谷草青贮用耐低温产乳酸芽孢杆菌的筛选、鉴定及性质研究

本试验旨在筛选一株谷草青贮用耐低温产乳酸芽孢杆菌,首先通过溴甲酚紫平板扩散法和气相色谱法分离得到1株乳酸产量较高的菌株。再通过形态学观察、16S rDNA序列发育树分析和生理生化试验对目的菌株进行种属鉴定。最后对目的菌株进行性质研究,包括pH耐受性、温度耐受性、抑霉菌试验、产酸时间。结果表明:筛选获得了1株产乳酸含量较高的菌株F-1,该菌株在10℃、180 r/min培养48 h后乳酸产量为1328.9 mg/L,经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。性质研究发现,菌株F-1耐酸,在pH为3.0的条件下可以生长;该菌耐低温,在10℃时生长良好;对禾谷镰刀菌有明显的抑制作用;摇床培养12 h菌株开始产酸,并且随着发酵时间的延长产酸量越来越大。     

高产γ-氨基丁酸益生菌的筛选

为了筛选得到高产γ-氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)菌株，本试验以从云南不同地区食品中分离出的27株菌为材料，通过菌株复壮、革兰氏染色形态学观察、过氧化氢酶实验、单菌株发酵及高效液相色谱法检测GABA，筛选其中高产菌株进行种属鉴定并测定其发酵性能。结果表明，27株菌中筛选得到的LSR-L-L4为高产GABA菌株，其发酵液中GABA检测值为490.59 mg/L；经16S rDNA基因序列分析鉴定其为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus)，最适发酵温度为42℃；3～12代菌株凝乳时间4.5～5h，酸度52～56°T,120h极限酸度118～122°T；生长曲线稳定期OD₆₀₀=1.01～1.11,24h未见衰退；活菌数1.20×10⁹～1.50×10⁹cfu/mL；双乙酰含量10.32～11.50 mg/L;γ-氨基丁酸产值467.58～490.59 mg/L。LSRL-L4高产γ-氨基丁酸，兼具优质发酵特性，为...     

2株海洋红酵母的复合诱变及其高产类胡萝卜素菌株的选育

选用从雷州半岛近岸海域分离鉴定的2株海洋红酵母（胶红酵母J6和黏红酵母J2）作为出发菌株,进行亚硝基胍（NTG）和紫外线（UV）复合诱变,以期筛选出高产类胡萝卜素的突变株。先用NTG处理出发菌株的菌悬液60 min,再用UV照射120 s,且要连续诱变3次;每次复合诱变后的菌悬液经短时间的液体培养后涂布于红酵母琼脂平板培养,从中筛选出一定数量的第1、2和3代突变菌株;将突变菌株接种于红酵母发酵培养基,经培养、离心和烘干,制备出干菌体细胞;用分光光度计法测定干菌体细胞中的类胡萝卜素含量,筛选出高产类胡萝卜素的突变株,并进行遗传稳定性试验。结果表明,胶红酵母J6的正向突变率为56.57%（56/99）,6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代3株,第2代2株,第1代1株,类胡萝卜素含量最高的突变株是胶红酵母J6-82,比出发菌株提高了99.56%;黏红酵母J2的正向突变率为53.01%（44/83）,6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代4株,第2代2株,类胡萝卜素含量最高的突变株是黏红酵母J2-75,比出发菌株提高了93.64%。本试验采用的NTG和UV 3次复合诱变的方法有利于海洋红酵母的变异及其类胡萝卜素含量的提升,且突变菌株有良好的遗传稳定性。     

产类胡萝卜素酵母菌的鉴定及其发酵醋糟营养价值的研究

本研究旨在对实验室前期分离的酵母菌进行鉴定,并利用其发酵醋糟,以提高醋糟饲用营养价值。利用形态学特征、生理生化特性及26S rDNA的D1/D2区核酸序列分析,鉴定了1株产类胡萝卜素的酵母菌,并对醋糟进行固态发酵。结果表明:被鉴定菌株符合红酵母的形态学特征及生理生化特性,其26S rDNA的D1/D2区核酸序列与黏性红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)相关序列相似度达100%,故该菌株被鉴定为黏性红酵母;与未发酵醋糟相比,该菌株发酵醋糟的干物质、粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量变化均不显著,粗脂肪和总糖含量均降低(P<0.01),粗蛋白质与真蛋白质含量均升高(P<0.01),尤其是产生了6.60 mg/kg具有多种生物学功能的类胡萝卜素。结果显示,该株产类胡萝卜素的酵母菌为黏性红酵母,该菌发酵可改善醋糟的营养价值。     

2株海洋红酵母的复合诱变及其高产类胡萝卜素菌株的选育

选用从雷州半岛近岸海域分离鉴定的2株海洋红酵母(胶红酵母J6和黏红酵母J2)作为出发菌株,进行亚硝基胍(NTG)和紫外线(UV)复合诱变,以期筛选出高产类胡萝卜素的突变株。先用NTG处理出发菌株的菌悬液60min,再用UV照射120s,且要连续诱变3次;每次复合诱变后的菌悬液经短时间的液体培养后涂布于红酵母琼脂平板培养,从中筛选出一定数量的第1、2和3代突变菌株;将突变菌株接种于红酵母发酵培养基,经培养、离心和烘干,制备出干菌体细胞;用分光光度计法测定干菌体细胞中的类胡萝卜素含量,筛选出高产类胡萝卜素的突变株,并进行遗传稳定性试验。结果表明,胶红酵母J6的正向突变率为56.57%(56/99),6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代3株,第2代2株,第1代1株,类胡萝卜素含量最高的突变株是胶红酵母J6-82,比出发菌株提高了99.56%;黏红酵母J2的正向突变率为53.01%(44/83),6株高产类胡萝卜素的突变株中,第3代4株,第2代2株,类胡萝卜素含量最高的突变株是黏红酵母J2-75,比出发菌株提高了93.64%。本试验采用的NTG和UV 3次复合诱变的方法有利于海洋红酵母的变异及其类胡萝卜素含量的提升,且突变菌株有良好的遗传稳定性。     

牛源性蛋氨酸生产菌的分离筛选及发酵条件优化

为了从奶牛瘤胃中筛选出高产蛋氨酸微生物,无菌采集10份成年奶牛瘤胃内容物样本,经分离筛选得到18株菌株,将这些菌株进行分离纯化培养,并利用HPLC法检测各菌株发酵液中蛋氨酸的含量,最终筛选出1株蛋氨酸含量较高的菌株。经过形态观察和16S rDNA序列分析,该菌株与甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)之间的同源性为100%。利用单因素试验确定了摇瓶发酵的最优条件:葡萄糖15%,硫酸铵3.5%,玉米浆2.5%,磷酸氢二钾1.5%,发酵时间为72 h,装液量为50 mL/500 mL。在最优条件下进行发酵试验,蛋氨酸产量提高到平均2.40 g/L,较发酵优化前产量提高了175.86%。     

产胡萝卜素酵母菌的筛选

为获得具有开发应用价值的产胡萝卜素的酵母菌株，本研究从自然界中共采集了35个土样，经过富集、涂布、划线分离、种子培养和发酵培养后，采用二甲基亚砜和丙酮以1:3的比例进行破壁提取，并对色素提取物进行紫外扫描定性、定量分析，得到7株酵母菌株符合试验要求，并筛选出胡萝卜素产量最高的菌株，编号为21-1，产量为7.42 mg/L。对此菌株进行无机盐组分单因素试验和正交试验的初步优化，优化后21-1菌株胡萝卜素产量为8.55 mg/L，相比初筛的菌种提高了15.3%。将这7株菌株产胡萝卜素的特征吸收峰与β-胡萝卜素标准品进行对比发现，其中一种含量为β-胡萝卜素。 [关键词] 胡萝卜素|酵母菌|发酵优化     

产细菌素乳酸菌LS-1的全基因组测序分析

前期研究从内蒙古手工奶酪中筛选出1株可拮抗金黄色葡萄球菌的乳酸菌Lacticaseibacillus saniviri(LS-1)。为探究LS-1的全基因组信息，挖掘其潜在细菌素编码基因簇，本试验对LS-1进行全基因组测序，对编码基因进行预测，并采用非冗余蛋白质(Nr)和基因本体(GO)数据库进行功能注释；利用BAGEL4数据库预测分析细菌素合成基因簇。结果显示，LS-1的基因组大小为2 356 714 bp, GC含量为47.87%。共预测到2 316个编码基因，其编码基因总长度为2 058 534 bp,平均长度为888 bp。LS-1所分泌细菌素属于Ⅲ类细菌素中的Enterolysin A(EnlA),推测EnlA可能通过裂解细胞壁来实现抑菌作用。本试验通过全基因组测序对LS-1基因组进行全面分析，从基因水平阐明其细菌素编码基因簇，进一步明确了菌株LS-1所产细菌素具有作为新型替抗产品的潜力。     

一株高产β-胡萝卜素红酵母菌株的筛选及发酵工艺研究

试验从红色淤泥中筛选出一株产β-胡萝卜素较高的红酵母菌株SR-8,首先进行了平板固态培养、显微形态观察和26S r DNA D1/D2序列分析,序列比对后发现:该菌株与胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)保守序列同源性达99%;又进行了液体发酵培养基成分单因素优化,在此基础上设计了正交试验,确定了最优发酵条件,即在葡萄糖8%、酵母膏2%、培养温度28℃和p H 6.5条件下,红酵母菌株SR-8的生物量达到13.44%,β-胡萝卜素产量达到567.42μg/g,为其作为家禽等的微生物饲料研究奠定基础。     

1株大鲵源葡萄牙柠檬酸杆菌的全基因组测定及毒力基因和耐药基因的分析

葡萄牙柠檬酸杆菌是一种新发现的条件性致病菌,为明确重庆地区大鲵源多重耐药葡萄牙柠檬酸杆菌的基因组及其耐药特征,本试验对患病大鲵分离菌进行鉴定、药敏试验、全基因组测序及毒力、耐药基因的分析。分离菌首先通过16S rDNA进行初步鉴定,腹腔注射健康小鼠观察其致病性;利用Kirby-Bauer(K-B)纸片法进行9类共35种抗生素的敏感性试验;再利用二代测序技术进行全基因组测序,通过生物软件和数据库对分离菌的毒力基因和耐药基因进行分析。结果显示,分离菌鉴定为葡萄牙柠檬酸杆菌,将其命名为CQ-CP1,该菌对小鼠具有较强的致病性。药敏试验显示CQ-CP1对多种抗生素不敏感,为多重耐药菌株。全基因组测序该菌株共有5 006 960 bp, G+C含量为51.8%,共编码有4 722个结构蛋白,基因组信息在GenBank中的登录号为RZIH00000000.1。病原毒力因子数据库(VFDB)比对发现CQ-CP1中共有49个与毒力相关的基因,与细菌的运动、黏附、转录等相关;耐药基因数据库比对结果显示,该菌携带6个耐药基因(ARG),分别是氨基糖苷类aadA1,喹诺酮类qnrS1、qnrB32,β内酰胺...     

培养温度对海洋红酵母HS-3生物学特性的影响

研究了不同培养温度对海洋红酵母HS-3细胞生长繁殖及合成类胡萝卜素等生物学特性的影响。结果表明:(1)海洋红酵母在30℃温度培养下菌体繁殖迅速快、生物量积累多,随着培养温度的降低,菌体繁殖速度减慢,但合成类胡萝卜素能力增强。(2)采用前期30℃培养,后期20℃低温培养,红酵母HS-3菌株的生物量和类胡萝卜素的产量均能达到较高水平。     

高产苯乳酸菌株的筛选及发酵条件的优化

苯乳酸既可以延长饲料保质期又可以提高畜禽生产性能,但目前生物工业化生成苯乳酸的产量很低。为找到高产的菌株,本试验从泡菜中筛选出一株高产苯乳酸菌株,经16S rDNA测序确定该株为乳酸菌属植物乳杆菌。通过单因素试验与正交试验优化其发酵条件,由响应面试验确定外源添加物与温度之间的最佳方案,得到苯乳酸高产方案。结果表明：正交试验和响应面试验确定葡萄糖添加量为25 g/L、玉米浆添加量为5 g/L、接种量为100μL菌液、发酵时间为72 h、苯丙氨酸添加量为8 g/L、柠檬酸添加量为5 g/L、反应温度为33℃时苯乳酸的表达量达到374.26 mg/L,优于未优化前38.97 mg/L的产量。在优化后的植物乳杆菌可以高产苯乳酸,解决原始株表达量低的问题。     

高效氨氮降解克雷伯菌筛选鉴定和适宜条件研究

为了获得高效氨氮降解克雷伯菌属菌株，试验采用16S rDNA基因序列鉴定方法筛选克雷伯菌属菌株，利用标准纳氏试剂分光光度法检测培养基内的氨氮含量，并计算氨氮降解率，确定高效氨氮降解菌株；结合形态学和系统进化树构建结果对菌株进行分类鉴定；通过对培养时间、温度和pH值的筛选，研究适宜培养条件；通过与其他高效氨氮降解克雷伯菌gt-1、gt-2、gt-3、ps-1、ps-2、sw-1、sw-2、sd-1、sd-2、sd-3进行比较，验证分离菌株的氨氮降解能力，通过动物试验和污水降解试验研究分离菌株的安全性和在污水内的氨氮降解能力，并检测了菌株的存活能力。结果表明：试验成功筛选出1株肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)M169-3,具有高效氨氮降解能力。在初始氨氮含量为250 mg/L的氨氮基础培养基A内，M169-3的最高氨氮降解率为58.41%,最适温度为35℃,最适pH值为7,适应性强；在初始氨氮含量为120 mg/L的氨氮基础培养基B内，M169-3的氨氮降解率为96.64%,与其他高效克雷伯菌比较差异不显著(P>0.05);在氨氮含量为387.35 mg/L...     

GI-19型(QX型)鸡传染性支气管炎病毒的病原特性分析

为了解GI-19型(QX型)鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)的病原特性,筛选6株GI-19型IBV进行EID₅₀测定以及鸡胚致病力和雏鸡致病性试验,并应用高通量测序技术进行基因组测序,分析病毒基因组和主要结构蛋白编码基因生物特性。结果显示:IBV/Chicken/Hubei/S1402/2021分离株对鸡胚有致病性,导致鸡胚表现胚体蜷缩、矮小等典型病变特征,经SPF鸡胚传代至第5代,表现较为稳定的EID50 (10^-5.33/0.1 mL),但其对雏鸡无致病性;IBV/Chicken/Sichuan/C1452/2021分离株对鸡胚没有致病性,但将其接种1日龄雏鸡,可导致雏鸡出现33.33%(5/15)的发病率,引起的典型病变为雏鸡肾脏尿酸盐沉积。对6株GI-19型IBV分离株的基因组和主要结构蛋白编码基因进行系统进化分析和生物特性分析,发现IBV/Chicken/Hubei/S1402/2021分离株与其他分离株存在明显差异,且在1a和1b基因区域存在重组现象。结果表明:我国流行的部分I...     

γ-氨基丁酸产生菌的分离及发酵条件优化

γ-氨基丁酸(GABA)是哺乳动物体内的一种抑制性神经递质,具有许多重要的生理功能。利用酸菜、酸奶等食品进行乳酸菌的分离,通过纸层析法筛选得到1株产GABA量较高的菌株Y-3,经16SrDNA鉴定该菌株为短乳杆菌。单因素试验和正交试验确定的菌株Y-3最佳发酵条件为:葡萄糖1.5%、酵母膏0.5%、胰蛋白胨1.5%、L-谷氨酸钠1.0%、丁二酸钠0.5%,初始pH为6.0,接种量6%,37℃静置培养48 h,GABA产量达12 g/L以上,比优化前产量提高了近5倍。     

红酵母利用玉米浆发酵产富含类胡萝卜素功能饲料的研究

研究旨在对红酵母D(Rhodotorula sp.D)利用玉米浆发酵生产含类胡萝卜素功能饲料的培养基的碳氮源进行优化,并进行工业化生产试验。对玉米浆和葡萄糖结晶废糖液分别进行单因素试验来确定最佳碳氮源比例,进行7 L发酵罐试验确定上罐参数,1 000 L发酵罐中试并对发酵液进行喷雾干燥制取产品。结果表明葡萄糖结晶废糖液和玉米浆的添加量分别为7%和33.3%,7 L发酵罐最佳发酵时间为72 h,此时的生物量、色素含量和色素产量分别达到30.2 g/l,374.1μg/g和11.3 mg/l;1 000 L最佳发酵时间为41 h,此时的菌体生物量,色素含量,色素产量分别为42 g/l,404.6μg/g,17 mg/l。喷雾干燥后的产品粗蛋白质含量达到31%,类胡萝卜素含量为180.4μg/g。结果表示,优化培养基组分,控制好发酵条件,就可以利用玉米浆发酵生产富含类胡萝卜素红酵母增色功能饲料。     

优良动物源抗汞益生乳酸菌的筛选及其抗性基因的克隆

为了分离具有重金属汞抗性的优良益生乳酸菌,并挖掘细菌汞抗性的基因,应用于动物机体重金属中毒的解毒治疗,试验从健康狐狸和貉子粪便中筛选出耐酸、耐胰酶、耐胆汁、抗菌并具有较高汞抗性的乳酸菌,采用16S rRNA基因序列分析鉴定,并用PCR方法扩增mer A基因,从72株优良益生菌中逐级筛选出耐酸、耐胰酶、耐胆盐、抗菌性能好并能耐受500 mg/L HgCl_2的高浓度重金属汞的一株细菌,命名为CJT-KHg1,测定了其益生特性指标。结果表明:经过16S rRNA序列分析,该菌株为乳酸片球菌;该菌株的mer A基因序列与克雷伯氏菌、阴沟肠杆菌、希瓦氏菌mer A基因序列的同源性达到99%,证明为乳酸片球菌;从该菌株中克隆到的汞抗性基因为汞还原酶基因(Mercury reductase)。     

紫外链霉素复合诱变选育高产surfactin菌株研究

Surfactin是芽孢杆菌产生的一种抗菌脂肽,在畜牧养殖中有替代抗生素的潜力。野生菌株代谢产生surfactin能力弱,限制了surfactin的开发使用,为提高Bacillus subtilis S21产surfactin的能力,以B.subtilis S21为出发菌株,采用紫外链霉素复合诱变,以期得到高产surfactin菌株。诱变筛选结果表明:经过复合诱变筛选,得到了诱变菌株38',其传代8次后的遗传稳定菌株,surfactin产量为0.28 mg/mL,比出发菌B.subtilis S21的surfactin产量提升了9.33倍,取得较佳的诱变效果。     

青海沙地白刺根际解淀粉芽孢杆菌DGL1的牧草促生活性及其基因组分析

本研究测定了分离自青海大格勒干旱沙地白刺（Nitraria tangutorum）根围的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） DGL1的生物学活性，并对菌株DGL1进行全基因组测序拼接分析。结果表明：通过平板对峙法测定菌株拮抗瓜类枯萎病菌（Fusarium oxysporum）、锐顶镰孢病菌（Fusarium acuminatum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）活性，发现DGL1对3种病原真菌均具拮抗活性（抑菌圈平均直径均>26 mm）；采用羧甲基纤维素钠培养基测定菌株降解纤维素活性，发现菌株具有一定的降解纤维素活性；改良阿须贝（Ashby）无氮培养基检测证明菌株有固氮活性。对菌株促高原牧草燕麦（Avena sativa）、冷地早熟禾（Poa crymophila）、紫羊茅（Festuca rubra）、中华羊茅（Festuca sinensis）生长活性进行分析，发现DGL1具有促进4种牧草种子萌发和幼苗生长的能力；采用二代测序平台Illumina Hiseq×10对菌株DGL1进行全基因组测序拼接分析，表明菌株DGL1基因组DNA全长3 915 550 bp，GC含量为46.47%，CDS数量为3 972，有86个tRNA，27个rRNA，与COG，GO，KEGG数据库比对分别注释到2 970，2 926，2 160个功能基因。本研究结合生物特性与基因组分析对菌株DGL1进行了促生和抑菌相关功能基因预测，为其促牧草生长提供了理论依据。     

多重耐药胸膜肺炎放线杆菌GD2107株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】通过对多重耐药胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)GD2107株进行全基因组测序及生物信息学分析,丰富APP基因组数据库信息;构建基于ApxⅣ基因的系统进化树,分析该菌株的进化关系,为探索APP致病机制和临床防控猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumia, PCP)提供参考。【方法】通过药敏试验测定分离菌株的耐药谱;采用全基因组测序技术(whole genome sequencing, WGS)对细菌DNA进行全基因组测序,分别利用Illumina NovaSeq、PacBio SequeI测序平台对全基因组测序结果进行基因功能注释及生物信息学分析(包括基因组基本信息、功能元件分析及亚系统分析等);基于ApxⅣ基因构建系统进化树。【结果】药敏试验结果显示,GD2107菌株对青霉素、头孢拉定(先锋Ⅵ)、卡那霉素等14种抗菌药均耐药。对GD2107株全基因组测序得到1条大小为2 271 987 bp的环状染色体(GC含量为41.21%)和2个大小分别为5 027和3 497 bp的环状质粒...