大肠杆菌高密度发醇研究

高密度发酵是现代发酵工程的一顶新技术，能显著提高大肠杆菌菌体和基因工程产品的产量。我们就影响大肠杆菌高密度发酵的因及其控制、发酵方式的选择和发酵终点判断及异常发酵处理进行了简要讨论，并对大肠杆菌的高密度发酵进行了展望。     

禽大肠杆菌高密度发酵与溶氧关系的研究

利用GUJS—10C小型发酵罐分批培养禽大肠杆菌，通过平板计数、比浊计数的方法，对大肠杆菌高密度发酵中细菌生长与溶氧的关系进行分析。结果表明：溶氧的规律性变化能够反映大肠杆菌生长的规律，即在细菌生长的适应期细菌数量较少，耗氧量少，溶氧曲线最高；随着发酵时间的增加，细菌不断增多，耗氧量也随之增加，溶氧曲线下降；达到对数生长期，曲线最低；进入稳定期，曲线趋于平稳；到发酵后期，细菌进入衰老期，溶氧曲线略有上升，这时可终止发酵。     

高密度发酵工艺的研究

随着基因重组技术的不断发展,越来越多的外源基因得以在微生物中表达,以便大量快捷地获得外源基因产物或改变微生物的代谢特性。与其它表达系统相比,高密度发酵表达系统因具有易培养、遗传学背景清楚、表达水平高、培养周期短等特点,成为目前应用最为广泛的表达系统。工业生产发酵的基本目标是以最低的成本获得最高的细胞或其产物收益,因此大规模高密度培养微生物的技术和工艺变得越来越重要。高密度培养涉及到培养基组成、培养条件等诸多方面。作者在此就大肠杆菌高密度培养的影响因素、培养方法及基因工程技术。就基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术等因素进行了研究;分析了这些因素对目的蛋白表达的影响;介绍了基因工程菌高密度发酵领域的一些研究进展。在大肠杆菌高密度培养中的最新应用进行简要综述。     

猪K88、K99、987P、F41埃希氏大肠杆菌高密度发酵培养技术的初步探讨

采用高密度发酵和普通深层通气两种方法培养含K88、K99、987P、F41菌毛抗原的四株猪埃希氏大肠杆菌,对其培养液进行活菌数、OD值、pH值、效价的测定。实验结果表明,运用高密度发酵方法培养,各菌活菌数可达4.1×1010~4.9×1010CFU/mL,效价为211~213;运用普通深层通气方法培养,各菌活菌数为0.51×1010~0.59×1010CFU/mL,效价为24~25,可选择高密度发酵方法替代普通深层通气方法培养,用于制备猪埃希氏大肠杆菌K88、K99、987P、F41四价菌毛提纯苗。     

重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基优化和高密度发酵

为提高重组蛋白的生产效率,利用响应面试验设计技术,对表达猪肺炎支原体P46蛋白的重组大肠杆菌DE-pET-P46的培养基进行了优化,确定了培养基各营养成分及其最佳配比。在相同培养条件下,优化培养基比LB培养基的菌体浓度高出一倍。在生物反应器中利用优化培养基发酵培养该重组大肠杆菌,培养物的湿菌重达39.5 g/L。SDS-PAGE电泳结果显示,高密度发酵对重组大肠杆菌DE-pET-P46的rP46的表达和占细胞总蛋白比例均没有明显的改变。     

新生猪腹泻大肠杆菌K88K99双价基因工程疫苗

中国农科院哈尔滨兽医研究所的科研人员利用现代基因工程技术手段,人工构建出非产肠毒素性且具有K88 K99两种保护性抗原的大肠杆菌菌株,通过接种于适宜培养基发酵高密度培养,成功试制出了新生猪腹泻大肠杆菌K88 K99双价基因工程疫     

鸭大肠杆菌制苗用基础种子的建立及高密度发酵培养试验研究

从定型的优势血清型菌株中选择了2株,制备了基础种子,并对基础种子第1代、第10代和第13代的传代细菌的培养特性、免疫原性以及毒力进行了测定。结果证明,鸭大肠杆菌GX-5株和GX-21株的基础种子传至13代,其培养特性、免疫原性和毒力均不发生变化,表明这两个分离株是良好的疫苗生产菌株,为建立种子批提供了依据。本试验还进行了鸭大肠杆菌高密度发酵试验,获得了鸭大肠杆菌在马丁肉汤培养基中的最佳发酵条件,即发酵温度37.5 ℃,pH 7.4,初糖浓度10 g/L,补糖量为10 g/L,接种量为4%,通气量为1 L/L·min,搅拌转速为200 r/min,培养12 h后得到的发酵菌液浓度最高,D_{600 nm}值达到30.32。本研究为鸭大肠杆菌抗原的规模化生产奠定了基础,也为新疫苗的研制和开发提供了基础材料。     

微生物发酵床猪舍不同发酵等级垫料中大肠杆菌的分离鉴定

为了研究微生物发酵床不同发酵等级垫料中大肠杆菌的分布及其特性,试验采集了微生物发酵床猪舍不同发酵程度的垫料,进行大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验,分析了发酵床中大肠杆菌的致病性和抗生素抗性。试验结果表明,在10^-5稀释倍数下,仅在垫料发酵级别为一级的垫料中,即垫料使用时间较短、发酵程度较低（0<△E≤7.63）的条件下,分离到41株大肠杆菌;而在发酵程度较高的垫料中,即垫料发酵程度二级以上（△E>7.63）的环境中未分离到大肠杆菌。随着发酵的进行,发酵床中大肠杆菌数量逐渐减少。41株大肠杆菌中含有致泻性大肠杆菌15株,其中具有热稳定肠毒素（astA）基因的大肠杆菌9株,占总数的22%,含耐药性因子（sepA）基因的大肠杆菌2株,占总数的4.8%;耐强力霉素的大肠杆菌11株,占总数的27%。含有sepA基因的大肠杆菌具有强耐药性。从以上结果来看,微生物发酵床对猪舍大肠杆菌具有抑制作用,可为发酵床的推广应用及垫料再利用提供一定依据。     

新生猪腹泻大肠杆菌K88K99双价基因工程疫苗

中国农科院哈尔滨兽医研究所的科研人员利用现代基因工程技术手段,人工构建出非产肠毒素性且具有K88 K99两种保护性抗原的大肠杆菌菌株,通过接种于适宜培养基发酵高密度培养,成功试制出了新生猪腹泻大肠杆菌K88 K99双价基因工程疫苗。该疫苗于1990年荣获中国农科院科技进步一等     

应用发酵罐高密度生产日本血吸虫重组蛋白Sj28GST工艺的研究

为了大量表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,本文采用葡萄糖作为碳源,在不同的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时间等培养条件下进行高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST,分别用Bradford法和比浊法分析重组蛋白Sj28GST的浓度和重组大肠杆菌的密度.优化应用发酵罐高密度发酵表达日本血吸虫重组蛋白Sj28GST的培养温度、种子液接种量、IPTG浓度、IPTG诱导时机等培养条件.研究结果表明,在培养温度37℃、种子液接种量7%、溶解氧浓度保持20%以上、pH 7.2左右、用0.7mmol/L IPTG在重组大肠杆菌TB1开始培养后5 h进行诱导,细菌密度明显提高,获得的重组蛋白Sj28GST的表达产量最高,为74.32 mg/L发酵液,菌体密度达到13 OD左右.     

毕赤酵母基因工程菌高密度发酵及其应用研究

构建重组毕赤酵母基因工程菌表达外源目的产物是获取新生物制品的有效途径,高密度发酵是实现这些产品规模化、低成本生产的关键技术。文章对影响毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的因素和调控措施(如基因工程菌、培养基、生长阶段菌体密度及比生长速率),以及发酵过程中参数调控和毕赤酵母基因工程菌高密度发酵的应用等进行了综述,并提出该体系存在的问题。     

大肠杆菌高密度发酵研究发展

大肠杆菌被广泛地用于基因工程菌的构建 ,以获得大量的外源基因产物 ,利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。生物工程菌发酵的目的是希望能获得大量的外源基因产物 ,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主 ,载体和目的基因三者之间的相互关系 ,而且与其所处环境条件息息相关。因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的 ,需要对影响外源基因表达的因素进行分析 ,探索出适于外源基因高效表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向[1] 。近几…     

副猪嗜血杆菌高密度发酵工艺研究

旨在建立副猪嗜血杆菌高密度发酵工艺。通过对TSB、BH1、LB培养基进行比较，选择TSB培养基进行优化，利用优化后的培养基对副猪嗜血杆菌在10L发酵罐中进行高密度发酵培养。结果表明，血清4型JS株的活菌数达到2．5×10^10CFU／mL，血清5型ZJ株的活菌数达到2．5×10^10CFU／mL，且通过批次补料与流加相结合的工艺使关键成本血清的使用量降低了1／2。在1000L发酵规模上进行连续3批的发酵试验．经验证该工艺可用于副猪嗜血杆菌灭活疫苗抗原的规模化生产。对3批发酵抗原利用替代动物豚鼠进行动物实验，结果显示抗原均合格。研究结果为国内副猪嗜血杆菌流行菌株血清4型和5型二价灭活疫苗的规模化生产提供了理论依据。     

功能菌株及其复合菌剂发酵配合饲料的研究

发酵饲料富含有益微生物、消化酶及功能物质，已广泛应用于畜牧行业，应用效果良好。微生物种类及功能是影响微生物发酵饲料发酵效果的关键因素之一。为研究不同功能菌株在发酵过程中的作用，以pH、酸溶蛋白含量、抗原蛋白和抑菌活性为指标，对不同菌株及其复合菌剂固态发酵鸡配合饲料进行评价。结果表明：FM-20菌株产酸性物质能力较强，能显著降低饲料pH(P<0.05);FM-18菌株发酵产酸溶蛋白最快；JM-1菌株抑制大肠杆菌能力较强。经复配后，各菌株产生一定协同发酵作用，酸溶蛋白含量达到35.98%,β-伴大豆球蛋白降解明显，对大肠杆菌和沙门氏菌抑制活性显著（P<0.05），对大肠杆菌的抑菌面积达到1.18 cm2。试验为功能菌株及其复合菌剂在发酵配合饲料中的应用提供了相应的基础。     

鸭大肠杆菌O_(78)血清型强毒株分离鉴定及其高密度发酵新工艺

依据大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)持家基因PhoA PCR检测,从临床病料中分离鉴定出11株鸭致病性E.coli。经O抗原血清型鉴定以及毒力分析,筛选出1株O_(78)血清型鸭E.coli强毒株EC-KP120427。以此菌株为基础,使用单因素法以及正交法,获得O_(78)血清型鸭E.coli强毒株新型高密度发酵培养基,配方中初糖采用甘油替代葡萄糖,无机盐仅添加磷酸氢二钾,同时补充铁、锰、铝3种微量元素,在普通摇床上37℃培养菌液D_(600 nm)可达到9.0以上。使用赛多利斯5 L发酵罐,对EC-KP120427菌株进行发酵培养试验。使用优化的新型高密度发酵培养基,按1∶10比例接种对数生长期种子菌,菌液D_(600 nm)值为1.0、控制温度37℃、pH 7.0、调节空气通气量1.5～5.0 L/min、转速100～400 r/min、发酵至对数生长期以15 mL·h~(-1)·L~(-1)流速慢速流加50%葡萄糖溶液,培养菌液D_(600 nm)值可高达30.0以上,成功实现了O_(78)血清型鸭E.coli强毒株高密度发酵。本研究为致病性E.coli高密度发酵技术标准的建立奠定基础,同时为水禽E.coli细菌疫苗的改进提供了技术支持。     

饲用微生物的高密度培养

高密度培养(HCDC，high cell density culture)以其优越性在发酵生产上得到了广泛的应用。它能获得高的产率，降低生产成本，从而提高产品在市场上的竞争力。将高密度培养技术用于直接饲用微生物(DFH)的生产中，对于提高发酵水平，更好地满足市场需求，具有重要的意义。     

发酵鸡粪中病原微生物检测方法的探讨

鸡粪发酵后作为再生饲料或有机肥已广泛使用,其中病原微生物检测尤显重要,为此本研究对发酵前后的鸡粪样品中主要病原菌大肠杆菌和沙门氏菌检测方法进行了探讨。结果表明,鸡粪样品中大肠杆菌CFU(菌落形成单位)由发酵前3.67×107个/g减少至6.33×105个/g,经发酵处理的鸡粪样品均未检出沙门氏菌,两者与发酵前样品均存在极显著差异(P0.01),说明所建立的方法可行。     

仔猪致病性大肠杆菌分离鉴定及药敏试验

从20多个猪场中采集仔猪腹泻粪便，进行大肠杆菌的分离培养，经接种小白鼠进行致病性鉴定后，共获得276株致病性大肠杆菌；并从水肿病猪的水肿液中分离鉴定出1株猪水肿病致大肠杆菌。对其中112株进行了药敏试验；先锋霉素V的敏感菌株为96.3%，环丙沙星为56.3%，诺氟沙星为50.5%，卡那霉素和庆大霉素均为45.9%。蓖株的耐药率，四环素为96.8%，链霉素为71.8%，复方新诺明为67.5%，随机抽取10株进行了5种微量糖发酵试验；结果均符合大肠杆菌生化特性。此外对广西某猪场分离出的大肠杆菌进行了黏附素抗原鉴定为阴性。     

猪致病性大肠杆菌高密度发酵工艺的研究

为了提高猪致病性大肠杆菌(O139血清型)的生产量,缩短生产周期,降低生产成本,首先在10L发酵罐中对影响大肠杆菌发酵的pH值、相对溶氧量、生物量、氨基氮、还原糖、无机磷测定等方面进行了单因子试验优化。研究表明,大肠杆菌在37.5℃,pH值为7.5,4%的接种量,溶氧量为50%,200r/min的转速以及15g/L的葡萄糖添加量,20g/L的氨基氮添加量,100mmol/L的无机盐添加量,培养18h后可以得到理想的培养效果。利用此优化的条件,结合兽医药品GMP原则,在200L发酵罐中进行了发酵试验,结果在发酵结束后菌液的OD600可以达到34.51,相当于菌体浓度为12.94g/L,从而得到了大肠杆菌工业化生产工艺,为大肠杆菌疫苗大规模生产奠定了基础。     

植物乳杆菌03株和双歧杆菌05株对葡萄球菌S9株和大肠杆菌Z6株生物拮抗作用的研究

进行了植物乳杆菌03株和双歧杆菌05株对葡萄球菌S9和大肠杆菌Z6两株肠道致病菌体外混合培养拮抗试验。结果表明，03株和05株对葡萄球菌S9和大肠杆菌Z6有非常强烈的体外拮抗作用，拮抗效果与03株和05株发酵降低pH值有直接关系。