芒果炭疽病菌多重巢式PCR检测体系建立及田间快速检测

以芒果炭疽病病原菌rDNA-ITS为靶标,建立并完善多重巢式PCR检测技术,结合常规形态学特征分析,对中国华南地区10个田间样品进行检测分析.结果表明:该技术特异性强、灵敏度达2fg/μL、重复性强、可操作性强,能同时检测、区分2种病原菌,能够应用于田间炭疽病害的检测工作,也是常规形态学鉴定的补充.利用该技术检测到田间芒果炭疽病存在胶孢、尖孢2种病原菌的复合侵染,该结果为后续开展有效防控措施提供理论指导和技术支撑.     

常规和巢式PCR对柑橘黄龙病菌的检测灵敏度比较

根据柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)病菌16SrDNA、16S/23S核糖体基因间隔区(ribosomal intergenic region,RIR)、核糖体蛋白β操纵子(β-operon)和外膜蛋白(out membrane protein,OMP)基因序列设计了8对引物,通过常规和巢式PCR方法对各引物的检测灵敏度进行了比较。结果表明,不同引物的检测灵敏度不同。对于上述任何基因,巢式PCR的灵敏度均比常规PCR至少高103倍;对于同一种基因,扩增短片段的引物比扩增长片段的引物灵敏度高或相当;在扩增产物大小相同时,用以扩增核糖体蛋白β操纵子基因的引物较其他三种稍高。对不同症状柑橘样品的检测进一步验证了该结果。因此,对于柑橘黄龙病的检测,可优先考虑使用巢式PCR方法,若使用常规PCR,则宜选用具有高灵敏度的扩增小片段引物。     

烟草青枯病菌巢式PCR检测方法的建立及应用

利用细菌16S-23S r DNA内源转录间隔区通用引物L1/L2扩增烟草青枯病菌基因组DNA,并对其扩增产物进行克隆测序,经与近缘种序列多重比对分析后,设计1对特异性引物Rs F/Rs R,用于包括烟草青枯病菌在内的15种不同细菌、5种真菌、3种卵菌基因组DNA的PCR扩增。结果表明:在优化的反应体系与程序条件下,该对引物只能从烟草青枯病菌中扩增出241 bp的特异片段,并通过序列测定验证了其准确性;将引物Rs F/Rs R与细菌通用引物L1/L2进行巢式PCR扩增后,其检测灵敏度在DNA水平上可达0.4 fg/μL,较常规PCR提高1 000倍,表明该对引物能有效地用于烟草组织及土壤中青枯病菌的检测。此结果对烟草青枯病的早期诊断、快速检测及病害流行学研究具有重要意义。     

甘蔗宿根矮化病巢式PCR检测体系

利用LG和Cxx两对引物,通过实验优化设计,建立了比较可靠的甘蔗宿根矮化病巢式PCR检测体系.     

基于PCR和巢式PCR技术的甘蔗黑穗病早期检测

为了探索甘蔗黑穗病早期检测的可能性,应用本实验室已建立的甘蔗黑穗病菌PCR和巢式PCR检测技术,对经人工接种甘蔗黑穗病菌冬孢子的植蔗叶片进行检测,并调查采样植株的黑穗病实际发生情况。结果表明,黑穗病实际发生率80％（16/20）,PCR检测阳性率35％（7/20）,巢式PCR检测阳性率70％（14/20）,PCR和巢式PCR检测为阳性的样品,其植株黑穗病发生率几乎为100％。这一结果表明了甘蔗黑穗病菌PCR和巢式PCR可用于甘蔗黑穗病早期检测,但巢式PCR检测结果与黑穗病的实际发生情况比较吻合,更适合于甘     

巢式PCR检测琯溪蜜柚黑斑病病原菌

利用特异性引物从琯溪蜜柚黑斑病菌基因组DNA中扩增出一条分子量为487 bp的特异性条带,准确地与疮痂病、炭疽病和黄斑病菌等蜜柚常发性真菌病害区分开.采用巢式PCR对该引物的检测灵敏度进行测定,结果显示,对于黑斑病菌基因组DNA,巢式PCR的检测灵敏度为100 fg/μL,灵敏度比常规PCR至少提高100倍;对于发病组织,巢式PCR可从病斑组织含量为100 μg的DNA样品中检测到黑斑病菌.采用巢式PCR检测技术,可从蜜柚的黑斑病显症组织和未显症组织特异性地检测到病原菌,且检出率分别为96.67％和90％.     

痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR检测

研究成功建立了痕量转基因油菜籽成分的半巢式PCR(Semi-nested PCR)检测方法，灵敏度比常规PCR提高了100倍。该方法通过改良CTAB法提取并纯化得到不同梯度浓度的DNA模板溶液。设计了4个外源基因的特异性半巢式PCR引物，以油菜籽磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(PEP)为内标准基因，对油菜籽混合样品中外源FMV35S启动子、GOX、BARSTAR和BARNASE基因进行了检测，灵敏度达到0.001%。     

应用单管巢式和半巢式PCR检测转基因玉米MON89034

根据MON89034玉米的5’端和3’端边界序列分别设计1组转化体特异性的巢式PCR引物,采用中途进退式PCR策略建立MON89034玉米的转化体特异性检测方法,扩增产物分别为491 bp和188 bp。以转基因玉米MON89034及8种其他转基因作物为材料,证明此方法对MON89034玉米具有高度特异性。灵敏度测试结果表明,此方法的相对检出限达到0.01%,绝对检出限为4个单倍体基因组拷贝数,比普通PCR提高了5倍。建立的单管巢式和半巢式PCR方法可准确、高效地检测转基因玉米MON89034及其产品。     

橡胶树毛色二孢叶斑病病原菌的鉴定及其生物学特性研究

近期在海南省三亚市的橡胶树种植区发现一种新的橡胶树叶斑病,利用组织分离法和单孢分离法获得纯化菌株HNSY003。通过形态学特征观察、rDNA-ITS和EF1-α序列分析及柯赫氏法则验证,确定该病原菌为假可可毛色二孢(Lasiodiplodia pseudotheobromae)。这是假可可毛二孢所致橡胶树叶斑病的首次发现。生物学特性测定结果表明,病菌最适生长条件为:温度32℃,pH 5,碳源为D-果糖,氮源为酵母浸膏。不同光照条件对菌丝生长影响不显著。     

进口大豆中菜豆晕疫病菌巢式PCR检测方法的建立

为实现对进口大豆样品中菜豆晕疫病菌的快速检测,本研究根据菜豆晕疫病菌的argK特异性序列设计引物52B/8F和24B/24F,建立了巢式PCR检测方法,并进行特异性和灵敏度验证。试验结果表明,利用此检测方法对多种参试菌株进行检测时,只有菜豆晕疫病菌呈阳性反应,而其他病菌不产生扩增反应;巢式PCR检测方法对菜豆晕疫病菌基因组DNA和菌悬液检测时,其灵敏度分别达到0.916×10-4ng/μL和2.4×103CFU/m L,比常规PCR灵敏度高1 000倍。在对100份进口大豆样品检测时,3份样品扩增到了特异性条带,测序分析结果证明3份大豆样品中携带的病菌确实为菜豆晕疫病菌。本研究所建立的巢式PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测时间短并且检测准确率高等特点,可用于口岸菜豆晕疫病菌的检测。     

培养条件及杀菌剂对玉米穗腐病菌可可毛色二孢生长的影响

可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）穗腐病是近年来发生在玉米上的一种新病害。本文研究了不同培养基、温度、pH、碳源和氮源对该病原菌生长的影响,并评价了 8 种杀菌剂对该病原菌的抑制效果。结果表明,25 ℃培养 1 d 后,可可毛色二孢在 PDA 和 MLPA 两种培养基上生长速度最快,菌落直径分别为 49.88 mm 和48.13 mm,显著大于其他处理（p<0.05）;最适合该病原菌生长的温度为 30 ℃,培养 1 d 后菌落直径为 61.88 mm,显著大于其他温度处理（p<0.05）;在 55 ℃处理 10 min 后的菌落不能继续生长;最适合该病原菌生长的 pH 为 6,25 ℃培养 1 d 后菌落直径可达到 75.00 mm,显著大于其他处理（p<0.05）;淀粉和硝酸钠分别为可可毛色二孢生长所需的最佳碳源和氮源,在上述两种培养基上培养 1 d 的菌落直径分别为 58.13 mm 和 37.13 mm,均显著大于其他处理（p<0.05）。咯菌腈、甲基硫菌灵和异菌脲对可可毛色二孢有较好的抑制效果,EC50 均小于 1 mg/L。本研究结果为深入了解可可毛色二孢玉米穗腐病的发生规律和制定有效防治策略提供依据。     

橡胶树新发茎杆溃疡病病原鉴定及其生物学特性测定

2014至2015年,对海南省橡胶树主栽区的病害普查中发现1种新的茎杆溃疡病。该病在海南省部分农场发生严重,为害中小龄胶树和开割树的茎杆,造成树皮隆起并呈褐色,严重时流出白色胶乳,对橡胶树的长势和产胶量造成重要影响。通过形态观察、rDNA-ITS序列比较和聚类分析结果表明,分离自不同地点的8株病原菌均为茄类镰刀菌(Fusarium solani)。菌株HHNBS01的生物学特性表明,CMA、PDA和Czapek培养基中,以蔗糖和硝酸钾为碳源和氮源,30℃,pH6为菌落生长最适条件,15℃,pH6,完全黑暗,D-木糖和草酸铵分别为碳源和氮源是产孢最适条件,30℃,pH7为分生孢子萌发最适条件,而菌丝和分生孢子的致死温度均为60℃10 min。     

新型腐植酸有机肥对马铃薯茎基腐病的防效

马铃薯茎基腐病是影响马铃薯生产的重要病害,目前尚未有效的综合防控措施.试验的目的是通过新型腐植酸肥料与同等养分配方化肥的田间比较试验,探讨新型腐植酸有机肥对马铃薯茎基腐病预防效果.结果表明,5～15 g壤动FT/100 kg种薯配合腐植酸肥料对马铃薯生长发育安全,在出苗率、苗高、单株根数、最大根长、芽长分别优于配方化肥...     

闽楠溃疡病病原鉴定及其生物学特性研究

闽楠（Phoebe bournei）,我国Ⅱ级保护濒危植物,是亚热带常绿阔叶林重要组成树种,而闽楠溃疡病的发生严重危害其开发利用。为明确闽楠溃疡病的致病菌,以便后续科学的指导病害防治,本文从福建省闽楠病枝中分离纯化菌株,通过致病性测定、形态学观测以及 rDNA-ITS、GAPDH、β-tubulin、Histone3 序列分析鉴定病原菌,并分析其生物学特性。结果显示：从闽楠病枝中分离出 4 种菌株,分别编号为 SS-01、SS-02、SS-03 和 SS-04,其中菌株 SS-03 致病菌为粉红粘帚霉（Clonostachys rosea Schroers, et al.=Gliocladium roseum Bainier）;该菌菌丝在 PDA+PBL 培养基（pH 6.0）上 25 ℃黑暗条件下生长最好;最适菌丝生长碳源为麦芽糖,可溶性淀粉有利于产孢;最适氮源为牛肉浸膏;产孢量在 PDA 培养基（pH 7.0）上 25 ℃全黑暗条件最高。空气相对湿度≥90%（pH 8.0）时孢子萌发率最高。高温高湿以及高郁闭度易于闽楠溃疡病发生,故在营林造林以及苗圃抚育时应注意通风透气,控制温湿度,防止病害发生。该研究结果为科学有效地指导闽楠溃疡病防治提供技术支持。     

估测木薯茎叶生物量的一数学模型

为构建木薯茎叶生物量的估测模型,调查了木薯上、中、下部的茎粗、株高、叶柄长等形态学指标与茎叶生物量的关系.结果表明,木薯茎叶生物量主要受下部茎粗和株高的综合影响,并且下部茎粗、株高与茎叶生物量的关系均为乘幂函数关系.通过模型拟合和择优得到木薯茎叶生物量的估测模型W=0.032 83d2.48 6h0.1824.经新的实测数据检验,理论值与实测值的相对误差率为4.46%,完全满足测量精度要求.     

青稞坚黑穗病LAMP快速检测技术的建立

由大麦坚黑粉菌(Ustilgo hordei)引起的坚黑穗病广泛分布于我国青稞主产区,病原侵染后形成病穗从而造成产量损失。基于前期初步建立的青稞黑穗病快速检测体系,通过对种子洗涤沉淀物的总基因组DNA进行提取,并进行环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测人工模拟及实际种子带菌情况,以期建立完善的青稞坚黑穗病快速检测技术。结果表明,裂解液快速提取法可以对样品总DNA进行有效提取,完善后的LAMP快速检测技术可以有效开展青稞种子携带大麦坚黑粉菌的检测。