镰形扇头蜱金属蛋白酶基因全长的克隆和序列分析

本研究从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST序列中筛选了一个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。cDNA全长1 566 bp,编码区为23 bp～1 456 bp,编码478个氨基酸残基,该蛋白的预测分子量约为55 Ku,等电点为8.87。RT-PCR分析表明,该基因在镰形扇头蜱未吸血成蜱、半饱血成蜱以及唾液腺、肠中表达。     

镰形扇头蜱-新基因的分离、克隆、表达和抗蜱免疫保护作用

目的分离、克隆镰形扇头蜱一新基因。方法本实验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的100个EST（Expressed Sequence Tag）序列中选取一个带有polyA尾的序列，经5’RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）得到此序列的全长基因，命名为RhHp2，基因全长1002bp，开放阅读框（ORF）从31bp至879bp，共848bp，编码282个氨基酸。经序列比较，RhHp2基因与其它序列在核苷酸水平上基本无同源性，但在氨基酸水平上与其它物种同源性最高可达50．81％。RhHp2基因连接于PET32a（＋）载体后克隆于表达菌B121，1mM IPTG诱导表达，产生分子量约为55kD的融合重组蛋白，并以不溶性包涵体形式存在。经纯化和体外复性的重组蛋白三次免疫新西兰兔后，将镰形扇头蜱未吸血成蜱和若蜱接种于此免疫兔耳，并对接种48h后的蜱上体数、蜱的饱血数量、饱血时间、饱血重量等进行记录。结果发现蜱的吸血行为受到一定影响，若蜱在48h的减虫率（上体数减少）为58％，在整个吸血过程中的死亡数增加，成蜱的饱血体重显著降低。结论此结果表明RhHp2基因的重组表达产物具有一定的免疫保护作用。     

镰形扇头蜱P0基因的克隆表达及初步鉴定

P0分子是一种核糖体蛋白,具有抗蜱免疫作用。本文采用RACE技术从镰形扇头蜱(Rhipicephalus haemaphysaloides)中获得了P0全长基因。通过对P0全长基因序列进行分析发现,P0全长基因为1 118 bp,具有一个编码319个氨基酸的开放阅读框,没有信号肽序列。推测P0的蛋白大小约为35 ku。P0与其他蜱种具有很高的同源性,与微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus)和长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)的P0基因同源性分别为94%和87%。编码区克隆到表达载体p GEX-4T-1中,转化表达宿主菌BL21,可表达出分子量约为60 ku的重组融合蛋白。表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。表达产物经GST树脂纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。抗P0重组蛋白鼠血清可以识别蜱体内的P0蛋白,大小在35 ku。研究结果将为镰形扇头蜱新型防治技术研究提供基础。     

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅱ基因的克隆及其分布

本试验从镰形扇头蜱半饱血雌蜱唾液腺cDNA文库的EST中筛选了1个含polyA尾的基因序列,经5′-RACE方法得到该基因全长序列。经同源性比较,该基因预测的氨基酸序列与长角血蜱肌钙蛋白（GI：14041807）的同源性为84.47%,肌动蛋白结合位点位于147～167氨基酸处,且与长角血蜱肌钙蛋白肌动蛋白结合位点完全相同,表明该基因是镰形扇头蜱肌钙蛋白基因。以镰形扇头蜱基因组DNA为模板扩增到编码肌钙蛋白的基因组序列,序列分析表明该序列不含内含子。RT-PCR分析表明该基因在镰形扇头蜱的卵及其幼蜱、若蜱、成蜱的壳、唾液腺和肠均有表达。     

镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆镰形扇头蜱肌钙蛋白Ⅰ(TnI)的cDNA并进行表达及鉴定。方法用RT-PCR方法从镰形扇头蜱总RNA中克隆编码肌钙蛋白Ⅰ的cDNA片段,将该cDNA连接到pET-32a( )表达载体,并转入宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Western blot分析。结果获得镰形扇头蜱的eDNA,并在大肠杆菌中以包含体的形式高效表达,Westem blot分析表明,抗TnI重组蛋白兔血清可以识别蜱体内的TnI,并在22 kDa和36 kDa之间有两条带。结论蜱体内可能同时存在两个大小不等的TnI,为进一步的研究打下基础。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生.蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物.蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等[1],对动物和人类的健康造成严重危害.肌动蛋白(Actin)是一类进化保守,在多数物种中存在的蛋白质超家族,其基因序列高度同源[2].Actin是细胞组成的基本单位,参与多种生理过程,如细胞运动、胞内运输、细胞质流动、内吞作用等[3].Actin基因及蛋白同时也是多数实验中的首选内参,对完善实验数据、数据分析和实验过程的逻辑性起到重要作用.目前少见对镰形扇头蜱成蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Actin基因的报道.据此,我们克隆了三种硬蜱的Actin基因,进行了序列分析.     

镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP基因的克隆和重组表达

为了进行抗蜱及蜱传病疫苗的研究,本试验根据GenBank中的镰形扇头蜱组胺结合蛋白(Rhipicephalus haemaphysaloideshistamine bindingprotein,RhHBP)基因cDNA序列,设计一对特异性引物(内含EcoRI/XhoI酶切位点),经RT-PCR扩增了镰形扇头蜱组胺结合蛋白RhHBP的cD-NA,大小为603 bp,将其克隆到pGEM-Teasy中并测序。在去除编码RhHBP信号肽的核苷酸序列后,将其亚克隆到pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1-RhHBP,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21,经终浓度为1 mmol/L IPTG诱导其表达,表达的融合蛋白大小为49 ku,以包涵体的形式存在。Western Blot分析表明,该蛋白具有良好的免疫原性。     

镰形扇头蜱巨噬细胞移动抑制因子的克隆、表达及酶活性分析

为了探究镰形扇头蜱巨噬细胞移动抑制因子(Rhipicephalus haemaphysaloides macrophage migration inhibitory factor, RhMIF)基因的功能，试验采用RT-PCR方法对RhMIF基因开放阅读框进行扩增，运用大肠杆菌表达体系对RhMIF蛋白进行体外重组表达，随后对纯化后的RhMIF重组蛋白进行互变异构酶活性分析。结果表明：RhMIF基因开放阅读框大小为351 bp,编码116个氨基酸；RhMIF重组蛋白在大肠杆菌上清液中成功表达，大小为17.4 ku; RhMIF重组蛋白具有互变异构酶活性。说明本试验通过大肠杆菌表达体系成功表达了具有酶活性的RhMIF重组蛋白。     

镰形扇头蜱、亚洲璃眼蜱和血红扇头蜱Aclin基因的克隆和序列分析

蜱,隶属节肢动物门蛛形纲蜱螨目,寄生于动物体表,以吸食动物血液为生。蜱广泛分布于世界各地,侵袭哺乳动物、爬行动物、鸟类,乃至两栖类等多种动物。蜱和其所携带的病原微生物,如螺旋体、巴贝西虫、贝纳柯克斯体等,对动物和人类的健康造成严重危害。     

长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的原核表达

根据GenBank中的长角血蜱丝氨酸蛋白酶抑制荆(Haemaphysalislongicornis serine proteinase inhibitor-2,HLS2)基因序列设计特异性引物,以长角血蜱饥饿成蜱总RNA为模板,经RT-PCR扩增出1164 bp的HLS2DNA片段.将其与pET-30a载体连接,构建pET-30a-HLS2表达载体,转化JM109大肠杆菌,筛选阳性克隆,经双酶切鉴定及测序分析后转化到E.coli BL21(DE3)表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳分析.优化表达条件后纯化融合蛋白,用Western blotting鉴定其抗原性.结果表明,获得的HLS2 DNA片段与GenBank中的HLS2(序列号AB162827)序列的同源性为98%.构建的pET-30a-HLS2表达载体在大肠杆菌中表达了约为47 000的HLS2融合蛋白,主要以包涵体形式存在,IPTG终浓度为1.0 mmol/L、28℃诱导7 h后融合蛋白的表达量最高.Western blotting显示该融合蛋白可与兔抗长角血蜱阳性血清反应.     

应用镰形扇头蜱及巴贝斯虫病水牛的染虫血感染黄牛试验

从非流行区购进无蜱寄生的健康黄牛５头与水牛犊１头，其中３头成年黄牛（２～８岁）在畜舍内用从流行区水牛身上采得的镰形扇头蜱Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｏｉｄｅｓ成虫，置于牛耳壳内叮咬；１头运至流行区放牧，让蜱上身叮咬；１头黄牛犊（１０年龄）去蜱后２周，用液氮保存的患病水牛染虫血４ｍｌ（４×１０ ８个虫体）皮下注射；另一头去蜱水牛犊亦同时注射相同剂量的染虫血，作为对照。５头黄牛在试验期间其体温、精神、食欲正常，未出现任何临床症状，感染后１０～１２ｄ外周血液中出现少量不典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率在０．１％以下，持续３～５６消失；对照牛则体温升高（３９．８～４１．１℃），出现贫血、黄疸等症状，红细胞压积（ＰＣＶ）降至２６％，外周血液中出现典型的牛巴贝斯虫，红细胞染虫率（ＰＰＥ）高达１２％。对采用蜱叮咬及注射来自病水牛的染虫血为何不能使黄牛感染发病，文中进行了讨论。     

马泰勒虫新疆株EMA2基因的克隆及原核表达

裂殖子表面抗原蛋白家族因其高抗原保守性常作为马泰勒虫ELISA检测方法的基质。本研究根据马泰勒虫EMA2基因序列合成引物,以马泰勒虫新疆株DNA为模板,扩增获得目的基因,将其连接至pEASY-E1载体构建重组质粒pEASY-E-TE,并转化至大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达重组EMA2蛋白并鉴定。结果显示:PCR扩增获得了约819bp特异性DNA片段,构建了pEASY-E-TE重组质粒,成功诱导表达了35kDa的可溶性目的蛋白;经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白rEMA2具有良好的抗原性。本试验克隆表达的重组蛋白rEMA2可为ELISA方法的建立及后期研究提供靶基因材料。     

禽网状内皮组织增生症病毒p30蛋白的表达及检测

根据禽网状内皮组织增生症病毒SNV株的前病毒基因组cDNA序列设计并合成1对引物,以pPB101质粒为模板,通过PCR扩增获得该病毒p30基因片段。将PCR产物克隆入表达载体pCold-HF中,构建的原核表达质粒pCold-p30转化BL21（DE3）菌,经IPTG诱导,p30蛋白呈现可溶性表达。用表达产物免疫6周龄BALB/c小鼠,制备p30抗体,经Westernblot和间接免疫荧光法检测,结果发现,原核表达的SNV株p30蛋白具有良好的免疫原性。     

微小隐孢子虫抗原CTL细胞表位预测及多表位基因的原核表达

应用多个服务器对微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）候选疫苗抗原的氨基酸序列进行分析,预测可能存在的CD8＋细胞毒性T细胞（CD8＋cytotoxic T lymphocyte,CD8＋CTL）表位。从6种常见的免疫效果较好的候选疫苗抗原基因中选出10个分值较高的表位基因串联在一起,形成一条多表位基因,进行人工合成,表位之间用柔性氨基酸GGGGS或GPGPG链接,命名为CpCTL10。将该多表位基因重组入高效融合表达载体pET-28a（＋）,获得重组质粒pET-28a（＋）-CpCTL10,转化大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达,表达产物进行SDS—PAGE、Western blot分析。结果显示,CpCTL10基因在大肠杆菌中主要以包涵体形式高效表达,表达的重组蛋白占菌体蛋白总量的55．3％,纯化的重组蛋白纯度达75．1％。Western blot分析显示表达产物能与感染隐孢子虫的鼠阳性血清发生特异性反应,表明表达的重组蛋白具有较好的抗原性,为多抗原多表位疫苗的研制打下某础．     

编码日本血吸虫CIAPIN1 cDNA的克隆及其重组蛋白的原核表达

本研究利用生物信息学并结合分子生物学实验对日本血吸虫细胞因子诱导凋亡因子CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor 1）基因进行了初步研究。研究表明日本血吸虫存在CIAPIN1同源基因,将其命名为SjCIAPIN1,SjCIAPIN1基因已知cDNA长1143 bp,包括完整的CDS,编码276个氨基酸,预测分子量为30.55863 kDa。通过原核表达系统对该蛋白进行了重组表达和纯化,并制备了多克隆抗体制备。Western blot分析表明,本研究制备的多克隆抗体能与SjCIAPIN1重组蛋白特异识别。     

编码日本血吸虫Akt蛋白的cDNA克隆及原核表达

本研究利用生物信息学分析日本血吸虫编码Akt蛋白的cDNA并对编码该蛋白的cDNA进行了克隆和原核表达。生物信息学分析表明日本血吸虫存在两个Akt蛋白。利用PCR将其中一个Akt蛋白催化功能域的编码cDNA进行了克隆,并利用原核表达系统对此蛋白片段进行诱导表达并进行了重组蛋白的纯化,将重组蛋白免疫新西兰大白兔制备了多克隆抗体。Western blot分析表明,该抗体能被日本血吸虫Akt重组蛋白特异性识别。本研究为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

隐孢子虫P23基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

将隐孢子虫鼠基因型（Cryptosporidium mouse genotype）P23基因亚克隆到pGEX-4T-1载体中,并用大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌诱导表达。以纯化的rP23为诊断抗原,建立隐孢子虫间接ELISA检测方法,观察其敏感性、特异性和重复性,并对临床血清样品进行检测。结果隐孢子虫鼠基因型P23基因在大肠杆菌中获得了高效表达,Western blot检测显示rP23能被隐孢子虫感染兔血清识别。以纯化rP23为诊断抗原,成功地建立了检测兔隐孢子虫病的间接ELISA技术。对23份临床血清检测结果显示,该方法检出率高于Sheather＇s蔗糖漂浮法、套式PCR法。本研究结果为研制兔隐孢子虫病诊断试剂盒打下了基础。     

大肠杆菌热敏肠毒素B亚基的原核表达及生物学活性分析

从大肠杆菌K88（LT＋,ST＋）菌株中扩增热敏肠毒素B亚基基因（ltb）,得到454 bp片段,克隆至pMD18-T载体后,与pET32a（＋）定向连接,并转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG 30℃诱导表达重组LTB蛋白。SDS-PAGE显示,重组蛋白分子量约为34 kDa,超声波裂解后,表达产物主要以包涵体形式存在。经鉴定,纯化复性后的LTB蛋白保留部分与GM1结合的生物学活性。