内生解淀粉芽孢杆菌CC09菌株在小麦叶部的定殖能力及其防治白粉病效果研究

利用抗利福平标记及平板菌落计数法,研究了内生解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CC09在小麦叶内和叶际的定殖能力,证明菌株CC09能够在小麦叶内和叶际以较高数量稳定定殖,叶际定殖量在喷雾后1 d达到最大(3.98×107 cfu/g),之后稳定维持在1.58×104~3.16×105 cfu/g;而叶内的定殖量7 d时达到最大(1.58×106 cfu/g)并维持稳定。另外,菌株CC09在小麦叶际和叶内的定殖受温度及其代谢产物的影响,温度越高,其叶际和叶内定殖量越高;菌体重悬液中添加相当于原发酵液中代谢产物含量1倍和4倍的浸膏能显著提高菌株CC09在小麦叶际和叶内的定殖;而接种量对菌株CC09的定殖无显著影响。琼脂培养法测定表明,菌株CC09发酵液及其无菌滤液对小麦白粉菌分生孢子萌发均有显著的抑制作用,导致孢子透明、变形甚至细胞破裂。室内盆栽试验表明,菌株CC09发酵液对小麦白粉病有很高的预防和治疗效果,15 d时防效为95%,是三唑酮的2.3倍,而其20倍稀释液的防效与化学农药三唑酮效果相当。以上研究结果表明菌株CC09是防治小麦白粉病的潜在生防菌株,具有良好的开发和应用价值。     

解淀粉芽孢杆菌X-278片剂的研制、定殖及田间防效

通过对不同载体、营养成分(碳源和氮源)及粘合剂的筛选,研制出了一种便于储存和运输、并可在棉花根部施用的解淀粉芽孢杆菌X-278(以下简称X-278)片剂,并测定了片剂的贮存稳定性;采用利福平标记法,测定了X-278片剂在棉花根、茎及根际土壤中的定殖能力;采用随机区组设计法研究了X-278片剂、X-278发酵液及枯草芽孢杆菌可湿性粉剂对棉花黄萎病的田间防治效果。结果表明:以硅藻土为载体,以质量分数为15%的葡萄糖为碳源,以质量分数为30%的花生饼为氮源,质量分数为20%的淀粉浆为粘合剂,通过干法压片得到了外观完整、光洁,色泽均匀且具有一定稳定性的X-278片剂,其含水量(质量分数)为0.5%,活菌含量为7.4×107cfu/g,未检测到有其他杂菌存在,各指标均符合标准;在棉花根部施用X-278片剂40 d后,X-278的最高定殖量在棉花根内为1.56×103cfu/g,在茎中为3.6×103cfu/g,在根际土壤中达3.8×106cfu/g,持效期达60 d;田间试验结果表明,X-278片剂对棉花黄萎病的防治效果均优于其发酵液及枯草芽孢杆菌可湿性粉剂,当X-278片剂施用量为0.6 g/株时,对棉花黄萎病的防效达到86.34%。     

海洋细菌解淀粉芽胞杆菌SH-27在大豆体内的定殖动态及促生防病作用

为明确海洋细菌SH-27在大豆体内的定殖动态及其促生长作用和对大豆疫病的防治效果,本研究采用抗利福平标记法和平板对峙生长法,筛选对利福平标记稳定且对大豆疫霉菌具有较好抑菌作用的标记菌株SH-27^Rif,培养10代后的标记菌株SH-27^Rif能够保持稳定,对大豆疫霉抑制率为56.92%。分别采用灌根和涂叶法研究其在大豆体内的定殖动态,灌根与涂叶法均可使标记菌株SH-27^Rif在大豆体内定殖,时间达31 d以上;灌根处理定殖量呈先升后降趋势,定殖量根 > 茎 > 叶,处理后第21 d根部定殖量达到最大（6.6×10⁵ cfu/g）;涂叶处理第1 d大豆叶片定殖量达到最大（6.3×10⁵ cfu/g）,随后呈迅速下降趋势;定殖量叶>茎,根部未检测到标记菌株SH-27^Rif。盆栽促生试验结果表明,菌株SH-27发酵液灌根处理第15 d,处理组株高、根长、茎粗、鲜重、干重、叶绿素含量、根系活力等指标均显著高于对照组。盆栽防病试验结果表明：菌株SH-27发酵液灌根处理能显著降低大豆疫病的病情指数,对大豆疫病3、5、7和9 d的防效分别为83.44%、66.34%、57.18%和52.85%。以上研究结果表明海洋细菌SH-27是防治大豆疫病的潜在生防菌株,具有良好的开发和应用价值。     

枯草芽孢杆菌B_3菌株对小麦根系和茎基部的定殖作用研究

本文研究了枯草芽孢杆菌Ｂ＿３菌株经种子处理后在小麦根系及茎基部的定殖能力和影响其定殖的可能因子。结果表明，Ｂ＿３在田间自然土壤中定殖小麦根系及茎基部的时间分别为６０天和４２天以上。培养不同时间的Ｂ＿３菌悬液处理种子表明，播后２２天内，培养２４小时的菌在小麦上的定殖量高于培养４８和７２小时。用ＮＢ培养的Ｂ＿３菌悬液经离心弃上清，并用新鲜ＮＢ液悬浮菌体后处理种子，在播后１９天，Ｂ＿３定殖量比不处理菌悬液的定殖量增加。Ｂ＿３与化学杀菌剂混合处理种子，以及土壤经灭菌处理均可增加Ｂ＿３在小麦上的定殖量。     

小麦内生有害细菌的定殖研究

 Minor Pathogens(微病原菌)作为植物病理学的又一概念,在最近的三十年中已为植物病理学家和研究人员普遍认可。其分布的广泛性和种群数量的优势引起人们日益强烈的关注,其在植株体内的活动更是人们想要了解的,为此我们利用悉生小麦通过透射电镜对其定殖转移进行了探索性的研究。     

芽孢杆菌绿色荧光蛋白标记及其在小麦体表定殖的初探

 将来自质粒pAD4412的启动子和绿色荧光蛋白基因gfpmut3a插入大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体pBE2,构建成芽孢杆菌表达载体pGF P4412,用其转化野生型生防芽孢杆菌83-6和A-47等8个菌株,均得到良好的发光表型。质粒稳定性实验表明重组质粒pG FP4412稳定性为92%。借助荧光显微镜对gfp标记的菌株A-47-gfp在小麦体表的定殖进行初步的研究。结果表明:A-47-gfp能够在小麦根际及小麦体表定殖(包括根表和茎叶表面);相对于在茎叶表面定殖的A-47-gf p在根表定殖的菌体与根的结合更为牢固;从根基到根尖A-47-gfp的定殖量有明显的减少趋势。     

生防解淀粉芽孢杆菌CC09合成iturin A条件的响应面优化

采用摇瓶发酵试验,比较了11种已用于芽孢杆菌合成环脂肽的培养基对解淀粉芽孢杆菌CC09产iturin A的影响,筛选适合菌株CC09产iturin A的主要营养成分。然后采用Plackett-Burman设计、中心组合设计和响应面分析等方法,优化培养基组成及发酵条件。获得了解淀粉芽孢杆菌CC09摇瓶发酵产生iturinA的最佳培养基组成为小麦粉14 g/L、黄豆饼粉25 g/L、玉米粉8 g/L、MgSO₄ 0.1 g/L、MnSO₄ 2.5 mg/L、FeSO₄ 0.8 mg/L;最佳发酵条件为装液量60 mL/250 mL、pH 6.0、28℃、125 r/min、48 h,在此条件下,生防解淀粉芽孢杆菌CC09合成iturin A的产量达501 mg/L,较优化前的138 mg/L提高了4.2倍,且发酵成本是利用改良LB培养基的4.3%。     

生防菌B1619在番茄根部的定殖及对根际微生态的影响

采用植物MS平板定殖研究法、盆栽试验和土壤酶活性检测技术研究了生防菌B1619在番茄根部的定殖规律,并评估了B1619对番茄根围土壤微生物和酶活性的影响。结果显示,生防菌株B1619在番茄根部定殖能力较强,在MS平板中,定殖量可达10⁸ CFU/g根以上。在盆栽试验中,常规土壤中或在接种青枯菌后,番茄根部生防菌的数量都呈现先下降后上升趋势,最后趋于稳定;在第15天时,定殖量达到10⁶ CFU/g根。番茄定植后,B1619对根围土壤中真菌和放线菌具有促进作用,而对细菌则表现为先促进后抑制作用。此外,B1619能够提高土壤蔗糖酶活性而抑制土壤脲酶的活性,B1619施用后第15天,蔗糖酶活性达226.3 mg/g土,比对照高88 mg/g土;土壤脲酶活性则与对照组截然相反,呈下降趋势。     

烟草赤星病拮抗菌的鉴定、定殖和防病效果研究

为寻找可有效防控烟草赤星病的生防菌资源,利用平板对峙法从四川凉山的烟叶上分离并筛选得到6株对烟草赤星病菌（Alternaria alternata）有拮抗作用的菌株,其中以菌株SYL-3的拮抗作用最强。结合形态学特征、生理生化特性、16S r RNA及gyrA测序分析,鉴定SYL-3为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。进一步研究发现,SYL-3对烟草赤星病菌、马铃薯早疫病菌、小麦赤霉病菌等16种病原真菌均有较强拮抗作用,能成功定殖于烟草叶面并进入维管束组织,在田间施用后对烟草赤星病的防效优于对照药剂菌核净。     

枯草芽孢杆菌B501在草莓根际的定殖及其动态变化

 草莓枯萎病(Fusaruim oxysporum f.sp.fragriae)是草莓生产上的重要病害,在连茬种植地块尤为严重,常常造成大幅减产或绝收。目前,除使用成本较高的剧毒农药溴甲烷熏蒸土壤可以连茬种植以外,尚无其它有效方法。     

蜡样芽孢杆菌ANTI-8098A在番茄内的定殖和对青枯病的防治研究

本文研究了生防菌ANTI-8098A在番茄植株内的定殖及其对青枯病的生防特性,采用激光共聚焦显微技术观察了GFP标记菌株ANTI-8098A:pCM20在番茄根系的分布.ANTI-8098A及其标记菌株可很好地定殖于番茄植株内,在根内定殖浓度最高,达104～105cfu·g-1,茎部、叶片内次之,达103～104cfu·g-1;ANTI-8098A处理后番茄根系PPO活性显著提高,对番茄叶绿素含量有短期效应;处理后5～15d番茄根际微生物数量略低于对照,其后逐渐与对照趋于一致;ANTI-8098A及其标记菌株对青枯病的防效存在一定差异,平均防效为57.1%～100%.     

海洋细菌解淀粉芽胞杆菌BA-3在兰花的定殖及对根际微生态的影响

为明确海洋细菌解淀粉芽胞杆菌BA-3在兰花根际的定殖特性,本研究采用抗生素标记法筛选出对利福平和卡那霉素稳定的菌株BA-3-K。平板对峙试验证明,菌株BA-3-K对兰花茎腐病抑菌率达86.91%,与原始菌株BA-3抑菌率87.69%无明显差异。采用灌根法和涂茎法证实了标记菌株BA-3-K能在兰花植株体内定殖达60 d以上。灌根处理表明,生防菌BA-3-K的定殖数量为土壤>根>茎,呈先升后降的趋势,第21d在根部和茎部达到最大分别为2.54×10^5和1.47×10^5cfu/g,在土壤中第15d达到最大6.50×10^5cfu/g,但叶部未检测到标记菌株BA-3-K;涂茎处理生防菌的定殖量茎>叶,第17 d在茎部达到最大2.33×10^5cfu/g,随后呈下降趋势,根部和土壤未检测到标记菌株BA-3-K;通过扫描电镜定性观察,发现BA-3-K可在植株茎部定殖。盆栽试验表明,菌株BA-3-K施用后,根际土壤中细菌、真菌和放线菌的数量明显高于对照处理。本研究表明海洋细菌BA-3有较强的定殖能力,具有良好的应用价值。     

内生解淀粉芽孢杆菌LP-5抗菌蛋白的分离纯化及特性

解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens LP-5是一株对梨黑斑病菌Alternaria alternata具有抑制作用的内生细菌,其产生的抗菌物质主要是抗菌蛋白.为明确该抗菌蛋白的理化性质,采用盐酸沉淀、DEAE-52层析和Sephadex G-100层析进行纯化,测定了所得抗菌蛋白对热、蛋白酶、紫外辐射及酸、碱的稳定性.结果表明:纯化的抗菌蛋白分子量为20.3 kD,等电点为6.33.该蛋白对高温敏感,100℃处理30 min,抑菌活性仅为对照的18.4%;对蛋白酶K和胰蛋白酶稳定,酶处理后的抑菌活性分别为对照的92.5%和88.9%;对紫外辐射稳定,照射12 h后抑菌活性仍达对照的92.5%;对酸稳定、对碱敏感,pH 13处理后抑菌活性下降为原有活性的74.1%.抑菌活性测定结果显示,该蛋白对梨黑斑病菌的孢子萌发和菌丝生长有明显抑制作用,可造成孢子萌发端泡囊化、菌体破裂、原生质外渗.     

香蕉枯萎病生防菌AF11的鉴定及其定殖研究

从健康大豆根系内分离出一株对香蕉枯萎病病原菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense Race 4（FOC Race4）有强拮抗效果的内生细菌AF11。盆栽防病试验结果表明其对香蕉枯萎病的防效达71.5%。形态特征、生理生化测定和16S rDNA序列及其系统发育树分析初步确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。从菌株AF11中筛选出抗利福平（100μg.mL-1）且对FOC Race 4拮抗活性稳定的变异菌株AF11Rif,采用灌根接种方法,研究菌株AF11Rif在香蕉体内定殖分布规律。试验结果表明,菌株AF11Rif能定殖于香蕉根部和茎部,接种50 d后根部定殖量为118 cfu.mg-1,茎部为32 cfu.mg-1。     

解淀粉芽孢杆菌的作用及其产品开发

植物保护是农业生产中重要的环节,它可以降低由病虫害带来的作物减产和品质降低。微生物农药是在环境压力下,化学农药最环保的替代品。解淀粉芽孢杆菌是一类重要的生防微生物,它能促进植物生长、保证作物健康,并且能改善作物根际微生物种群。解淀粉芽孢杆菌是国内外学者研究较多的微生物种类,在研究的同时也希望将解淀粉芽孢杆菌更多的应用的农业实际生产中。因此,微生物肥料、微生物种子处理剂、微生物杀菌剂和微生物保鲜剂产品应运而生。由于微生物农药自身存在的不足,人们也致力于开展提高其稳定性、速效性和防效的工作。目前主要通过剂型和助剂的选择来提高其稳定性,通过与其他微生物复配来拓展其功能,通过与化学农药复配来提高其速效性和防效。本文综述了近年来解淀粉芽孢杆菌产品开发的研究成果,探讨了未来提高其生防效果的产品开发方向。     

GFP标记的多粘芽孢杆菌1114在番茄根际的定殖

多粘芽孢杆菌Paenibacillus polymyxa菌株1114对多种植物病原菌具有良好的防治效果。为研究其在作物根际土壤中的迁移和定殖规律,通过电击转化引入绿色荧光标记质粒pB-SVG101,得到稳定表达的荧光标记菌株,转化后的菌株对青枯菌Ralstonia solanacearum仍保持良好的抑制效果。通过多种接种方法,发现该菌株能通过浸根的方式侵入番茄的维管组织和周围细胞。     

辣椒内生菌BS-2在白菜体内的定殖、促生和防炭疽病作用

辣椒体内的枯草芽孢杆菌BS-2菌株在白菜体内定殖、促生和防病作用表明:①用抗利福平标记BS-2r株浸种、浇灌土壤和涂抹叶片等方法接种,菌株均能进入白菜体内,并可在其全生育期内定殖;②菌液浸种24h后播种20天,其苗的鲜重比清水对照增加了91.20%～138.04%;③菌株对白菜炭疽病有较好的防治效果,但对不同时间接种病原菌的防治效果有所不同,以叶表面喷雾接种菌液后,立即接种病原菌的防效最好,其第3天和第6天的防效分别达95.12%和46.71%;而对接种菌液之前已接种病原菌的处理无防病效果.④菌株胞外分泌物对炭疽病菌菌丝生长、分生孢子产生与萌发均有很强的抑制作用.由此可见,来自辣椒体内的枯草芽孢杆菌BS-2 菌株不仅可在白菜体内定殖传导,而且对白菜有明显的促生作用,同时对炭疽病还有良好的防治作用.     

内生解淀粉芽孢杆菌BEB17脂肽类和聚酮类化合物的抑菌活性分析

BEB17是本实验室从健康香蕉植株根部中分离得到的一株具有较强抑制真菌活性的内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。在本研究中,我们通过PCR检测多个脂肽类和聚酮类化合物的合成相关基因,并结合基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析,发现该菌株能产生表面活性素Surfactin、泛革素Fengycin和伊枯草菌素Iturin三类脂肽类化合物以及Bacillibactin、Difficidin和Bacillaene三类聚酮类化合物。通过比较两种发酵培养基(M9和Landy培养基)和两种提取方法(酸沉淀法和大孔树脂抽提法),结果发现酸沉淀法提取较为高效,Landy培养基更易于BEB17脂肽类和聚酮类化合物的发酵。活性检测表明,两种提取方法提取的粗提物对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4,Foc4)都具有较好的抑制作用,其中大孔树脂抽提法提取的物质抑制效果最好,当其浓度为300μg·m L-1时抑制率可达80.75%,说明该方法制备的粗提物的活性物质含量相对较高。进一步研究表明,该提取物能引起Foc4菌丝膨大和畸形,并抑制其孢子萌发。分析表明,该提取物对Foc4细胞膜具有破坏作用。     

枯草芽孢杆菌B-332菌株对稻瘟病的防治效果及定殖作用

为了进一步明确枯草芽孢杆菌B-332菌株对稻瘟病的生防作用,分别对盆栽水稻的防治效果、防治适期、标记菌株在水稻上的定殖作用及田间的防治效果进行了考察。结果表明,在盆栽水稻活体生物测定中,B-332的芽孢菌体悬浮液及发酵上清液对稻瘟病均表现出较好的防治效果(50%以上),且当菌液与上清液混合后其防治效果有加和作用。该菌株对稻瘟病的防治作用主要体现在预防,其预防叶瘟的效果与接种稻瘟病菌时叶面已定殖的B-332菌株的数量有关,接种时水稻叶面上定殖的菌量为1.25×104cfu/mm2时,其防治效果可以达到45%。在人工大量引入的情况下,该菌能够在水稻叶面上有效定殖达21天以上,并且在叶面有10%病斑的情况下,检测到的标记菌株数量会更多。田间试验结果表明,芽孢浓度在1×108cfu/mL时,该菌株对水稻穗颈瘟的防治效果达57.2%,增产率达9.6%,且浓度在5×108cfu/mL时对螃蟹无毒性。