中国4个弓形虫虫株GRA6基因的比较分析

 通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株，以及国际标准强毒株RH株的致密颗粒抗原（GRA6）基因进行PCR-RFLP分析，首次对中国弓形虫虫株进行了基因分型研究，旨在了解中国弓形虫基因型的分布情况，从而为进一步的分子遗传学研究以及弓形虫病的防制提供资料。PCR-RFLP分析显示两种带型：RH、SH、CN 3株弓形虫为一种带型，QH和ZS 2株弓形虫为另一种电泳带型。GRA6序列分析结果显示：RH、SH、CN 3株弓形虫的GRA6基因序列上的MseΙ酶切位点与国外报道的RH株一致，同属于基因型Ι，为强毒株；QH和ZS 2株弓形虫的MseΙ酶切位点与国外报道的弱毒株BEVERLEY株和ME49株一致，同属于基因型Ⅱ，与PCR-RFLP分析结果一致。除MseΙ酶切位点外，中国的几个虫株GRA6序列与GenBankTM注册的RH株及BEVERLEY和ME49两个弱毒株有个别碱基的差异。结果证明中国人源弓形虫包含了Ι、Ⅱ两种基因型，而动物源性弓形虫则因宿主和来源地不同亦有Ι、Ⅱ两个基因型。     

中国家蚕抗菌肽基因的PCR扩增,克隆和序列测定

本实验采用ＰＣＲ技术，扩增中国家蚕抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因片段，并以ＰＵＣ１９质粒为载体，将该基因片段转化到大肠杆菌中。从筛选得到的阳性克隆中分离出ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因，测定其序列，并由此推导出氨基酸序列。结果表明：（１）抗菌肽ｃｅｃｒｏｐｉｎＢ基因片段长为８６６ｂｐ，包括７３ｂｐ的ＥｘｏｎＩ，５５６ｂｐ的Ｉｎｔｒｏｎ，８７ｂｐ的ＥｘｏｎⅡ和１５０ｂｐ的３’端非编码区。其中，非内含子部分的碱基序列与已克隆的日本家蚕的两个ｃｅｒｏｐｉｎＢｃＤＮＡ序列比较，同源性分别为８７．５％和９５％；（２）推导出的成熟抗菌肽由３７个氨基酸残基组成，其氨基酸序列与日本家蚕和天蚕的氨基酸序列相比较，同源性为９１．９％和８０．６％。     

有齿食道口线虫ITS及5.8S DNA片段的PCR扩增、克隆及序列分析

 运用PCR方法以保守引物NC5及NC2扩增了从广东阳江地区猪体分离的食道口线虫rDNA 的内转录间隔区（ITS）及5.8S序列。将PCR扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，用PCR技术及酶切鉴定阳性菌落，对阳性菌落质粒DNA进行测序。结果表明，扩增的片段大小为828 bp，包含部分的18S、28S及全部的ITS-1（362 bp）、5.8S(153 bp)及ITS-2（217 bp）序列。序列比较表明，该食道口线虫为有齿食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪有齿食道口线虫的ITS及5.8S序列，为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。     

东乡野生稻重复序列的克隆分析及染色体定位

从东乡野生稻(O ry za ruf ipogon G riff)中克隆到7个重复序列,序列分析表明:这些序列是与转座因子有关的序列。以序列H 2为探针,对不同基因组水稻进行Southern杂交,表明该序列为稻属内AA基因组特异的重复序列。其分布在水稻的多条染色体上,荧光原位杂交(F ISH)结果显示该重复序列主要位于染色体的着丝粒以及端粒附近,重复单位序列长度为615 bp左右。并就特异重复序列在水稻研究中的应用进行了讨论。     

猪生长激素(PGH)基因全序列扩增及序列分析

筛选了一对扩增PGH基因全序列的引物,用PCR法成功地扩增了PGH基因全序列,并对扩增产物进行了序列多态性分析。结果表明,与Vize等1987年公布的序列存在57bp的差异,同源性为97．19％;5个外显子间有3bp的不同,同源性达99.54%。     

抗菌肽Protegrin-1基因的PCR扩增和克隆及序列分析

从杜长嘉猪的骨髓中提取基因组RNA,用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增抗菌肽Protegrin-1(PPG-1)基因,获得一条565 bp的片断,以pGEM-T Easy vector为载体,将该基因片断克隆到大肠杆菌中.从筛选到的阳性克隆中分离出Protegrin-1基因,测定其序列,并由此推导出氨基酸序列.结果表明:①该片断长565 bp,为Protegrin-1基因cDNA的部分序列,序列同源性比较表明,该基因序列与GeneBank登录的Protegrin-1基因序列具有较高的同源性,达到98.8%.②根据所测序列推导其成熟肽由18个氨基酸残基组成,其氨基酸序列与GeneBank登录的Protegrin-1的成熟肽序列完全一致.     

通过PCR技术简单扩增奶牛高GC含量的rDNA重复序列

为了探索利用PCR简单扩增高GC含量的长重复序列的方法，经反复摸索后选用LAPCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液Ⅱ来扩增奶牛高GC含量的长片段重复序列，成功获得了全长2538bp，GC含量为65．7％的DNA序列，其中ITS1的GC含量高达80％．探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用等措施．     

利用基于重复序列PCR的标记和A-PAGE鉴定小麦背景中的黑麦染色体片段

利用基于重复序列PCR的标记和酸性丙烯酰胺凝胶电泳（A-PAGE）对小麦品种中国春与秦岭黑麦杂交后代（BC2F4）共75份材料进行了筛选,鉴定含有黑麦成分的株系。根据黑麦特异重复序列pSc20H设计特异引物,用PCR方法从75个株系中筛选出30份含有黑麦成分的材料。从这30份材料中,用A-PAGE的方法鉴定出10个株系为1RS／1BL易住系。实验结果表明,用基于PCR的标记能快速准确地对小麦背景中外源染色质的鉴定。结合其它方法还能进行小片段移位的鉴定。     

黑麦染色体组中一个新重复序列的发现、定位与应用

 【目的】寻找黑麦基因组中新的重复序列作为特异PCR标记。【方法】以普通小麦中国春、川农18、育成品系R111、绵阳11为对照，以荆州黑麦、秦岭黑麦、非洲黑麦、森林黑麦为材料，用RAPD法筛选到黑麦基因组中的一个高拷贝DNA片段OPD15940，将OPD15940输入到NCBI的BLAST框中进行比对。根据OPD15940设计特异PCR引物D15F和D15R，利用这对引物对小麦族物种进行扩增，验证OPD15940的特异性。进而利用原位杂交技术定位pScD15940在染色体上的位置。【结果】序列比对后发现OPD15940与重复序列Sukkula中近60个53bp的小片段有较高的同源性，但又不同于Sukkula，是一类新的重复序列。通过特异PCR确定仅含黑麦染色质的物种能扩增出OPD15940，因而OPD15940为黑麦所特有。原位杂交结果显示除端部区域外，pScD15940弥散状分布在黑麦整套染色体上。【结论】OPD15940可以作为分子标记检测导入到小麦背景中的黑麦染色体。     

伪狂犬病毒上海株糖蛋白G(gG)基因的克隆及序列分析

应用PCR方法从PRV SH（上海株）病毒培养物扩增了gG基因，克隆入pCDNA3质粒，并进行了序列测定。结果表明，扩增的gG基因片段长1719bp，包含一个1491bp的开放阅读框（ORF），在起始密码子上海有TATAAAA盒。在终止密码子下游有AATAAA的poly(A)尾，编码由496个氨基酸组成的蛋白质。与Rice株相应的gG片段相比，核苷酸序列同源性达97.1%。但推导的氨基酸序列同源性仅有87.6%。主要是在编码区内插入和缺失核苷酸。出现了突变和移码，导致氨基酸序列同源性降低.gG具有膜蛋白的结构特点。     

伪狂犬病毒粤A毒株TK基因的扩增、克隆与序列测定

以华南农业大学兽医学院传染病教研室分离的伪狂犬病毒粤A毒株（PRV YA）的基因组为模板，利用聚合酶链反应（PCR）扩增TK基因，获得预定大小的片段，将这一自然克隆到PMD18－T载体中。对重组质粒PMD18－TK进行PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。     

广东株家蚕微孢子虫特异DNA片段的克隆与序列分析

利用碱裂解方法抽提广东株家蚕微孢子虫(Nosema bombycis Naeegeli，N．b．)基因组DNA，通过PCR技术扩增得到了N．b．的一段特异DNA片段。对该目的片段的序列分析发现，该特异DNA片段大小为317bp，与Malone等报道的日本株N.b．特异DNA片段大小一致，但核苷酸序列同源性仅为92．1％。     

菊芋凝集素基因组片段的PCR扩增及克隆

通过PCR扩增 ,获得了菊芋凝集素基因 (hta)的编码区基因组片段hta - g。DNA序列分析表明 ,PCR产物长 70 2bp ,包括 444bp的编码区序列 ,编码区被一个 2 5 8bp的内含子分成 2个长度分别为 2 1 0bp及 2 34bp外显子 ,内含子边界序列符合GT/AG规则。与htacD NA序列的比较分析表明 ,hta - g的编码区序列与htacDNA序列高度同源 ,同源性在 93%～98%。     

白羊草肌动蛋白基因片段的克隆及序列分析

根据几种禾本科植物肌动蛋白基因的保守序列设计一对简并引物,以白羊草(Bothriochloa ischaemum)幼叶总RNA为模板,采用RT-PCR方法克隆获得一个肌动蛋白基因cDNA片段,命名为BiACT,该基因片段长度为720bp,编码240个氨基酸残基。氨基酸比对分析结果表明,BiACT基因编码的氨基酸与其他植物肌动蛋白的氨基酸序列具有较高的同源性。     

元宝枫CHS基因片段的克隆及序列分析

[目的]对元宝枫叶片查尔酮合成酶(CHS)基因片段进行克隆及序列分析.[方法]以元宝枫的红叶新品系1～6号为试材,采用CTAB法提取其夏季与秋季叶片总RNA,搜索GenBank数据库中已报道的CHS基因序列,BLAST比对,然后用DNAMAN、Primerpremier5软件设计兼并引物来扩增其目的片段,采用RT-PCR方法扩增CHS基因片段并连接到pMD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序.[结果]得到一段1 365 bp的序列,序列分析表明,该片段编码365个氨基酸,与鸡爪槭、毛果槭的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸序列同源性在90％以上.[结论]该研究首次从元宝枫中克隆出了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

木豆Actin基因片段的克隆及序列分析

根据大豆Actin基因的保守序列设计一对引物Primer 1和Pri mer 2,以木豆叶片总RNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出Actin基因片段并克隆到PMD-18T载体。阳性克隆经PCR检测后测序,序列分析结果表明,该片段长302bp,编码100个氨基酸;所得序列与GenBank中注册的其他植物Actin基因核苷酸序列的同源性均在89%以上,其中与大豆的同源性达94%;与氨基酸序列的同源性均在90%以上。     

甘蓝型油菜oleosin基因片段的克隆及序列分析

以油菜(Brassica napus)基因组DNA为模板,通过设计一对特异性引物,利用多聚酶链式反应(PCR)扩增获得oleosin基因片段。将其克隆到E.coli质粒上进行序列分析。结果表明,该基因由878个碱基组成,含一个内含子,编码193个氨基酸。不计附加的18bp凝血酶切割序列,与已报道的序列相比较,核苷酸序列及推导出的氨基酸序列的同源性分别为79.20%和91.21%。推测的氨基酸序列构成的蛋白质具有oleosin的基本结构特点,包含3个结构区域:两性N末端区(anamphipathicN-terminalre鄄gion),中心疏水区(acentralhydrophobicdomain),两性C-末端区(anamphipathicC-terminaldomain)。     

“冷俊”槭查尔酮异构酶基因(CHI)片段克隆及序列分析

以槭树品种"冷俊"为试材,利用RT-PCR技术,根据GenBank中登录的相关物种查尔酮异构酶基因(CHI)的保守序列设计简并引物,提取其秋季变色期叶片中的总RNA并扩增出CHI基因的cDNA片段。测序结果表明,该片段长553 bp,编码183个氨基酸。序列分析表明,该片段与龙眼、橄榄、山茶、沙梨等的同源性在81%～90%以上,证明已成功克隆到槭树变色期叶片CHI基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为KC121346。     

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.