转小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥植株的主要抗旱性研究

核氧还蛋白（nucleoredoxin,NRX）可通过还原目标蛋白的二硫键来调控其生物活性,在植物的生长发育和抗逆境胁迫中发挥着重要作用。蛋白质二硫键异构酶（protein disulfide isomerase,PDI）、h型硫氧还蛋白（h-type thioredoxin,TRXh）和蛋白磷酸酶2A催化亚基（protein phosphatase 2A catalytic subunit,PP2Ac）是小麦核氧还蛋白TaNRX1的互作蛋白。为了明确TaNRX1互作蛋白的抗旱性功能,本研究在拟南芥中过表达了小麦 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因,对野生型和转基因拟南芥的表型和抗旱相关生理指标进行了鉴定。结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的根长、存活率、脯氨酸含量均大于野生型,离体叶片失水率、丙二醛（MAD）含量均小于野生型。二氨基联苯胺（diaminobenzidine,DAB）对H₂O₂组织定位染色结果表明,干旱胁迫处理后,转 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D基因拟南芥的H₂O₂含量均低于野生型。上述结果说明,TaNRX1的互作蛋白基因 TaPDI-A、 TaTRXh-A和 TaPP2Ac-D增强了拟南芥对于干旱胁迫的抵抗能力。本研究可为小麦抗旱育种提供候选基因和理论基础。     

小麦 TaPLC1基因与耐热的相关性研究

小麦磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositide-specific PLC,简称PI-PLC）在小麦抗逆过程中具有重要作用。为研究 TaPLC1基因与小麦耐热性的关系,选用热敏感型品种中国春(CS)和耐热型品种TAM107,在一叶一心期用PI-PLC抑制剂U73122处理,在两叶一心期进行40 ℃热胁迫处理,对小麦植株的部分生理指标（MDA、SOD、叶绿素和可溶性糖含量）及 TaPLC1基因的表达模式进行测定。结果表明,在两个品种中,抑制剂处理较未处理的幼苗叶片MDA、SOD及可溶性糖含量均升高,叶绿素含量下降,中国春的变化幅度大于TAM107。 TaPLC1基因在两个品种中呈现不同的表达模式,但表达量均在热胁迫30 min达到最大值。随着热处理时间的延长,未经抑制剂处理的TAM107叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度明显大于处理叶片,抑制剂处理的TAM107对热胁迫响应不显著;而未经抑制剂处理的中国春叶片中 TaPLC1的表达量变化幅度与抑制剂处理的叶片差异不显著,均在一定程度上响应热胁迫;未经抑制剂处理的叶片,TAM107中 TaPLC1表达量的变化幅度明显大于中国春。热胁迫后,中国春幼苗出现明显萎蔫现象,TAM107轻微萎蔫,停止热胁迫后,全部幼苗萎蔫逐渐恢复,而抑制剂处理的幼苗叶尖开始枯萎变黄,热胁迫处理4 h后第5天表型较为明显,品种之间枯萎变黄程度无明显差异。以上结果说明,抑制 TaPLC1基因的表达后,幼苗对热胁迫的敏感性增强,TAM107和中国春的耐热性可能与 TaPLC1的表达有关。     

小麦LACS基因家族的全基因组鉴定与表达分析

长链酰基辅酶A合成酶(long-chain acyl-coenzymeA synthetase, LACS)在脂肪酸代谢、角质层角质和蜡的合成中发挥着重要作用。为研究小麦中LACS基因的特征,以中国春为材料,进行全基因组鉴定和分析。结果共鉴定出148个小麦LACS基因(TaLACS),不均匀分布于21条染色体上,且有成簇分布的现象,编码蛋白大部分为中性、亲水的水溶性蛋白,性质稳定。系统进化分析结果显示,148个TaLACS基因聚为6组,有55对旁系同源基因。表达谱分析表明,TaLACS基因在不同组织和逆境胁迫下存在明显的差异表达,说明TaLACS基因具有组织特异性,在抗低温、干旱和赤霉病过程中TaLACS基因发挥重要作用。该家族中含有响应低温、干旱和脱落酸元件的基因分别占34.9%、46.0%和85.8%,揭示TaLACS基因参与生物胁迫和非生物胁迫过程。     

小麦钾离子通道蛋白基因TaAKT1的功能分析

小麦AKT1具有钾离子转运功能。为了给小麦钾离子吸收转运机制的研究提供参考,本研究从普通小麦品种石4185中扩增得到TaAKT1基因,其编码区序列全长2 694bp,生物信息学分析表明,TaAKT1蛋白包含897个氨基酸,相对分子质量为100.92kDa,具有钾离子通道蛋白的特征序列TxxTxGYGD。多序列比对发现,TaAKT1蛋白与大麦HvAKT1蛋白的进化关系最近,相似性达97.22%。利用qRT-PCR分析发现,在正常条件下TaAKT1基因在小麦根部表达量约为叶片中表达量的5倍,低钾环境下TaAKT1的表达量在小麦根部明显上调,叶部的表达量无明显变化。利用酵母功能互补实验发现,转TaAKT1基因的酵母在含有5mmol·L~(-1) KCl的AP培养基上正常生长,而转空载体的酵母长势受到抑制,说明TaAKT1具有钾离子转运功能。同时转TaAKT1基因与TaCIPK23基因的酵母能在含60μmol·L~(-1) KCl的AP培养基上生长,而转空载体与转TaAKT1基因的酵母菌株均不能生长,说明TaCIPK23可以增强TaAKT1的钾离子吸收能力。     

小麦TaKLU基因调控植物株型的研究

为了解小麦TaKLU基因对植物株型的影响,对拟南芥功能缺失突变体klu和过表达TaKLU转基因拟南芥进行了表型观察,并对相关性状进行了统计。结果表明,过表达TaKLU基因导致拟南芥分枝数目减少,顶端优势增强,但不影响产量;相反,拟南芥klu突变体分枝数目增加,顶端优势减弱,单株产量减少。进一步对拟南芥klu突变体进行回补试验,发现用拟南芥klu基因自身启动子驱动TaKLU基因在拟南芥klu突变体中表达后,能恢复突变体的顶端优势,而且其株高、分枝数目与野生型没有明显差异;用强启动子35S和特异启动子pINO驱动TaKLU基因在拟南芥klu突变体中表达后,突变体的顶端优势增强,株高升高,而且其分枝数目明显多于野生型,表明小麦TaKLU基因具有调控植株株型的功能,为小麦株型育种提供了新的研究思路。     

小麦TaPYL8基因的克隆与抗旱功能分析

脱落酸(ABA)信号通路在植物对干旱胁迫的响应中扮演着至关重要的角色;作为ABA受体,PYL家族蛋白在ABA信号转导中发挥核心作用。小麦TaPYL8是PYL家族的成员。为了明确TaPYL8是否参与小麦干旱胁迫响应,本研究分析了TaPYL8的表达模式,创建过表达TaPYL8拟南芥,并探讨了干旱对拟南芥生理生化及胁迫相关基因表达的影响。结果表明,TaPYL8表达量在干旱胁迫、外源ABA及PEG6000处理后上调。干旱胁迫下,过表达TaPYL8增强了拟南芥的存活率,降低了叶片失水率和MDA含量,提高了SOD、POD和CAT等抗氧化酶活性及AtSOD、AtP5CS1、AtABF3等胁迫相关基因的表达量。推测TaPYL8通过促进胁迫相关基因表达增强植物抗旱能力。     

基因枪介导的转 TaGAPDH8基因小麦的获得与鉴定

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)是参与糖酵解和糖异生途径的关键酶之一,在维持细胞能量供应和植物抗逆性方面具有重要作用。本研究以耐旱型小麦品种长武134及干旱敏感型小麦品种郑引1号为材料,利用基因枪法将 TaGAPDH8基因分别转化这两种小麦的幼胚愈伤组织,经潮霉素筛选和PCR鉴定,最终得到4个下调表达的长武134株系(CW134-3、CW134-6、CW134-12、CW134-13)和8个上调表达的郑引1号株系(ZY1-1、ZY1-3、ZY1-4、ZY1-9、ZY1-10、ZY1-14、ZY1-15、ZY1-17)。对生长于大田的T_2代转基因植株在乳熟期的生长状况进行了测定,获得了与对照相比有明显表型差异的植株。用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术测定了T_3代小麦株系中 TaGAPDH8的表达量,结果表明,4个长武134株系中 TaGAPDH8基因的表达量分别为对照的0.53、0.75、0.21和0.78倍,而8个郑引1号株系中目的基因的表达量分别为对照的3.02、1.22、2.15、1.36、4.02、1.87、1.48和1.97倍。本研究获得了与对照存在明显表型差异的T_2代及稳定遗传目的基因的T_3代小麦株系,为后续的试验提供了研究材料和基础。     

小麦转录因子TaMYB5 like转录自激活能力及其参与生理型花粉败育过程表达模式研究

化学杂交剂SQ-1诱导的小麦花粉败育是一个复杂的生理代谢过程,TaMYB5-like被发现参与此过程。为了解TaMYB5-like基因在SQ-1诱导小麦生理型花粉败育过程中的作用,以SQ-1诱导的小麦生理型雄性不育系PHYMS-1376和对照可育系CK-1376四分体、单核早期、单核晚期、二核期和三核期花药为试验材料,克隆TaMYB5-like基因,并对其进行序列结构、生物信息学、表达模式、亚细胞定位及转录自激活效应分析。结果发现,TaMYB5-like基因序列长5 207 bp,其cDNA长为1 133 bp,其中CDS序列长819 bp,编码272个氨基酸,含有2个SANT结构域,分子量为29.36 kDa,无信号肽,无跨膜结构,亚细胞定位在细胞核内;TaMYB5-like基因启动子涉及光响应、逆境胁迫响应、茉莉酸甲酯响应等顺式作用元件。自激活效应发现,TaMYB5-like蛋白的自激活区段位于N端,合适浓度的AbA和3-AT可以抑制BD-TaMYB5-like和BD-TaMYB5-like-N-SANT融合蛋白的自激活性;随着蛋白质氨基酸序列的截断,自激活性呈降低趋势。与CK-1376相比,PHYMS-1376四分体和单核早期花药中TaMYB5-like表达量差异不显著;花药发育到单核晚期、二核期和三核期时,TaMYB5-like表达量显著增加;CK-1376和PHYMS-1376三核期时花药内TaMYB5-like表达量均最高。     

小麦木瓜类半胱氨酸蛋白酶基因TaRD21的克隆及赤霉病菌诱导下的表达分析

木瓜类半胱氨酸蛋白酶（PLCPs）作为一类重要的蛋白水解酶,在植物生长发育以及胁迫应答过程中都发挥着重要作用。本研究从抗、感赤霉病小麦品种差异表达基因谱中获得1个注释为RD21 Cysteine proteases的EST（表达序列标签）,以此序列检索小麦最新基因组数据库并设计引物,从小麦中克隆到3个基因,分别命名为TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D,属于PLCPs RD21家族。序列分析表明,3个基因的开放阅读框长度分别为1 410、1 428和1 419 bp,分别编码469、475和472个氨基酸。序列比对发现,3个基因的序列相似性为89.3％,所编码蛋白的氨基酸序列相似性为95.6％。系统进化分析表明,TaRD21-2A、TaRD21-2B和TaRD21-2D蛋白的同源性较高,且与乌拉尔图小麦TuRD21A蛋白聚为一类。qRT-PCR分析表明,3个TaRD21基因均受水杨酸(SA)、乙烯利(ETH)以及赤霉病菌诱导表达;感病品种中,TaRD21-2A对SA和赤霉病菌的响应更迅速,且表达量较高;抗病品种中,TaRD21-2B和TaRD21-2D基因对ETH的响应更迅速。     

小麦地方品种黄方柱中赤霉病主效抗性位点 Fhb1的精细定位

位于小麦3BS染色体上的赤霉病抗性主效基因Fhb1的效应较大而且比较稳定,是培育抗赤霉病品种最常用和最可靠的位点。我国小麦地方品种黄方柱（HFZ）高抗赤霉病且在3BS染色体上携带Fhb1基因。本研究对HFZ/Wheaton重组自交系（RIL）群体的Fhb1位点进行分子标记检测,筛选到两个杂合子株系,并对这两个杂合子株系连续自交3代,衍生出2个次级分离群体（L30和L112）,将这两个次级分离群体在扬州大学农学院试验田种植,并在扬花期进行单花滴注接种鉴定赤霉病,调查这两个群体中各株系的病小穗数、病小穗率、病粒数和病粒率。结果表明,L30和L112两个群体的病小穗数和病小穗率均显著正相关,病粒数和病粒率均显著正相关。同时依据小麦3B染色体参考序列开发了7个新的多态性标记,分别是 X1550、X2214、X2300、X2357、X2455、X2460和X2467。用这些多态性分子标记进行基因型检测,在目标位点发现5个交换株系,根据基因型和病小穗率,进一步将Fhb1定位在分子标记 X2214与 X2357之间,在ctg0954b上这两个分子标记之间的物理距离约为143 kb,NCBI预测该区间有3个候选基因,但是FGENESH在相同区段预测了29个基因,说明目标区段所具有的基因数目很可能多于3个,但少于29个。     

小麦镰刀菌毒素及其发生风险研究进展

近年来,小麦赤霉病在我国小麦产区高频率流行,尤其在长江中下游、淮河流域以及黄淮南部,导致小麦中镰刀菌毒素严重污染,不仅影响小麦产量,还危害人畜健康。镰刀菌毒素包括脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON,又称呕吐毒素)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)以及伏马毒素(FB)等,可以引起动物消化、神经、免疫以及生殖系统异常,有的还具有致癌作用。本文对我国小麦镰刀菌毒素的发生情况与影响因素进行了分析,同时对镰刀菌毒素的风险评估与防控研究的迫切性进行了探讨,以期提高人们对小麦镰刀菌毒素污染的认识,保障我国小麦产业的健康发展。     

小麦抗叶锈病中间材料的Lr24、Lr38分子标记辅助选择

为加速小麦抗叶锈优质品种的培育,利用Lr24、Lr38的分子标记对优质品种豫麦34、中优9507和高抗叶锈品系1R17的杂交F3:4代的优质材料进行了目的基因的鉴定。结果从150份杂交后代F3:4中筛选出了70份聚合Lr24和Lr38的高抗优质材料,其余80份材料表型为抗叶锈病,但不含Lr24和Lr38或仅含二者之一。本研究避免了小麦抗叶锈病育种的盲目性,提高了抗叶锈基因选择的准确度。     

小麦抗条锈基因Yr1和Yr2分子检测体系研究

为建立小麦抗条锈病基因分子检测体系,分别以Yr1和Yr2紧密连锁的标记为检测标记,以Sull-1、CYR29、CYR32、CYR33和V26/CM42为小麦条锈菌鉴别菌株,构建Yr1和Yr2分子检测体系,并对181份小麦高代系材料进行了抗病鉴定和Yr1和Yr2基因分析。结果表明,gwm372和gwm382可作为Yr1的检测标记;wmc364可作为Yr2的检测标记;5个鉴别菌株对Yr1和Yr2具有较好的区分能力。Yr1和Yr2基因在181份小麦高代系材料中比例较低,表明这两个基因在我国小麦抗病育种过程中丢失严重。     

小麦抗赤霉病鉴定及其抗病基因的检测

小麦赤霉病是由镰刀菌和禾谷镰孢菌引起的小麦真菌病害,严重影响小麦的产量与品质。为了筛选适合黄淮麦区利用的抗病品种资源,于2017-2018年度利用单花滴注对107份黄淮麦区小麦资源进行田间赤霉病抗性鉴定;同时利用与 Fhb1、 Fhb2、 Fhb4和 Fhb5共4个与抗赤霉病相关QTL紧密连锁的8个分子标记对供试小麦材料进行了检测。经鉴定,扬富麦101表现为抗赤霉病(R),宁麦13、宁麦资119、扬麦16等12个品种表现为中抗赤霉病(MR);分子标记检测发现,这些抗赤霉病品种携带1个或多个抗赤霉病QTL位点,其中 Fhb1基因及其基因组合效应最为明显, Fhb1可以作为主要抗性基因应用于小麦赤霉病抗性育种。     

小麦茎基腐病病原假禾谷镰刀菌与赤霉病之间的关系

近年来,黄淮地区小麦茎基腐病发生严重,假禾谷镰刀菌是黄淮地区小麦茎基腐病的优势病原菌,同时也可引起小麦赤霉病。为明确假禾谷镰刀菌与小麦赤霉病的关系,本研究从山东省商河县小麦茎基腐病重病田块分别采集苗期和成熟期小麦病株,通过分离鉴定发现,苗期小麦茎基腐病的优势病原菌为假禾谷镰刀菌,且致病性试验结果显示,假禾谷镰刀菌在人工接种条件下能够引起严重的小麦赤霉病;此外,在小麦苗期田间的玉米秸秆上能够观察到尚未成熟的子囊壳,对子囊壳进行真菌分离鉴定,发现其包含禾谷镰刀菌和假禾谷镰刀菌形成的子囊壳。在小麦成熟期,从小麦赤霉病病穗中也分离到了假禾谷镰刀菌。这是山东省首次报道假禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病。综上,在小麦茎基部和穗部均能分离到假禾谷镰刀菌,且假禾谷镰刀菌在人工接种条件下能够引起严重的小麦赤霉病。结合当前黄淮地区小麦茎基腐病严重发生以及普遍秸秆还田的现状,推测假禾谷镰刀菌可能会助推小麦赤霉病的发生流行。     

小麦 TaSABP2基因的克隆及表达分析

为挖掘小麦抗逆基因,进一步解析小麦抗逆机制,采用电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦叶片中分离出 TaSABP2基因;利用生物信息学手段分析其序列特征;运用实时荧光定量反转录PCR(qRT-PCR)技术检测其在不同条件下的表达情况。结果表明,小麦 TaSABP2基因的cDNA全长为878 bp,包含一个长度为807 bp的开放阅读框,编码268个氨基酸。 TaSABP2基因的编码蛋白包含Abhydrolase及PLN02211两个结构域及一个酶活性中心(VVLVGHSLGG),属于Abhydrolase超家族的成员。其蛋白二级结构由四种形式构成,包括40.3%的α-螺旋、16.42%的延伸链、4.48%的β转角、38.81%的无规则卷曲。通过与其他植物的氨基酸序列进行多重序列比对,发现功能区域的氨基酸序列较为保守。qRT-PCR结果表明, TaSABP2基因的表达具有较强的组织特异性,植物激素ABA和BR处理及干旱和盐胁迫处理,均能诱导该基因的表达量迅速增加。以上结果表明, TaSABP2基因在小麦抵抗逆境胁迫过程中起到一定作用。     

小麦TaNIP4-1基因的克隆及生物信息学分析

水通道蛋白不仅控制着水分和一些小分子溶质的跨膜运输,也是植物体应对非生物胁迫的重要组成部分。为了进一步研究小麦水通道蛋白的功能,本研究以NCBI和Ensemble Plant数据库中查找出的已报道的小麦水通道蛋白基因序列为模板,针对其保守区设计了19对引物,应用PCR的方法从5个小麦品种中克隆出19个基因片段。通过比对鉴定到一个此前未曾报道的新基因,并对其进行生物信息学分析,将其命名为TaNIP4-1。理化特性分析表明,该基因位于3A染色体短臂,基因全长1 315bp,CDS序列长度864bp,含有3个外显子和2个内含子,编码含有288个氨基酸的多肽,含有保守的沙漏模型,有6个跨膜区和2个保守的NPA基序。亚细胞定位预测结果表明该基因位于质膜上。该基因启动子序列含有与逆境响应相关的顺式调控元件,而对7日龄的麦苗进行干旱和盐胁迫处理后,其qRT-PCR结果显示,干旱和盐处理5h后,TaNIP4-1基因在小麦叶片中的表达量明显上调;盐处理7d后,TaNIP4-1基因在小麦根部的表达量显著上调。由此可见,TaNIP4-1基因参与了小麦应对逆境的过程。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。