月季ITS反应体系的优化

以古老月季品种‘玉玲珑'为试材,利用CTAB法对月季进行总DNA提取,对其PCR扩增条件中的主要因素进行了多梯度的优化,总反应体系为25μL,其中引物浓度为0.4μmol/L、Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L、dNTP为0.2 mmol/L、Taq酶用量为1.0 U、DNA模板用量为70 ng.利用该优化体系对部分月季品种和野生种进行PCR扩增和电泳检测,扩增条带清晰,结果稳定,测序结果理想,表明该体系适用于月季的ITS序列分析.     

粗毛淫羊藿内转录间隔区序列扩增条件的优化

用CTAB法提取粗毛淫羊藿叶片DNA,进行内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS)序列PCR扩增试验,通过单因子试验研究了退火温度、Mg2+浓度、TapDNA聚合酶浓度、dNTP浓度对ITS-PCR反应的影响,并通过各因子的组合研究,建立了适宜于粗毛淫羊藿ITS分析的扩增体系:25μL体系中2.5μL10×buffer、1μL模板DNA、1.0mmol/LMgCl2、1.5mmol/L dNTP、1.25UTaq酶、0.4μmol/L ITS4、ITS5.PCR反应程序为95℃5min;94℃30 s,52℃45 s,72℃1min,共35个循环;72℃7min.粗毛淫羊藿ITS扩增条件的优化,可以为淫羊藿属遗传多样性的研究及分子鉴定奠定基础.     

新疆野核桃SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

利用正交设计对新疆野核桃序列相关扩增多态性PCR(SRAP-PCR)反应体系中的5个因素(模板DNA、Mg2+、引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶浓度)在5水平上进行优化,对比不同浓度模板DNA对扩增结果的影响,建立了新疆野核桃SRAP最佳反应体系。结果表明,优化的新疆野核桃SRAP-PCR最佳反应体系为:20μL的反应体系中,2.5μg/m L模板DNA、0.4μmol/L引物、2 mmol/L Mg~(2+)、0.2 mmol/L d NTPs、25 U/mL Taq酶U;最佳PCR扩增程序的退火温度为54℃。各因素扩增结果表明,Mg~(2+)浓度对扩增反应结果影响最大,d NTPs浓度影响最小。运用该体系对新疆野核桃样本进行了验证,表明该体系扩增稳定可靠。用该体系对100个SRAP引物组合进行筛选,筛选出15个扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合,为新疆野核桃种质资源研究奠定了基础。     

水曲柳SRAP分子标记反应系统的优化

以水曲柳叶片DNA为模板,利用SRAP(相关序列多态性)技术及L_(16)(4~5)正交试验和单因子试验方法,分析了不同浓度的DNA模板、Mg~(2+)、dNTP、引物、TaqDNA聚合酶对扩增结果的影响,最终确立的PCR最佳反应系统为:20μL体系中,2×PCR buffer、DNA模板50～100ng,Mg~(2+) 的浓度2.0mmol/L,dNTP0.15mmol/L,引物0.30μmol/L,TaqDNA聚合酶1.0U;最佳退火温度50℃.在此反应系统下,所扩增谱带清晰、稳定、多态性高.     

兜兰ITS-PCR反应体系的建立及优化

为优化兜兰ITS-PCR反应体系,以兜兰属植物为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,并采用单因子试验设计,对影响兜兰DNA ITS-PCR扩增反应的主要因素即Taq DNA聚合酶的用量、Mg2-浓度、dNTP浓度、引物退火温度、模板DNA用量和引物浓度等进行优化研究,建立兜兰最佳ITS扩增反应体系.结果表明:最佳反应体系为25 μL体系中,添加10×PCR buffer 2.5 μL、Taq DNA酶1.25U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,反应程序为94℃预变性4 min,1个循环;94℃变性30 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min后终止反应,4℃保存.利用此反应体系可得到预期大小的ITS基因片段.     

茶藨子总DNA提取及ITS-PCR体系的优化

利用Tiangen DP305试剂盒对茶藨子(Ribes L.)总DNA进行提取,应用单因子试验分析了DNA模板、dNTPs、引物和Taq酶对ITS-PCR扩增结果的影响,并建立了茶藨子ITS-PCR扩增反应的优化体系,最优反应体系为:25μL体系中,10×PCR buffer 1μL、Mg2+0.4 mmol/L、引物浓度0.5μmol/L、dNTP浓度为1 mmol/L、Taq酶的用量1.0 U、DNA模板用量为50 ng。优化后的反应体系可作为茶藨子属植物ITS-PCR的基本反应体系,为进一步开展茶藨子属的分类和系统发育研究奠定基础。     

思茅松SSR-PCR反应体系优化研究

以思茅松杂交亲本JG1号基因组DNA为模板,利用正交设计实验对影响SSR-PCR反应体系的主要因子进行了优化,建立了一套最佳思茅松SSR-PCR反应体系。结果表明:在25μL最佳反应体系中,各组分最佳含量分别为Mg~(2+) 2.0 mmol/L、DNA 60 ng、引物0.50μmol/L、Taq DNA聚合酶0.25U、dNTP 0.20 mmol/L。利用11份个体对此SSR反应体系进行验证,获得扩增谱带清晰且多态性较好,证明该体系稳定可靠。     

褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度等因素对简单重复序列间扩增(ISSR)反应体系进行优化。结果表明,褐苞薯蓣ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1. 875 U,DNA模板量52. 5 ng,d NTPs浓度0. 25 mmol/L,引物浓度0. 437 5μmol/L,Mg~(2+)浓度1. 5 mmol/L,10×Taq Buffer 2. 0μL,其余用dd H_2O补齐。     

半夏RAPD分子标记反应体系优化

从半夏中提取基因组DNA作为模板进行RAPD反应的优化试验,获得RAPD-PCR扩增反应的最佳条件:25μL体系中Mg2+1.5 mmol/L;dNTPs各0.2 mmol/L;模板DNA100 ng;引物0.25μmol/L;Taq酶活性值1.0 U。     

珍稀濒危植物宝华玉兰ISSR-PCR反应体系建立及优化

为建立和优化宝华玉兰(Magnolia zenii Cheng)ISSR-PCR反应体系,采用正交试验和单因子试验方法对影响PCR扩增体系中的Mg~(2+)、d NTPs、DNA模板、引物和Taq聚合酶一定浓度的用量5个因子进行分析比较。结果显示,宝华玉兰ISSR-PCR 25μL反应体系中的5个因子最佳水平分别为DNA模板(20 ng/μL)3.5μL,引物(10μmol/L)1.25μL,Taq聚合酶(5 U/μL)0.2μL,Mg~(2+)(25 mmol/L)2.0μL,d NTPs(2.5 mmol/L)0.8μL。宝华玉兰ISSR-PCR反应的最优体系建立,为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子身份证构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。     

杨梅iPBS-PCR反应体系的建立与优化

利用已报道的i PBS引物2249和3个杨梅品种的DNA为模板进行i PBS-PCR扩增,采用单因素法对杨梅i PBS-PCR反应体系的4个组分(d NTP、Mg~(2+)、引物、模板)用量进行优化,确定了杨梅i PBS-PCR 20μL反应体系:2μL 10×Taq buffer,1.6μL 25 mmol/L Mg~(2+),1.6μL 2.5 mmol/L d NTP,1μL 10μmol/L引物,0.2μL 5 U/μL Taq酶,30 ng模板DNA。梯度PCR试验表明可以参考i PBS引物Tm值确定退火温度。利用上述体系对随机取样的10个品种用4条i PBS引物进行扩增,得到了条带清晰、多态性好的i PBS谱带。     

荷花ISSR引物筛选及反应体系优化

利用加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物,以2个荷花品种的DNA为模板进行PCR扩增。采用单因素试验方法对荷花ISSR-PCR反应体系的5个因素(Mg2+、引物、dNTP、模板DNA、Taq酶)进行浓度优化,确定了荷花ISSR反应的25μL最佳扩增体系为:10×Taq Buffer 2.5μL,Mg2+3.0 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物1.0μmol/L,Taq酶1.00 U,模板DNA 40 ng。筛选出8条扩增条带较好的ISSR引物,并对其引物进行梯度PCR试验,筛选出各引物对应的最佳退火温度,扩增共计获得61条ISSR条带。     

桑树SSR-PCR反应体系的优化

为了建立经济稳定的桑树简单重复序列(SSR)-PCR反应体系,为SSR分子标记在桑树研究中更广泛地应用提供试验基础,采用L_(16)(4~5)正交试验设计和单因素试验,对桑树SSR-PCR反应体系中的模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度和rTaq酶用量5个因素的4个水平进行优化分析,并比较这5个因素的不同浓度对扩增效果的影响。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为Mg~(2+)、dNTPs引物模板DNArTaq酶。研究最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含有1.5μL 10～20 ng/μL DNA模板、0.4μL 25 mmol/L Mg~(2+)、0.5μL 2 mmol/L dNTPs、各0.15μL 20μmol/L正反向引物、0.1μL 5 U/μL rTaq酶和1μL 10×loading buffer。通过稳定性检测,表明该体系能够用于桑树的SSR分析。     

利用正交试验设计优化桂花的SSR-PCR体系

以潢川金桂DNA为SSR-PCR扩增模板,采用L_(16)(4~5)正交设计对Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度以及引物浓度在4个水平上进行了优化,建立了桂花SSR-PCR反应的最佳体系,即在10μL反应体系中,不同成分的最佳含量为Taq酶0.2 U、Mg~(2+)3.0 mmol/L、模板DNA 40 ng、dNTPs 0.60 mmol/L、引物0.8μmol/L。应用最佳体系对引物Of P50进行退火温度的优化,得到最适退火温度范围为60~62℃。     

黄瓜AFLP反应体系的优化

对影响AFLP(Amplified fragment length polymorphism)扩增的关键因素进行了摸索,以期获得清晰稳定的黄瓜AFLP反应体系。结果发现,最佳的预扩增体系为:20反应体系中包含0.5 UTaqDNA poly-merase、2.0μL dNTP(2 mmol/L)、1.2μL 25 mmol/L Mg2 、0.6μL 50 ng/μL每种引物、1×PCR Buffer和4μL模板DNA;最优的选择性扩增体系为20μL反应体系中含有1.0 UTaqDNA polymerase、2.0μL dNTP(2 mmol/L)、1.0μL 25 mmol/L Mg2 、1.0μL 50 ng/μL每种引物、3.0μL稀释40倍的预扩增产物和1×PCR Buffer。体系优化后,扩增产物稳定,条带十分清晰,无背景干扰。     

朝鲜白头翁RAPD反应体系的优化

采用改进的CTAB法提取朝鲜白头翁的基因组总DNA,建立朝鲜白头翁RAPD分析的PCR反应体系,成功进行RAPD扩增.筛选出的最佳PCR反应体系为:25μL反应体系中包括模板DNA 20ng,dNTP 200μmol/L,引物0.4μmol/L,Mg2+1.5 mmol/L,Taq酶1 U,10×Buffer 2.5μL,其余部分为无菌重蒸馏水.     

正交设计优化芒果SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以芒果基因组DNA为模板,采用正交试验对模板DNA含量、引物浓度、2×Taq PCR Master Mix含量进行3因素5水平正交试验优化。结果表明,相关序列扩增多态性PCR(sequence related amplified polymorphism,SRAPPCR)最佳反应体系为:30 ng模板DNA、0.3μmol/L引物、10μL 2×Taq PCR Master Mix,总体积为25μL。运用该体系对10份芒果种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从100对引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的36对引物组合。     

珍稀濒危植物银缕梅ISSR-PCR反应体系建立及优化

[目的]建立和优化银缕梅ISSR-PCR反应体系。[方法]采用正交试验和单因子试验对影响PCR扩增体系中的Mg~(2+)浓度、dNTPs、模板DNA及引物浓度、Taq酶用量5个因子进行分析研究。[结果]银缕梅ISSR-PCR 25μL反应体系中5个因子最优水平:DNA模板(20 ng/μL)2.50μL,引物(10μmol/L)1.00μL,Taq酶(5 U/μL)0.10μL,Mg~(2+)(25 mmol/L)3.00μL,d NTPs(2.5 mmol/L)1.50μL。[结论]银缕梅ISSR-PCR反应最优体系的建立为进一步利用ISSR对其进行分子标记辅助育种、分子指纹图谱构建和遗传多样性分析等后续研究奠定了基础。     

木槿ISSR-PCR反应体系的建立及优化

建立木槿ISSR-PCR反应体系,为木槿种质资源的创新与鉴定提供理论基础。采用正交试验法,对影响PCR结果的Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、模板DNA用量及引物浓度5个因素进行分析,采用单因素试验对退火温度进行筛选,并利用最佳体系对24个木槿品种进行扩增验证。结果表明,最优反应体系(25μL)中,含10×buffer(Mg~(2+) free) 2.5μL、Taq酶0.75 U、Mg~(2+) 2.0 mmol/L、dNTPs 0.10 mmol/L、模板DNA 100 ng、引物0.5μmol/L。PCR反应程序为94℃预变性2 min;94℃变性30 s,50℃退火30 s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸6 min,4℃保温。建立的体系对24个木槿品种能够扩增出清晰稳定、无拖带、多态性高的条带。     

黄瓜霜霉菌ITS区序列分析反应体系的构建及优化

文章以黄瓜霜霉菌为材料,采用改良的CTAB方法提取基因组DNA,研究了黄瓜霜霉菌ITS区序列分析中PCR反应体系的各主要成分对检测结果的影响,确立了适宜的退火温度和反应体系。优化后的反应体系(25μL)为:采用引物ITS1/ITS4各40 ng,60 ng DNA模板,2.5 mmol·L-1 Mg2+2.0μL,2.5 mmol·L-1 dNTP 1.5μL,Taq酶1 U。优化的PCR扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃50 s,52.2℃40 s,72℃1.5 min。在这一条件下运行35个循环;72℃延伸7 min。采用此反应体系和扩增程序,对采自黑龙江省不同地区的31份黄瓜霜霉菌基因组DNA进行PCR扩增,均可得到一条约为900 bp的条带。