蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究

以酪蛋白水解圈为筛选标记,在以酪蛋白为唯一氮源的平板上,从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株,经形态学鉴定和16S rRNA分析,将其分别鉴定为Bacillus sp.G1、Bacillus sp.G2、Stenotrophomonas sp.V1。将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后,其比酶活分别为22.21、19.10和16.03 U/mg。菌株Bacillus sp.G1和Bacillus sp.G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7.0;菌株Stenotrophomonas sp.V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃,最适酶反应pH值为7.5。     

蛋白酶高产菌株的筛选鉴定与酶学特性研究

以酪蛋白水解圈为筛选标记,在以酪蛋白为唯一氮源的平板上,从土壤中分离筛选到3株高产蛋白酶的菌株,经形态学鉴定和16S rRNA分析,将其分别鉴定为Bacillus sp.G1、Bacillus sp.G2、Stenotrophomonas sp.V1。将这3株菌株的发酵液通过硫酸铵分级沉淀初步纯化后,其比酶活分别为22.21、19.10和16.03 U/mg。菌株Bacillus sp.G1和Bacillus sp.G2所产蛋白酶的最适反应温度和最适反应pH值均为40℃和7.0;菌株Stenotrophomonas sp.V1所产蛋白酶的最适反应温度为70℃,最适酶反应pH值为7.5。     

2株产低温蛋白酶耐冷菌株的筛选及酶学性质

采用低温液体富集、酪蛋白筛选平板、温度复筛等方法从黑龙江省大庆油田土壤这一非极端自然环境中筛选分离获得2株产低温蛋白酶的耐冷细菌LS3和LS4,通过菌落形态和显微观察,结合16S r DNA全序列分析确定前者为假单胞菌属(Pseudomonas),后者为微小杆菌属(Exiguobacterium)。LS3和LS4菌株在低温(10℃)下均能较好地生长及产酶,最适酶活温度分别为40、30℃,最适作用pH值均为8,对热敏感,低温仍能维持较好的酶活,属于低温碱性蛋白酶。其中,LS3菌株在含尿素培养基中产酶活性较高(52.46 U/mL),LS4菌株产的蛋白酶对盐有一定耐受性。本研究结果丰富了对低温蛋白酶的研究开发,为其在食品工业、农业复合菌剂等领域的应用提供了基础。     

产蛋白酶海洋细菌的筛选及产酶工艺优化

[目的]筛选产蛋白酶的海洋细菌资源。[方法]分别采用2216E培养基和酪蛋白固体培养基,对采自宁波洋沙山和象山海域的海水进行微生物的分离与纯化,采用平板透明圈法初筛和酶活力测定法复筛,采用16S r DNA序列分析进行菌株鉴定,并进行产酶工艺优化研究。[结果]纯化出15株产蛋白酶海洋细菌,从中筛选出1株产蛋白酶活力最高的菌株PB02,经鉴定为交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。该菌株最适培养温度为20℃,最适装液量为10%,最适接种量为0.5%,最适转速为100 r/min,最适培养基pH为7。酶促反应最适温度为40℃,最适pH为10。[结论]该研究为蛋白酶高产菌株的改造和定向进化奠定了资源基础。     

金属离子对细菌源蛋白酶稳定性的影响

用透明圈法从六株产蛋白酶细菌菌株P1-P6中选出一株酶活较大的菌株P5,用紫外分光光度法对5个不同浓度、7种不同金属离子影响P5菌株的蛋白酶稳定性进行了初步研究。结果表明：菌株P5的最适生长温度40℃,最适pH 7.2;一定浓度的Fe^3＋、Mg^2＋、Ca^2＋、Zn^2＋4种离子具有增强酶热稳定性的作用,Mn^2＋...     

解淀粉芽胞杆菌FJAT-8754产纤维素酶和淀粉酶特性及发酵条件优化

采用淀粉平板和羧甲基纤维素钠（CMC-Na）平板从选取的140株芽胞杆菌中初筛出8株具有产纤维素酶和淀粉酶复合酶芽胞杆菌,经酶活力测定解淀粉芽胞杆菌FJAT-8754（Bacillus amyloliquef aciens）具有较高的淀粉酶、纤维素酶活力。通过研究解淀粉芽胞杆菌FJAT-8754的生长、产酶曲线以及酶学特性,确定在发酵28 h后菌体生长进入稳定期,培养44 h时发酵液中活菌数达到最大为4.41×109 cf u · mL -1,在36 h时纤维素酶、淀粉酶均达到酶活最高峰,酶活分别为135.8、1543.3 U · mL -1;纤维素酶反应最适p H值为5.5、最适温度为50℃,Vmax为5.14×10-3 mg · mL -1· min-1、 Km值为7.71×10-1 mg · mL -1;淀粉酶反应最适pH值为5.5、最适温度为55℃,Vmax为3.35×10-2 mg · mL -1· min-1、 Km值为6.03×10-3 mg · mL -1。采用3因素7水平,即U 7（73）均匀设计法优化解淀粉芽胞杆菌产酶条件,确定产纤维素酶、淀粉酶的最优条件均为：初始pH值6.2、培养温度37.5℃、转速180 r · min-1,优化后解淀粉芽胞杆菌 FJAT-8754纤维素酶活力为202.9 U·mL -1、淀粉酶活力为2392.9U·mL -1。     

深海芽孢杆菌B1394的鉴定及其产蛋白酶酶学性质

从深3 200-3 600 m的南海海底沉积物中分离到185株深海细菌,从中筛选到1株产蛋白酶活力较强的菌株B1394,酶活高达873 U/mL.采用16S rDNA分子生物学鉴定,结合细菌常规鉴定方法鉴定其为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).对其粗酶性质进行研究发现:最适酶活温度60℃,最适pH 8.0,在低温30℃和40℃下也具有较高的酶活性,40-60℃热稳定性较好,显示出部分嗜热酶特性;Mn2+、Mg2+、ca2+对该蛋白酶有激活作用,Hg2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Fe2+对该蛋白酶有抑制作用;PMSF几乎完全抑制蛋白酶活性,推断为丝氨酸蛋白酶.     

一株产蛋白酶海洋细菌的分离鉴定及发酵条件研究

从舟山海产品加工厂收集废弃鱼虾蟹等下脚料,利用脱脂奶平板培养基进行产蛋白酶菌株的分离筛选,获得的菌株利用Folin-酚法进行酶活测定,将酶活性最高的菌株进行16S rDNA分子鉴定,绘制系统进化树。研究初始pH、盐度、培养温度、培养时间等单因素对蛋白酶活性的影响,再利用Expert-Design软件中的响应面分析方法(RSA)对该菌株的发酵条件进行系统优化。结果表明,分离筛选得到1株具有较高蛋白酶活性的海洋细菌SP1,酶活测试结果显示该海洋细菌SP1的初始酶活为88.6 U·mL ^-1,16S rDNA分子鉴定结果显示该菌株属于蜡样芽胞杆菌Bacillus cereus。菌株Bacills cereus SP1的单因素培养结果显示,该菌株培养时间48 h、初始pH值8.5、NaCl浓度25 g·L ^-1、培养温度40 ℃对应的酶活最高。通过Expert-Design软件,利用Box-Behnken Design(BBD)方法进行响应面分析,优化设计培养条件,BBD响应面分析结果显示,培养温度35.7 ℃、初始pH 7.7、NaCl浓度为20.7 g·L ^-1、培养时间48 h,摇床转速120 r·min ^-1,5%的接种量,实际酶活为101.8 U·mL ^-1,比优化前的酶活提高了14.9%,预测精度达到95.8%。     

产组成型几丁质酶菌株的筛选及产酶条件优化

利用两次平板透明圈筛选,结合液体培养,从土壤中分离出1株产几丁质酶细菌,命名为CCB-1.该菌株产几丁质酶不需要几丁质诱导,而且高浓度的葡萄糖不抑制该菌株产几丁质酶,因此该菌株是组成型产几丁质酶.形态学观察和生理生化测定结果表明CCB-1是浸麻芽孢杆菌(Bacillus macerans).在250 mL摇瓶中研究了氮、葡萄糖浓度、pH值、培养温度、几丁质类型和培养时间对CCB-1生长及产酶的影响.CCB-1菌最适产酶条件为:温度37 ℃;pH 6～pH 7之间;起始葡萄糖浓度8g/L;0.4%的有机氮(如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏);0.3%的胶体几丁质或细粉几丁质.CCB-1在优化培养条件下振荡培养60 h产酶最高,达4.23 U/mL.     

高产中性蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件的研究

为从高温大曲中筛选出高产中性蛋白酶菌株,利用生理生化实验和16SrDNA序列同源性鉴定和分析产酶条件。结查表明:从已获得的8株产酱香菌株筛选得到高产中性蛋白酶菌株为GX03(706.13U·g-1),并鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。通过单因素和正交试验得到最适产酶条件:含水量为35%,接种量为11%,氮源为硝酸钠,初始pH 5.5,培养时间为6d,经优化后该菌产酶性能大幅度提高,可达567.30U·g-1。     

猪源高产蛋白酶芽胞杆菌的分离与鉴定

利用酪蛋白培养基从猪粪便样品中分离产蛋白酶的芽胞杆菌,采用福林酚法测定其酶活力,对筛选到的高酶活菌株进行形态学、生理生化和分子鉴定。结果表明,从86株分离茵中筛选了一株酶活较大的菌株B．A464,革兰氏阳性菌,呈粗杆状,能形成卵圆形芽孢,16SrDNA序列长度是1463bp,与蜡样芽孢杆菌的同源性高达99％,鉴定为蜡样芽孢杆菌,所产蛋白酶活力为2．19×10^3U·mL^-1。     

发酵床垫料中高效纤维素降解菌的分离与筛选

为获得高效纤维素降解菌,从发酵床垫料中分离出5 株能降解纤维素的微生物菌株,对5株菌进行了透明圈和纤维素酶活性测定。结果表明:5 株菌株均可在纤维素-刚果红平板上快速形成透明圈,其中菌株A3 产酶活性最强,在接种后72 h 达到125.47U·mL^-1。对其16SrDNA 序列进行分析,结合形态学观察和生理生化特征,将该菌鉴定为地衣芽孢杆菌 (Bacillus licheniformis) 。培养时间和温度对菌株的酶活力影响较大,各菌株的产酶最适温度为30~40℃。该芽孢杆菌分解纤维素能力强、适应能力高,在发酵床垫料堆肥中具有潜在的应用前景。     

腐熟堆肥中维素降解菌筛选鉴定及酶学特性研究

为筛选高效纤维素降解菌,促进堆肥过程中秸秆等纤维素物质快速腐解,在以牛粪和秸秆为材料的腐熟堆肥中分离菌株,以刚果红培养基和滤纸条降解试验初筛菌株,筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤纸条分解能力较强的菌株,作液体发酵培养,测定其酶活力,得到羧甲基纤维素(CMC)酶活和滤纸(FPA)酶活均较高2株菌(1号和7号),并将其在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源产酶培养基中作产酶特性研究。结果表明,pH 6.5,培养时间48 h条件下,1号和7号菌株CMC酶活分别为26.82和31.28 U·m L-1,FPA酶活分别为20.32和20.82 U·m L-1。通过形态学、生理生化特征、16S rDNA核酸序列分析及26S rDNA的D1/D2区域测序鉴定,确定1号菌属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),7号菌属于隐球酵母菌(Cryptococcus flavescens)。     

产纤维素酶真菌菌株的分离筛选及产酶条件优化

【目的】由于真菌的纤维素酶系较全,且可分泌至胞外,易分离,所以试验致力于筛选高产纤维素酶真菌菌株.【方法】利用羧甲基纤维素钠培养法、刚果红染色法、纤维素酶活性测定法从样品中分离筛选出产纤维素酶菌株,同时结合菌落形态观察、显微镜观察和ITS序列同源性分析进行鉴定.【结果】通过初筛,筛选出15株Hc值较大的产纤维素酶真菌菌株,再经过液体发酵复测羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活,筛选出一株产纤维素酶活最高的菌株B-2-3,经鉴定B-2-3为烟曲霉(Aspergillus fumigatus),其羧甲基纤维素酶活为2 341.76U/mL,滤纸酶活为398.18U/mL.经过产酶条件优化,确定其最适产酶条件为温度25℃、接种量4μL、蛋白胨0.5~0.6g/L、CMCNa 0.3~0.35g/L、pH 6.5.【结论】筛选出一株产纤维素酶活较高的烟曲霉菌株B-2-3.     

金枪鱼肉降解用高产蛋白酶菌株的筛选及鉴定

采用透明圈法从舟山普陀白山土壤中筛选出3株能分泌胞外蛋白酶的菌株,并对蛋白酶活力最高的菌株进行分子鉴定及最适宜生长条件分析。选择福林酚试剂法测定其蛋白酶活力,对蛋白酶活力最高的菌株进行16S r RNA基因测序,用MEGA软件构建系统发育树,并考察其接种量、温度、时间对该菌株产酶活力的影响。结果表明,zjoub-1菌为高产蛋白酶菌属,并确定为枯草芽孢杆菌。该菌株用于金枪鱼暗色肉发酵时的最适宜条件为接种量2%、pH 7.4、温度37℃、时间48 h。在此生长条件下,菌株产蛋白酶活力最高,为49.21 U/m L,能够有效地降解金枪鱼暗色肉。     

低温蛋白酶高产菌株的筛选、鉴定及培养条件优化

从慕士塔格峰江布拉克冰川融水中筛选获得一株耐低温蛋白酶细菌菌株P3-1,16S r DNA序列分析鉴定为假单胞菌,其分泌的蛋白酶最适催化温度为25℃,符合低温酶特性.通过单因子筛选及正交试验优化P3-1发酵条件,确定其最佳产酶培养基配比为:3.0%葡萄糖、1.5%蛋白胨、0.3%Mg SO4,最适宜培养条件为:接种量3%,p H 7.0,发酵时间42 h.在此条件下菌株发酵产酶活力可达82.1 U·m L~(-1),是最初(37.3 U·m L~(-1))的2.2倍.     

赭绿青霉 Sp1菌株木聚糖酶最佳产酶条件及部分酶学特性研究

[目的]从土壤中分离筛选获得了一株具有高产木聚糖酶能力的真菌Sp1.[方法]经过28S rDNA测序鉴定为赭绿青霉(Penicillium ochro-chloron ).通过对摇瓶发酵条件优化试验及酶特性研究.[结果]该菌株的最适产酶条件为:2;(W/V)粗制木聚糖+0.5;葡萄糖为碳源,0.44; KNO3+0.06;蛋白胨为氮源,发酵起始pH为5.0,150 mL三角瓶装液量为40 mL,转速为220 r/min,28 ℃下培养72 h木聚糖酶酶活可达387 U/mL.将菌株Sp1发酵所得粗酶液经过纯化后研究其酶学特性,酶最适反应pH为4.0,最适反应温度为55 ℃,在40 ℃,pH 2.2～6.0,酶活性稳定.终浓度为0.01 mol/L的Na+ 、K+ 和Zn2+ 对酶活有促进作用.[结论]所筛选的Sp1菌株具有较好的应用前景.     

弹性蛋白酶产生菌的筛选及其发酵条件的初步研究

从肉联厂和屠宰场附近的土壤和污水中采集到的近100个样品中,经富集培养分离到123株能产生弹性蛋白酶的菌株,反复初筛、复筛后,分离到一株产胞外弹性蛋白酶活较高且稳定的细菌,经初步鉴定属芽孢杆菌属(Bacillus sp. EL3).同时研究了其产酶最适条件, 产酶最适碳源为葡萄糖, 最适氮源为豆饼粉.并对碳源、氮源和生长因子进行了正交实验,研究发现碳源对产酶的影响最大,其次为氮源.当葡萄糖的用量为6%、豆饼粉为5%、玉米提取液为0.2%时,其具有较高的产酶水平.最适发酵初始pH为7.5 , 250 mL 最适摇瓶装液量为20 mL.在该发酵培养基中培养,35 h时达最高的产酶水平.同时还对离心后的粗酶液进行温度和pH试验, 发现该酶最适作用温度和pH分别为50 ℃和7.4, 该酶在40 ℃以下保温30 min酶活仍较高, 在60 ℃以上酶活全部丧失.在pH7.4～9.0的范围内比较稳定, 而在pH 7.0以下时, 酶活下降很快.金属离子Cu2+、Zn2+、Al3+能抑制弹性蛋白酶的活性,而Fe3+、Li2+能激活弹性蛋白酶活性,螯合剂EDTA则严重抑制弹性蛋白酶活性.     

四川太和毛霉豆豉中优势发酵菌株的分离鉴定与酶活分析

[目的]从传统的四川太和毛霉豆豉中分离产蛋白酶较高的优势菌株,并通过形态学与分子生物学技术进行鉴定,研究菌株酶活.[方法]以四川太和毛霉豆豉为研究对象,通过分离、纯化技术分离其中优势菌,并结合形态学与分子生物学技术进行特征菌落鉴定,最后对2株霉菌的蛋白酶和纤维素酶活性进行检测.[结果]四川太和毛霉豆豉中2株产蛋白酶较高的优势菌株分别为M-THF-01与M-THF-02;经形态学与分子生物学鉴定技术发现,M-THF-01为雅致放射毛霉(Actinomucor elegans),M-THF-02为总状毛霉(Mucor race-mosa).M-THF-01与M-THF-02中性蛋白酶酶活分别为(83.00±4.25)U/mL和(277.35±6.09)U/mL,酸性蛋白酶分别为(156.36±3.68)U/mL和(405.69±4.18)U/mL,碱性蛋白酶分别为(19.30±2.56)U/mL和(25.37±3.88)U/mL,产纤维素总体酶活分别为(2.51±0.85)U/mL和(3.64±1.31)U/mL.总体来说,M-THF-02产酶活力明显高于M-THF-01.[结论]该研究可为毛霉豆豉纯复合发酵剂的研发提供理论基础,并为毛霉豆豉的工业化与规模化生产提供科学依据.     

产组成型几丁质酶菌株的筛选及产酶条件优化

利用两次平板透明圈筛选,结合液体培养,从土壤中分离出1株产几丁质酶细菌,命名为CCB-1.该菌株产几丁质酶不需要几丁质诱导,而且高浓度的葡萄糖不抑制该菌株产几丁质酶,因此该菌株是组成型产几丁质酶.形态学观察和生理生化测定结果表明CCB-1是浸麻芽孢杆菌（Bacillus macerans）.在250 mL摇瓶中研究了氮、葡萄糖浓度、pH值、培养温度、几丁质类型和培养时间对CCB-1生长及产酶的影响.CCB-1菌最适产酶条件为：温度37℃;pH 6-pH 7之间;起始葡萄糖浓度8g/L;0.4%的有机氮（如蛋白胨、牛肉膏、酵母膏）;0.3%的胶体几丁质或细粉几丁质.CCB-1在优化培养条件下振荡培养60 h产酶最高,达4.23 U/mL.