淇河鲫肌肉生长抑制素基因的克隆与表达

肌肉生长抑制素(MSTN)是动物肌肉发育和生长过程中的负调控因子。为了明确淇河鲫MSTN基因序列及其在肌肉生长发育中的调控功能,本研究利用RACE方法克隆淇河鲫MSTN全长c DNA序列,q RT-PCR分析其在不同组织和胚胎发育阶段的表达情况。结果显示,淇河鲫MSTN c DNA序列全长2094 bp(no.KC851952.1),包含86 bp 5′非编码区、880 bp 3′非编码区和1128 bp开放阅读框,编码375个氨基酸残基,前22个氨基酸残基为信号肽,34~256位氨基酸残基为TGF-β前肽域,281~375是TGF-β结构域,具蛋白酶水解位点RIRR和C端生物活性区的9个保守半胱氨酸残基。蛋白同源分析发现淇河鲫MSTN与鲤形目鱼类相似性较高,与哺乳动物和鸟类的相似性最低。系统进化分析显示,淇河鲫MSTN与鲫、鲤、鳡等鲤科鱼类亲缘关系较近。实时定量PCR分析表明,淇河鲫MSTN基因在各个组织中均有表达,脑中表达量最高,其次为肌肉和肝脏,肠道表达量最低。淇河鲫胚胎发育的各阶段MSTN基因均有表达,受精卵表达量最高,其次为囊胚期,神经胚期表达量最低。推测MSTN与淇河鲫肌肉发育生长具有一定的相关性,可能参与"双背鲫"特征的形成。     

瘤背石磺肌肉生长抑制素基因的克隆及组织表达分析

为探究石磺由海洋向陆地进化过程中肌肉生长和发育的分子机制,实验以石磺科贝类转录组数据为基础,采用RACE方法从瘤背石磺肌肉中首次克隆到MSTN cDNA的全长并做了相应的组织表达分析。结果显示,瘤背石磺MSTN基因cDNA全长2667 bp,包括1650 bp的开放阅读框,374 bp的5′端非翻译区,643 bp的3'端非翻译区,共编码549个氨基酸。预测该基因编码的蛋白质原子总量为8776,分子式为C2774H4331N783O862S26,分子质量约为63.27 ku,理论等电点为6.02,信号肽预测结果显示,N端具有21个氨基酸长度的信号肽。瘤背石磺MSTN具有MSTN的共同特征,包括蛋白酶水解位点RSRR和C端多肽生物活性区以及9个保守的半胱氨酸残基。通过进化树分析,瘤背石磺MSTN与加州海兔MSTN的亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,MSTN基因在各个组织中均有表达;含肌纤维组织中的表达量低于内脏器官的表达量,在肝胰腺中的表达量最高,腹足表达量最低。MSTN基因一级结构具有很高的保守性,说明该基因在进化上的限制性和功能的重要性;同时该基因在石磺非肌肉组织中表达,表明该基因不仅有抑制肌肉生长的作用,还参与其他生命活动的调节。     

鳡肌肉生长抑制素(MSTN)基因的克隆及其组织特异性表达分析

以鳡肌肉总RNA为模板,采用RTPCR和RACE的方法,获得了鳡肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因的3个重叠片段,测序后拼接得到2 177 bp全长cDNA序列,其包含了5′端非翻译区的89个核苷酸和3′端非翻译区1 052个核苷酸以及1 125个核苷酸的开放性阅读框,翻译编码375个氨基酸,其中前22个氨基酸为鳡MSTN的信号肽。鳡MSTN具有MSTN的共同特征,有蛋白酶水解位点RIRR和在C端生物活性区含9个保守的半胱氨酸残基。核苷酸和氨基酸同源性分析发现鳡MSTN与厚颌鲂、草鱼和鲤等鲤形目鱼类的同源性较高,与鲈形目的同源性较低,与哺乳动物和鸟类的同源性最低;系统发育分析表明鳡MSTN与厚颌鲂亲缘关系最近。 半定量RT-PCR分析表明,该基因在肌肉和脑中表达量最高,在心肌中也有较高表达,在肝脏、肠、鳃和肾等组织中未见明显表达,此结果表明鳡MSTN基因除对肌肉生长发育有调控作用以外,可能还有其他功能。     

牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑制素(MSTN)基因.经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸.5'侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3'侧翼区含有加尾信号.通过同源分析,牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支.RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控.     

肌肉生长抑制素(myostatin MSTN)基因的研究进展

本文综述了肌肉生长抑制素(myostatinMSTN)基因的家族成员、功能、结构、作用机制、同源性、定位、部分位点及表达,并对MSTN基因的研究前景进行了展望。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变。存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709。统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05)。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变.存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709.统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05).     

缩骨鲫MSTN基因的克隆与组织表达分析

采用同源克隆、生物信息学方法及荧光定量PCR(Real-time PCR)对缩骨鲫(Carassius auratus sogu var.)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因进行克隆,分析和组织表达状况研究。结果显示:缩骨鲫基因组MSTN基因全长4 737 bp,含有两个内含子和三个外显子;编码区长度为1 128 bp,编码375个氨基酸,包括信号肽(1aa~23aa),TGF-β前肽保守区域(34aa~256aa),TGF-β功能区(281aa~375aa),保守的RXXR蛋白酶酶切位点以及C-端活性区域9个保守的半胱氨酸残基,这与其他物种MSTN相似。此外,缩骨鲫与鲫鱼(Carassius auratus)的MSTN氨基酸序列同源性最高,达到96.1%。以β-actin为内参基因,荧光定量PCR分析表明,MSTN在肌肉中表达量最高;脑、眼、心脏中次之;在肝胰脏、卵巢、肠和肾脏中微量表达。     

大口黑鲈肌肉生长抑制素基因单核苷酸多态性位点的筛选及其与生长性状关联性分析

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术对大口黑鲈肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因全序列进行了SNPs位点筛选和分型,共筛选到2个单核苷酸多态性(SNPs)位点(C-1453T和T+33C),其中C-1453T位于启动子E8 box和Octamer(＋)调控元件之间的区域,T+33C的突变位于第一外显子区域,属于同义突变,氨基酸没有发生变化;利用一般线性模型分析单标记位点与大口黑鲈生长性状(体重、体长、体高、体宽和眼间距)相关性,均未达到显著水平(P>0.05)。将2个SNPs位点不同基因型组合成6种双倍型(去掉频率小于3%的组合),关联分析表明,双倍型D2在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均高于其它双倍型,而双倍型D5在体重、体长、体高、体宽和眼间距的均值均低于其它双倍型,双倍型D2与D5之间在5个主要生长性状均存在差异显著(P＜0.05),推测双倍型D2对生长性状起正相关,而双倍型D5与大口黑鲈的生长性状呈负相关,因此推断MSTN基因突变位点双倍型D2与D5可作为大口黑鲈生长性状的两个标记位点,用其分子标记位点来辅助大口黑鲈育种工作以期加快育种进程。     

ENU诱变草鱼家系生长特性及肌肉生长抑制素基因SNP筛选的研究

经过175 d养殖,对4个N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变草鱼家系进行生长对比,采用显著性比较,偏相关分析和因子分析统计方法对草鱼体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析,进而运用双向测序法对MSTN1、MSTN2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示,家系4的生长速度明显大于家系3,家系4的8个性状明显大于其他3个家系;家系1中体长、尾柄长、体厚与体质量密切相关,家系2中体长、头长、体厚与体质量密切相关,家系3中全长、体长、尾柄高与体质量密切相关,家系4中全长、体长、体厚与体质量密切相关。由此可知,家系4和家系3具有明显的生长差异。对于MSTN1基因,家系3在465位点C/G、467位点G/A,家系4在465位点C/G均发生错义突变;对于MSTN2基因,家系3和4在912位点C/T均发生同义突变,家系3在1027位点G/A、家系4在366位点A/G均产生错义突变,位于非编码区1390位点A/T和1401位点G/A在两个家系均发现SNP位点。试验结果表明,MSTN1、MSTN2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼的生长性状存在紧密联系。     

泥鳅不同组织同工酶的特异性表达分析

应用垂直平板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳方法研究了泥鳅成体的心脏、肝胰脏、肾脏、鳃、肌肉5种组织中酯酶、过氧化物酶、过氧化氢酶同工酶的表达情况。试验结果表明,泥鳅3种同工酶在肝胰脏中表达活性较高。酯酶同工酶在5种组织中均大量存在,且条带较多;过氧化物酶在肾脏中表达较强,肌肉中表达最弱;过氧化氢酶在鳃、肌肉组织中表达不强,且条带较少,不利于分析,但其表达差异性明显。     

草鱼HSP70基因cDNA部分序列克隆及其组织表达差异

根据鲤热休克蛋白70(Heat shock protein,HSP70)序列(AY120894)设计并合成一对引物,以草鱼(Cteno-pharyngodon idella)肝胰脏组织总RNA为模板,RT-PCR扩增获得草鱼HSP70基因cDNA部分序列,并进行了组织表达差异性研究。结果显示:所获为序列为480 bp,获得GeneBank登陆号为FJ483832。序列测序结果显示,HSP70扩增序列与鲤、斑马鱼、鲋的同源性为:93%、91%、93%。另外,所获序列HSP70在草鱼脂肪、肌肉、肠、脑、粘液、性腺、鳔、肝胰脏、心脏、脾脏、鳃、鳍12个组织的表达存在差异,HSP70在草鱼这12个组织中均检测到表达,其中在鳍中表达最高,极显著高于其他组织(P<0.01);在鳔中表达次之,且与脑、心脏、性腺中表达差异不显著;在粘液中表达最低。     

哲罗鲑胰岛素样生长因子－I（IGF－I）cDNA 分子克隆、序列分析及组织表达

采用逆转录聚合酶链式反应（RT－PCR）方法,从哲罗鲑（Hucho taimen）肝脏的总 RNA 中扩增出胰岛素样生长因子－I（IGF－I）的 cDNA 开放阅读框（Open reading frame, ORF）序列,运用软件对其进行生物信息学分析,并利用荧光实时定量 PCR 技术检测了哲罗鲑成鱼不同组织中 IGF－I mRNA 的表达情况。结果显示, IGF－I 基因的 cD－NA 开放阅读框为573 bp,编码190个氨基酸,蛋白质等电点为9．21,氨基酸结构由信号肽、 B、 C、 A、 D 结构域及 E 肽组成;氨基酸序列与其他鲑科鱼类具有较高的同源性,其中与北极红点鲑的 IGF－I 同源性最高（99．2％）;组织表达分析显示,哲罗鲑 IGF－I mRNA 在肝脏中表达量最高,在鳃、前肠中次之,在脑、头肾、脾、心、胃和肌肉等组织中的表达量较低。     

小体鲟AR基因克隆、序列分析及其组织mRNA表达

采用RT-PCR 和RACE技术, 克隆了小体鲟(Acipenser ruthenus)雄激素受体(AR)基因cDNA全长序列, 应用real-time qPCR法对雌、雄个体不同组织中AR mRNA 的表达进行检测。序列分析表明, AR基因cDNA全长为2 953 bp, 包括5′端68 bp的非编码区(untranslation region, UTR), 2 528 bp的开放阅读框ORF(open reading frame)和3′端327 bp的非编码区(不包括ploy A 的尾巴)。AR前体蛋白由843个氨基酸组成, 理论分子质量为94.24 kD。同源比较结果表明, 小体鲟AR氨基酸序列与其他鱼类的AR氨基酸序列同源性较高, 与杂交鲟(A. ruthenus × Huso huso)、西伯利亚鲟(A. baerii)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和日本鳗鲡(Anguilla japonica)的雄激素受体同源性分别为99%、98%、83%和83%。real-time qPCR分析小体鲟雌雄个体不同组织中的表达结果显示, AR基因在雌雄个体中相对表达基本相同, 都是在性腺、肌肉和肾中高量表达, 而在其他组织中少量表达。AR基因在小体鲟体内广泛表达, 表明该基因可能对其生长和繁殖有重要作用。

     

泥鳅深加工现状与发展展望

对泥鳅深加工的研究现状进行综述,同时对泥鳅产业发展过程中存在的问题进行探讨,并对加工业发展前景进行展望,旨在为泥鳅深加工的相关研究提供参考。     

鳜UCP1,2基因结构、序列分析及组织表达

从分子水平上探讨了鳜解偶联蛋白1、2 (UCP1, 2)基因结构、组织表达水平及与产热、脂肪代谢等生理机能的关系。通过与脊椎动物UCP1、UCP2基因序列进行比对,设计简并引物与特异引物进行PCR和RACE扩增、测序、拼接序列,获得UCP1、UCP2的基因组序列和内含子/外显子结构。基因组步行法克隆鳜肝脏UCP1、UCP2 基因5′侧翼序列。应用半定量RT-PCR的方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在其指数期增长的范围内得到鳜不同组织UCP1、UCP2的相对表达水平。结果表明,UCP1基因组全序列为3 146 bp, 5′侧翼调控区为1 333 bp,含有5个内含子和6个外显子,开放阅读框(ORF)长942 bp,编码一个大小为313个氨基酸的蛋白质。UCP2基因组全序列为2 890 bp, 5′侧翼调控区为1 800 bp,含有7个内含子和8个外显子,ORF长939 bp,编码一个大小为312个氨基酸的蛋白质。UCP1、UCP2间隔外显子的内含子皆符合“GT-AG”规则,内含子的数目与哺乳动物一致。系统进化分析表明,鳜UCP1、UCP2氨基酸序列分别与鱼类UCP1、UCP2氨基酸序列聚为一支,且与UCP3、UCP4、UCP5分支区分明显。鳜UCP1、UCP2基因不同组织表达水平的高低可能与鳜本身的生态习性及各器官在产热、脂质代谢中的作用相关,但明确的分子机制尚待进一步研究。     

对苯二胺对泥鳅酯酶同工酶谱的影响

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法,在水温23～25℃条件下,研究了对苯二胺对泥鳅(体质量25.20～28.06g)4种组织及血清中酯酶同工酶表达的影响。试验结果表明,4种组织及血清酯酶同工酶的表达差异性明显,活性强弱依次为:肝胰脏﹥脾脏﹥血清﹥心脏﹥鳃。经不同剂量对苯二胺处理后,未发现剂量梯度与酯酶同工酶表达的正相关变化。在不同时间处理条件下,组织及血清酯酶表达先强后弱,72h达到最弱,96h略有增强,表现了明显的差异性和应激性。     

牙鲆肌肉生长抑素(MSTN)基因克隆

采用同源克隆及基因组步移的方法,分离克隆了牙鲆肌肉生长抑素（MSTN）基因。经过序列分析及cDNA验证,牙鲆MSTN基因具有3个外显子和2个内含子,编码377个氨基酸。5`侧翼区含有8个TATA框,一个CAAT框,6个E框;3`侧翼区含有加尾信号。通过同源分析,牙鲆MSTN C末端含有9个保守半胱氨酸残基和一个RVRR蛋白酶酶切位点;通过进化树分析,牙鲆MSTN与鱼类MSTN基因聚为一支。RT-PCR分析表明,牙鲆MSTN在胚胎发育中不表达或表达量较低,说明MSTN在牙鲆胚胎发育中并不起重要作用;其在各组织中的表达,随个体和环境的不同而有差异,暗示MSTN的表达受外界因素调控。