猪支气管败血波氏杆菌PCR诊断方法的建立及应用

根据支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）鞭毛蛋白基因的上游序列设计了1对引物flal和fla2，扩增出大小为237bp的目的基因片段，建立了快速检测支气管败血波氏杆菌的PCR方法。特异性和敏感性试验表明，该方法对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和D型多杀性巴氏杆菌均无交叉性反应；最低能够检出112．5pg的模板DNA。用该PCR法检测了从延边州采集的48份表现不同临床症状的猪鼻黏液；结果，检出支气管败血波氏杆菌阳性42例，阳性率为87．5％。同时与传统的细菌检查法、微量凝集法进行了比较；结果显示，该PCR法的检出率是细菌检查法的5．25倍，是微量凝集法的1．75倍。     

兔支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及耐药基因检测

本试验旨在了解近年来浙江省兔支气管败血波氏杆菌的感染情况及耐药状况,指导合理用药,检测细菌的耐药基因,探究其耐药机理.根据细菌形态、培养特性、生化试验,结合PCR法对分离菌株进行鉴定;K-B纸片扩散法检测细菌对18种常用抗生素的耐药率;设计耐药基因特异性引物,PCR法扩增耐药基因,并进行测序分析.结果显示,分离鉴定出2012-2014年22株兔支气管败血波氏杆菌;药敏结果显示,分离菌对青霉素G、头孢拉定、链霉素、林可霉素、克林霉素、甲氧嘧啶耐药严重,对多黏菌素B、左氟沙星、强力霉素、四环素等药物敏感,耐β-内酰胺类药物的细菌中检测到耐药基因bla_TEM.结果表明,兔支气管败血波氏杆菌是引起兔呼吸道疾病的主要病原菌,分离菌多重耐药,耐药率较高,检测到的耐药基因与耐药表型相符.     

兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank公布的兔多杀性巴氏杆菌16S r RNA和支气管败血波氏杆菌fim N基因序列,设计两对引物,在建立两种细菌单项PCR检测方法的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了两种细菌的双重PCR检测方法,用这两对引物对同一样品中的兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌核酸为模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的258bp和449bp的特异性片段,而对其他4种兔病原菌的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,对兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的最低核酸检出限分别均为1pg。通过对78份临床病料检测,将建立的双重PCR技术和单项PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的同时检测和鉴别诊断。     

兔支气管败血波氏杆菌PCR快速检测方法的建立及应用

参考GeneBank中支气管败血波氏杆菌fimN基因序列设计了一对特异性引物,扩增出大小为387bp的目的基因片段,优化PCR反应条件,建立了兔支气管败血波氏杆菌的PCR快速检测方法。特异性和敏感性试验显示,该方法与大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、魏氏梭菌和巴氏杆菌均无交叉反应,且检出最低浓度为10pg,可用于临床检测。     

禽波氏杆菌分离株的16S rRNA基因序列分析

采用PCR方法对本实验室分离保存的10株禽波氏杆菌、3株兔支气管败血波氏杆菌及1株猪支气管败血波氏杆菌菌株,扩增其16SrRNA基因的5′端片段（783bp）,并测定所得片段的DNA序列。用DNAStar分析软件将所获得的序列与GenBank中的禽波氏杆菌序列进行比较,由此构建禽波氏杆菌菌株的系统发育树。结果显示,10株禽波氏杆菌核苷酸序列与GenBank中收录的AF177666株禽波氏杆菌核苷酸序列的同源性为82.0%～82.5%,与兔支气管败血波氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌核苷酸序列的同源性均为99.2%～99.9%,其中P9（山鸡波氏杆菌）、P11（兔支气管败血波氏杆菌）与P14（猪支气管败血波氏杆菌）分别发生1个核苷酸的缺失。本试验结果表明,16SrRNA序列分析是鉴定禽波氏杆菌的一种快速而准确的方法。     

快速检测兔支气管败血波氏杆菌环介导等温扩增(LAMP)方法的建立及应用

利用Primer ExplorerV4软件,针对兔波氏杆菌16S rRNA基因设计4条LAMP引物,优化反应条件,检测特异性、敏感性并对临床样品进行检测.结果显示,LAMP反应在62℃恒温扩增1h即可完成,操作简便,不需要PCR仪等复杂仪器,结果可经电泳检测及肉眼观察;具有良好的特异性;敏感性为普通PCR的100倍,最低可检测到1.65×10-6 mg/L的细菌基因组DNA.用建立LAMP检测方法对32份疑似兔支气管败血波氏杆菌(Bb)样品检测呈阳性,与PCR检测结果相符.该方法的建立为Bb的临床快速检测提供了新的思路.     

应用16S rRNA基因测序法鉴定兔支气管败血波氏杆菌的研究

应用16S rRNA基因测序法对兔支气管败血波氏杆菌Bb-1株进行了16SrRNA基因序列分析。结果表明,能够扩增出与预期结果相符合的片断。经Blastn比较,分离菌与兔支气管败血波氏杆菌RB50株（BX640449）同源性为99．8％。进一步的生化实验鉴定表明,Bb-1株生化反应结果符合兔支气管败血波氏杆菌生化反应特征。综合各种实验结果表明,分离菌Bb-1株为兔支气管败血波氏杆菌。     

应用23S rRNA对禽波氏杆菌分离株的进化分析

通过PCR扩增分离保存的8株禽波氏杆菌、3株兔支气管败血波氏杆菌及1株猪支气管败血波氏杆菌菌株的23S rRNA基因的片段(710bp),分别克隆到载体pMD18-T后测序。利用BLAST工具进行同源性搜索;用DNAStar分析软件进行同源核苷酸序列的多重比较分析并构建禽波氏杆菌菌株的系统生物进化树。结果显示,8株禽波氏杆菌核苷酸序列之间同源性为99.2%～99.7%,与GenBank中收录的NC_010645株禽波氏杆菌核苷酸序列同源性为92.4%～92.5%,与兔支气管败血波氏杆菌和猪支气管败血波氏杆菌的核苷酸序列同源性均为98.5%～99.2%。国内分离的禽波氏杆菌菌株和支气管败血波氏杆菌菌株均与国外分离菌株在遗传基因上有一定的差异。结果表明,23S rRNA序列分析可以作为鉴定禽波氏杆菌的一种快速简便的方法。     

支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为建立支气管败血波氏杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,本研究根据波氏菌属毒力基因DNT设计一对特异性引物,通过优化,确定最佳反应条件,建立了支气管败血波氏杆菌荧光定量PCR检测方法。并对其进行敏感性、特异性、重复性试验以及临床样品的检测。以支气管败血波氏杆菌标准质粒为模板,建立标准曲线结果显示:标准品浓度在1.13×10~8拷贝/μL～1.13×10~2拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,相关数R~2=0.997;该方法的灵敏度可达1.13×10~1拷贝/μL。建立的荧光定量PCR方法与副猪嗜血杆菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌等12种细菌和伪狂犬病毒、猪瘟病毒等4种病毒无交叉反应,具有良好的特异性;批内变异系数(CV)均小于2%,批间变异系数均小于4%,具有良好的稳定性。对临床样品的检测结果显示该方法检测的阳性率为57.7%,与普通PCR的符合率为93.24%。本研究建立的方法可以用作支气管败血波氏杆菌感染的早期诊断、快速检测与定量分析。     

兔支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定

应用16S rRNA基因测序法对兔支气管败血波氏杆菌标准株和分离的5株波氏杆菌进行了16S rRNA基因序列分析。结果表明,5株分离菌与标准株同源性在99.4%~100%之间。后经Blast分析各分离株与已发表的32株波氏杆菌同源性均在98%以上。进一步的生化试验鉴定表明标准株与分离菌株生化反应结果均符合兔支气管败血波氏杆菌生化反应特征。综合各种试验结果表明5株分离菌株均为兔支气管败血波氏杆菌。     

猪源支气管败血波氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

本试验从河南省多个养猪场采集有明显呼吸道症状的猪肺脏和鼻拭子,进行支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)的分离鉴定,通过病原的分离、培养对分离菌株进行形态观察、培养特性和生化试验鉴定,以及用支气管败血波氏杆菌flaB基因的特异性引物进行PCR鉴定,结果表明,有8株分离菌株扩增出了237 bp的特异性目的条带,结合形态观察及生化试验鉴定,确认成功分离到了8株猪源性支气管败血波氏杆菌;药敏试验结果显示,分离菌株对强力霉素、氯霉素、氟苯哒唑、氧氟沙星、四环素、卡那霉素、庆大霉素、奈丁酸和阿米卡星高度敏感。     

Detection of type III secretion system genes in animal isolates of Bordetella bronchiseptica

A cosmid clone bank of Bordetella bronchiseptica genomic DNA was screened for the presence of type III secretion (TTS) genes using a probe derived from the TTS system genes of Ralstonia solanacearum. A 3.35kb PstI fragment, sub-cloned from a hybridising cosmid clone, was sequenced and found to contain a 97bp overlap with the previously reported B. bronchiseptica bscIJKLNO TTS gene cluster. DNA and predicted protein homology analysis suggests that a bscPQRST cluster lies immediately downstream of bscIJKLNO. A PCR amplification assay indicated that the bscT locus was present in 27 B. bronchiseptica animal isolates tested (100%). Dot-blot DNA hybridisation using probes for bscT and bscP confirmed the presence of these loci in six canine isolates associated with a variety of clinical signs. Although TTS has been implicated in the pathogenicity of B. bronchiseptica, it is likely that different clinical manifestations may be due to variations in gene expression or host factors, rather than the absence or presence of TTS genes.     

动物园野生动物支气管败血波氏杆菌的分离鉴定与系统发育树的构建

采用Biolog和16SrRNA基因序列分析法对分离自北京动物园的8株支气管败血波氏杆菌进行了鉴定。菌株经纯化培养,用Biolog微生物鉴定系统进行了鉴定,结果表明,8株菌株为支气管败血波氏杆菌。菌株经纯化培养,采用菌落PCR方法进行16SrRNA基因序列扩增,扩增产物纯化后直接进行测序。序列经人工校对后用ClustalX1.83软件进行比对分析,最后用Mega3.1软件构建系统发育树,系统发育分析结果表明,8株菌株与支气管败血波氏杆菌DSM10303的同源性达到了99.9%,并在同一个分支内。     

产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重PCR检测方法的建立

为建立快速特异的PCR方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌,本研究根据GenBank登录的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和toxA毒素基因序列,设计合成了2对特异引物。特异性试验表明产毒素多杀性巴氏杆菌C51-6扩增出了460bp和1854bp的2条目的片段,而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性;敏感性试验表明该PCR方法能从含450CFU的菌液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验对该PCR方法进行了验证。     

猪萎缩性鼻炎支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立

对表现猪萎缩性鼻炎临床症状的猪群中分离得到的34株支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb),采用针对Bb flagellum gene的一对引物进行PCR扩增,结果所有分离物均能扩增出237bp特异性DNA条带,与传统生化鉴定结果相一致,且其最小检出量为0.64pg;而猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌及大肠埃希氏菌均未能出现任何DNA条带。这表明,本试验建立的PCR方法具有特异性强、灵敏度高、可靠性好等特点,可用于猪萎缩性鼻炎的临床诊断。     

驽巴贝斯虫病PCR检测方法的建立和应用

根据驽巴贝斯虫(Babesia caballi)18S rRNA基因序列设计1对特异性引物,扩增出452 bp核苷酸片段,建立了检测驽巴贝斯虫病的PCR方法。敏感性试验结果表明,该方法最低能检出0.01 fg/μL驽巴贝斯虫DNA模板。特异性试验结果显示,在被检测的6个巴贝斯虫株中,仅驽巴贝斯虫株能扩增出特异性片段,马泰勒虫、双芽巴贝斯虫、莫氏巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、大巴贝斯虫的扩增结果均为阴性。对45份马属动物血样进行检测,本研究建立的PCR方法测得驽巴贝斯虫病的阳性率为26.67%(12/45),与显微镜检测方法进行了比较,结果显示PCR检测方法可显著提高驽巴贝斯虫的检出率。     

3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa,P.aeruginosa)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,K.pneumoniae)的三重PCR检测方法.根据金黄色葡萄球菌nuc基因、绿脓杆菌toxR基因、肺炎克雷伯杆菌PhoE基因设计并合成引物,在单一PCR条件基础上优化建立三重PCR反应条件,并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验.结果显示,3对引物均能特异性扩增出目的条带,大小分别为484、278和368 bp.最佳退火温度在56~59 ℃之间,引物浓度均为0.2 μmol/L,dNTP浓度为200 μmol/L,Mg²⁺浓度为2.5 mmol/L.3种细菌间无交叉反应.对支气管鲍特杆菌等其他8种实验动物常见致病菌均无交叉反应.最低能同时检测到10^-5 ng/μL的细菌基因组DNA.3次重复结果一致,表明建立的三重PCR方法重复性好.同时采用细菌分离培养法和三重PCR方法对30份实验小鼠样本进行检测,对比结果显示三重PCR方法检出率略高于细菌分离培养法,细菌分离培养法呈阳性的样品,三重PCR方法均能检出.结果表明,本试验建立的三重PCR检测方法具有特异、敏感、高效等优点,为实验动物细菌快速检测和流行病学调查提供了技术支持.