伪狂犬病病毒囊膜糖蛋白的研究进展

伪狂犬病病毒是多种家畜和野生动物均可感染的疱疹病毒。近年来，对伪狂犬病病毒分子生物学的研究取得了很显著的进展，尤以PRV糖蛋白研究最深。本文对目前已发现的11种糖蛋白的基因定位、结构及功能进行了较详细的综述。     

狂犬病病毒糖蛋白信号肽序列分析

为比较不同狂犬病病毒株糖蛋白信号肽序列的差异,测定了2株固定毒(CVS、3aG株)及2株街毒(Sx、PB3)的糖蛋白核苷酸序列,并推导了氨基酸序列.DNAstar软件分析表明:2株街毒糖蛋白信号肽同源性为100％,2株固定毒株同源性为84.2％,街毒株与CVS、3aG的同源性分别为78.9％和73.7％;2株街毒的信号肽序列与NCBI收录的我国近年来分离的街毒株的序列完全相同;街毒株与常用疫苗株间的同源性介于68.4％ ～ 84.2％,疫苗株PV与SRV9、PV与ERA、PV与SAG同源性均为100％.对糖蛋白信号肽疏水区(-15位到-4位)的二级结构预测和疏水值计算显示,街毒株信号肽的二级结构和疏水值均与常用疫苗株和固定株存在明显差异;在N2A细胞上效价测定显示,2株街毒的效价明显低于2株固定毒.     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG^-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK^-／gI^-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoR V／StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRV。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRV,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

表达狂犬病病毒糖蛋白的重组伪狂犬病病毒gG-基因缺失转移载体的构建

以伪狂犬病毒TK-/gI-缺失疫苗株为亲本株提取病毒基因组DNA,克隆含gG基因的EcoRⅤ/StuⅠ片断,用限制性内切酶BamHⅠ和NdeⅠ缺失gG基因,构成重组质粒pIRⅤ。同时,分别将狂犬病病毒SRV9的株糖蛋白和绿色荧光蛋白克隆入载体pIRESneo,构建平行表达糖蛋白和绿色荧光蛋白表达盒。将表达盒插入到pIRⅤ,构建gG基因缺失转移载体,为下一步同源重组获得伪狂犬病毒奠定基础。     

猪源狂犬病病毒N和G基因的序列分析

通过对新分离的猪源狂犬病病毒GD-SH01株N基因和G基因进行序列分析,解析它们与其他狂犬病病毒N和G基因的差异.提取猪源狂犬病病毒GD-SH01株的总RNA,采用RT-PCR的方法扩增N基因和G基因,并与T载体连接,克隆至大肠埃希菌DH5α.测序后与国内外部分毒株的N基因和G基因进行核苷酸序列和氨基酸序列比对.与其他毒株相比,N基因核苷酸相似性为84.3%～98.0%;氨基酸相似性为92.5%～99.3%.G基因核苷酸相似性为80.4%～98.2%;氨基酸相似性为87.8%～99.6%.     

伪狂犬病病毒沪株gE基因序列测定与比较分析

建立了伪狂犬病病毒的PCR检测方法,并将沪株伪狂犬病病毒的gE基因扩增片段进行测序和比较分析.根据伪狂犬病病毒gE和gB基因序列设计两对引物,以伪狂犬病病毒SH株DNA和单纯疱疹病毒Ⅰ型为模板,产物连接到pMD18-T Vector.重组质粒测序后与闽A株序列比较,同源性为98%,与Genebank中已登录的伪狂犬病病毒gE基因序列进行blast比较,同源性在97%以上.gE基因序列比较保守,在疫苗应用及分子诊断方面均有较大的价值.     

猪瘟病毒新疆南疆野毒株E2基因序列分析及致病性研究

应用RT-PCR技术对新疆南疆两地的猪瘟阳性病料进行了扩增 ,并对扩增的产物进行了核苷酸序列测定.结果扩增的两株野毒的E2基因序列相同 ,与已知的中国C株E2基因相应序列比较,其同源性为82.8;,推导的氨基酸同源性为88.3;.用这两株野毒人工感染健康易感仔猪,观察其致病性,结果两株野毒引起的临床症状及剖检变化相似,均呈现比较典型的猪瘟病变.免疫酶组化显示,猪瘟病毒主要攻击脾脏、淋巴结等免疫器官,其次为肾脏、脑等器官.结果表明,NJKS、NJAKS两株野毒为中等毒力或偏强,能引起亚急性型猪瘟.     

猪伪狂犬病病毒新流行株主要糖蛋白的分子特征分析

【目的】进一步了解猪伪狂犬病毒新流行株的遗传特征。【方法】对从安徽某猪场分离的1株猪伪狂犬病病毒(PRV)AH株进行遗传进化分析及主要糖蛋白gB、gC、gD、gE的序列分析。【结果】PRV AH株与国内2011年以来的流行毒株非常相似,但与Bartha株及其他国外毒株遗传关系较远;国内流行毒株与Bartha株及其他国外毒株相比,其主要糖蛋白均存在明显的连续氨基酸的缺失和插入,且部分突变位点位于这些糖蛋白的重要功能区。【结论】从分子水平上解析了PRV新流行株与疫苗株Bartha株的遗传差异,为进一步深入研究Bartha株疫苗免疫失败的原因提供了理论依据。     

狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白融合基因原核质粒的构建与表达

试验将编码狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白融合基因克隆到原核表达载体pET-32a( )中,构建狂犬病病毒原核表达质粒。将该质粒转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达出约2.09×104D的狂犬病病毒糖/核融合基因编码的蛋白质。Western-blotting检测结果表明,该融合蛋白质具有免疫原性。     

猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD在谷氨酸棒杆菌中的表达及优化

为在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中进行猪伪狂犬病病毒糖蛋白gD(Glycoprotein gD of porcine pseudorabies virus)的可溶性表达,通过启动子、底盘菌株和发酵条件的优化,提高gD在C.glutamicum中的表达量,使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blot方法进行表达产物的分析与鉴定,用镍离子亲和层析柱纯化产物。SDS-PAGE和Western Blot分析结果表明,gD在谷氨酸棒杆菌表达系统获得正确表达,相对分子质量约4.5×10⁴,可与猪抗gD阳性血清特异性反应。摇瓶培养下最优发酵条件为诱导温度30℃,诱导时长24 h,优化后gD质量浓度可达到517 mg/L。     

狂犬病病毒G蛋白昆虫细胞表达及其生物信息学分析

利用RT-PCR方法从SRV9株细胞毒基因组RNA扩增G蛋白基因,然后将其克隆到p MD18-T载体上,将得到的重组克隆质粒SRV9G-p MD18T进行PCR和测序鉴定。结果表明:克隆的基因全长为1 609 bp,阅读框正确;将此SRV9株G基因亚克隆到供体质粒p Fast Bac Dual后获得了重组供体质粒SRV9G-p Fast Bac Dual;进而将重组供体质粒转化DH10Bac感受态细胞,经2次抗性、蓝白斑筛选及PCR分析后,获得重组穿梭质粒SRV9G-Bacmid;将其转染Sf9细胞48 h后,通过细胞形态学和重组杆状病毒负染电镜观察显示,杆状病毒转染成功;通过Western blot检测显示,Sf9细胞成功表达了SRV9 G蛋白。随后,利用Ex PASy服务器上的在线分析工具和生物信息学分析软件DNAStar对G蛋白的基本性质进行了分析。试验采用昆虫细胞Bac-toBac杆状病毒表达系统,成功表达出G蛋白,并对其进行了生物信息学分析,为蛋白纯化及狂犬病诊断试剂盒的进一步研制奠定了基础。     

狂犬病毒糖蛋白基因的重排及病毒的拯救

为了从分子水平研究狂犬病糖蛋白基因（G）从第4位重排至第1位后病毒的结构、功能及病毒致病性的变化,运用基因突变、反向遗传技术的原理与方法,将狂犬病毒（RV）糖蛋白基因从野生型的第4位（N-P-M-G-L）重排于第1位（G-N-P-M-L）,并成功地拯救已发生基因重排的狂犬病毒．     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆及序列分析

应用RT-PCR方法,以1株H5N1亚型禽流感病毒RNA为模板,扩增了NA全基因cDNA。将NA cDNA克隆于pMD18-T栽体,并对其进行了测序。测序结果表明：所克隆的NA基因全长为1416bp,编码区为1410个核苷酸,编码469个氨基酸。将其序列与5株H5N1亚型禽流感病毒NA基因序列进行比较,其核苷酸和氨基酸同源性均为96.6％～99．1％。NA的克隆和分子进化分析揭示了各毒株间的亲源关系。     

禽流感病毒 HA 基因在狂犬病毒中的表达

为了研究狂犬病毒作为载体表达外源基因的特性,将禽流感病毒 HA 基因插入狂犬病毒全基因组cDNA感染性克隆pHEP-3.0 G基因与L基因的假基因位点,再通过反向遗传技术,获得了携带流感病毒 HA 基因的嵌合狂犬病毒(HepFHA),并进行了病毒传代与 HA 基因表达的研究. 结果显示,重组病毒经BHK-21细胞传代10次,病毒表达稳定,但各代次常规红细胞凝集试验均为阴性; Western blotting检测到病毒表达产物中存在部分HA蛋白的表达,其相对分子质量为39 540,与HA裂解的HA1蛋白相对分子质量相吻合.     

狂犬病病毒核蛋白的原核表达及纯化

采用RT-PCR方法扩增出狂犬病病毒(RV)CVS株核蛋白(N)基因,并将目的基因亚克隆入原表达载体pET-28 a(+)中,经PCR、双酶切以及序列分析,结果表明:已成功构建了重组质粒.将重组质粒转化至大肠埃希氏菌Rossetta(DE3),在37℃,1 mmol/L IPTG条件下进行诱导表达.诱导产物经SDS-PAGE分析,在分子量约为54 KD附近出现较粗的目的带,与预期的目的蛋白分子量相符合.经表达条件优化,用1 mmol/LIPTG在37℃诱导表达5 h,表达量达到最高,Western-Blotting鉴定目的蛋白有较强的免疫原性.为狂犬病毒的N蛋白的新型疫苗的制备奠定了基础.     

狂犬病病毒HEP-Flury株N基因的修饰及原核表达

为了高效表达狂犬病病毒HEP-Flury的核蛋白,选取抗原决定簇富集区,利用生物信息学技术分析了狂犬病病毒HEP-Flury N蛋白的核苷酸序列.根据大肠埃希菌Escherichia coli对密码子的偏嗜性,首先对所选取的核苷酸序列进行修饰、引入酶切位点,然后定向克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-NP.将其转化表达宿主菌Escherichia coli BL21(DE3)pLysS,以IPTG诱导表达.表达产物经SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量34 000处有1条特异的蛋白带,与预期大小一致.Western-blotting检测结果显示,该蛋白可被鼠抗His单克隆抗体及犬抗RV多克隆抗体特异识别,表明所表达的N蛋白具有良好的免疫原性.     

应用PCR检测猪伪狂犬病毒野毒的研究

[目的]对猪伪狂犬病毒野毒进行检测.[方法]根据已发表的猪伪狂犬病病毒gE基因核苷酸序列,设计合成1对引物,扩增片段长度为276 bp,优化PCR反应条件,建立检测PRV野毒的PCR方法.[结果]利用建立的PCR方法检测疑似PRV野毒感染的临床送检组织病料34份,阳性样品18份,阳性率达52.94％（18/34）,选取6份阳性病料PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行序列鉴定,测序结果表明均为PRV gE基因特异性序列.[结论]该方法敏感、特异、可靠,可用于PRV野毒感染的快速诊断和流行病学调查.     

检测犬源狂犬病毒中和抗体ELISA方法的建立

为了有效监测犬免疫狂犬病疫苗后的保护效力,以狂犬病毒(Rabies virus,RV)糖蛋白的主要优势抗原表位区G3蛋白(RV G3)作为包被抗原,建立了一种检测狂犬病毒中和抗体效价的间接ELISA方法.通过优化反应条件,确定抗原最佳包被量为8 mg/L,血清的最佳稀释度为1∶100,酶标二抗的稀释度为1∶3 000.特异性试验表明,该抗原不与犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒阳性血清发生交叉反应;批内和批间重复性试验的平均变异系数都小于10%;敏感性达1∶1 280.此方法检测134份血清样品的结果与美国SYNBIOTICS试剂盒相比,总符合率达95.6%.