆菌生长的头孢霉素、羧苄青霉素的质量浓度。结果表明：潮霉素明显抑制剑麻愈伤组织生长和不定芽分化,卡那霉素次之,头孢霉素和羧苄青霉素相对较小;4种抗生素均能抑制剑麻生根,其抑制效果依次为头孢霉素＞卡那霉素＞羧苄青霉素＞潮霉素。头孢霉素和羧苄青霉素的浓度大于200 mg/L时,农杆菌生长完全被抑制。在筛选剑麻转化体时,卡那霉素和潮霉素的使用浓度分别以100、50 mg/L为宜,羧苄青霉素和头孢霉素的使用浓度均为200 mg/L。     

引进大豆种质遗传转化适用基因型的筛选

以引进种质"越黑"、"越褐"、Moshidou Gong503(半野生种)、日A、日B1、日B2的子叶节为受体材料,采用农杆菌介导法转入抗虫基因cryI,筛选组织培养适应性强,转化效率高的引进大豆种质。并对适宜遗传转化的基因型在萌发阶段和芽诱导阶段的适宜6-BA浓度进行筛选。结果表明:参试品种中"越褐"为适用于子叶节器官发生途径的基因型;萌发阶段添加浓度为0.1 mg.L-1的6-BA,可获得最佳轴根比,此时的无菌苗下胚轴粗壮无须根;萌发阶段和芽诱导阶段6-BA的最佳浓度分别为0.1和1.7 mg.L-1。     

小麦不同外植体的组织培养效果研究

良好的组织培养效果是提高植物基因转化效率的基础。以山东省近年来育成并大面积推广的10个优良品种（系）为材料，对这些品种的花药、幼穗、幼胚和成熟胚的组织培养效果进行研究，旨在筛选每一基因型最适合于组织培养的外植体类型，为应用基因工程技术进行小麦遗传改良提供基础材料。结果表明，禽伤诱导率和再生成苗率与基因型和外植体类型（花药、幼穗、幼胚和成熟胚）密切相关。8802在花药和成熟胚培养中表现突出，花药出愈率达119．5％，愈伤分化成苗率19．9％;烟农19的幼穗愈伤直接分化成苗率最高，这43．5％；8802、烟农19和潍麦8号三个基因型的幼胚培养效果差异不显著，其愈伤分化成苗率分别为26．3％、24．5％和24．8％。蔗糖浓度在3％～9％之间，对成熟胚的愈伤组织诱导率影响很小。高浓度蔗糖降低愈伤生长速度。在一定蔗糖浓度下，愈伤诱导率与2，4-D浓度密切相关，高浓度的2，4-D对愈伤组织再生不利。MS＋4mg／L2，4-D对于成熟胚的脱分化相对较好，MS和MS＋0．4mg／L NAA＋0．6mg／L KT作为成熟胚的愈伤组织再生培养基，对不同基因型具有一定的适用性。