虹鳟pmela基因的克隆及其在不同发育阶段和组织中的表达分析

前黑素小体蛋白a (premelanosome protein,pmela)基因是黑色素合成通路中的关键基因之一,对动物的体色有着重要影响。为探讨pmela基因在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)体色变异中的作用,本研究利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术对pmela基因cDNA全长进行克隆并运用生物信息学方法分析该基因的序列特征,同时采用qRT-PCR比较pmela在野生型虹鳟(虹鳟)、黄色突变型虹鳟(金鳟)和杂交F₁代受精期至孵化后3个月不同发育时期及成鱼不同组织中的相对表达量。研究获得pmela基因cDNA全长序列3 476 bp,包含2 532 bp开放阅读框,编码843个氨基酸。序列分析发现,Pmela为疏水性蛋白且存在PKD功能结构域。同源性比对发现,虹鳟Pemla氨基酸序列与红鲑(Oncorhynchus nerka)的同源性高达97.75%;进化分析结果显示,虹鳟与红鲑的亲缘关系最近,与人类(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的亲缘关系最远。...     

虹鳟fabp10基因真核表达载体构建、生物信息学及组织表达分析

为探究虹鳟(Oncorhynchus mykiss)脂肪酸结合蛋白10(fatty acid binding protein 10,fabp10)基因序列信息及其所编码蛋白的结构和功能等,本试验根据Gen Bank数据库公布的河鳟(Salmo trutta)fabp10基因的CDS序列信息设计引物,通过RT-PCR获得fabp10基因片段,将目的片段与p MD-18-T载体连接转化DH5α感受态细胞,构建p MD-18-T-fabp10克隆载体,双酶切回收基因片段,构建pc DNA3.1-fabp10真核表达载体,分析fabp10基因在虹鳟不同组织中的表达,经双酶切、测序鉴定构建成功。将表达载体转染至EPC细胞,分别于24h、36 h、48 h后收集细胞进行荧光定量PCR检测。结果显示：虹鳟fabp10基因CDS区与Gen Bank数据库中Salmo trutta fabp10基因CDS区同源性高达100%。生物信息学分析发现,fabp10基因编码区全长378 bp,编码126个氨基酸。Fabp10蛋白主要分布在细胞质中,存在23个潜在磷酸化位点。转染pc DNA3.1-fabp10可...     

牙鲆趋化因子基因CXCL9的克隆、鉴定与表达分析

趋化因子是一类具有化学趋化功能的小分子分泌性蛋白,能够引导白细胞到损伤或者感染的部位,参与免疫调节和病理反应。为丰富鲆鲽鱼类趋化因子的相关基础研究,本研究克隆了牙鲆(Paralichthys olivaceus)趋化因子基因CXCL9,其全长为910 bp,开放阅读框为408 bp,编码135个氨基酸。该基因具有趋化因子超家族的典型特征,在35、37、60和77个氨基酸位置具有4个保守的半胱氨酸残基,形成两个二硫键。氨基酸序列分析表明,该基因与大菱鲆(Scophthalmus maximus)、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)的CXCL9基因具有较高的同源性,分别为78.5%和71.0%。实时荧光定量PCR结果显示, CXCL9在正常牙鲆肝脏和脾脏中的表达量非常高,在皮肤和鳃等组织中表达量次之,说明CXCL9特异性地在免疫相关组织中表达。经迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)感染后,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA表达量在感染后6 h即出现高峰值,而头肾和脾脏中的高峰值出现较晚。经鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后6 h,牙鲆肝脏中CXCL9 mRNA的表达量升高近8倍,头肾中的表达高峰值出现在感染后24 h,而脾脏中CXCL9 mRNA的表达量在感染后6 h迅速升高10倍,逐渐降低后48 h又出现高峰,为正常水平的20倍。上述研究结果说明CXCL9基因在病原菌感染过程中有快速响应,可能参与了免疫防御过程,将有可能发展为一种牙鲆细菌性疾病的生物标记。本研究为牙鲆趋化因子超家族免疫机制的深入研究奠定了基础。     

Sox9基因在黄颡鱼卵巢发育周期的表达及对热应激的响应

采用半定量PCR的方法,分别从时空表达、温度应激调控和血清雌二醇(Estradiol-17β,E2)水平3个方面,共同研究雌性黄颡鱼Sox9基因的功能。结果表明,Sox9a1基因在雌性黄颡鱼各组织中存在广泛的表达,而Sox9a2则在脑和卵巢中有高表达(脑>卵巢),胃中表达微弱。在卵巢年周期发育中,卵巢中Sox9a1在Ⅲ期时达到高峰,Sox9a2则在Ⅴ期时达到峰值;脑中Sox9a1和Sox9a2表达的最大值均在Ⅱ期,后随着卵巢的发育表达水平显著下降。在热应激调控试验中,卵巢中Sox9a1虽然对热应激存在响应,但并没有出现E2相一致的变化趋势,而Sox9a2的变化趋势与血浆中E2相同。虽然脑中Sox9a1和Sox9a2在卵巢年周期发育的表达变化出现下降的趋势,但在热应激条件下,脑中Sox9a1和Sox9a2在Ⅱ期与E2的变化相反,而Ⅲ期到Ⅵ期与E2的变化相一致。该实验结果表明,卵巢中Sox9a1可能不参与卵巢的年周期发育,Sox9a2则参与卵巢发育的调控和E2的合成;在脑中,我们推测热应激可能改变了Sox9与雌激素的负调控关系,但其机理需要更深入的研究。     

尼罗罗非鱼补体C9基因的克隆和组织表达分析

为了探究补体C9在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)免疫中发挥的作用,本研究克隆并分析了尼罗罗非鱼补体C9基因(OnC9)。结果显示:OnC9的cDNA序列全长2 502 bp,包含1 761 bp的开放阅读框(ORF),编码586个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,OnC9与牙鲆(Paralichthys olivaceus)补体C9氨基酸相似性最高,达73.0%,与其他鱼类补体C9的相似性介于49.3%~71.4%之间。实时荧光定量PCR检测结果表明,OnC9基因在所检测的各个组织或器官中表达水平有明显差异,在肝脏中表达量最高,其次是肠道、后肾、皮肤、肌肉、鳃,在脑、脾脏、心脏、头肾、胸腺和血液中表达量最低。在无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染鱼体后,肝脏、后肾等组织中OnC9表达量表现为在感染12 h、48 h(或36 h)、120 h先后出现三个峰值的波动表达的规律。说明OnC9在无乳链球菌感染尼罗罗非鱼后的免疫应答中发挥作用。     

大菱鲆趋化因子受体CCR3和CCR9基因的克隆及组织表达

本实验克隆了大菱鲆趋化因子受体基因CCR3和CCR9的全长cDNA, 并进行了鉴定。其中, 全长cDNA的克隆采用了5′和 3′-RACE。CCR3 cDNA全长1 451 bp, 包括92 bp的5′非编码区, 276 bp的3′非编码区以及编码360个氨基酸的1 083 bp的开放阅读框。CCR9 cDNA全长1 441 bp, 包括59 bp 的5′非编码区, 278 bp 的3′非编码区, 以及编码367个氨基酸的1 104 bp的开放阅读框。两种受体均具有7次跨膜结构, 符合G蛋白偶联受体的序列特征。系统进化分析表明, 大菱鲆CCR3与其他鱼类CCR3聚为一支, 大菱鲆CCR9也与其他鱼类的CCR9聚为一支; 系统进化树显示的亲缘关系符合各物种的进化地位。实时定量 PCR (qRT-PCR)表明这两个基因在大菱鲆正常组织中均有一定量的表达, 尤其是它们在头肾、脾及心脏中均有高水平的表达。在脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导之后, CCR3在脾和肝中的表达水平与对照组有显著性差异(P<0.05), 而CCR9的表达水平仅在肝中与对照组有显著性差异(P<0.05)。两个基因在免疫相关组织中表达水平较高, 并且能够对LPS产生免疫应答, 说明它们在大菱鲆免疫系统中发挥了重要功能。

     

草鱼Bcl-2基因的克隆、组织表达分析及DHA诱导下其在脂肪细胞中的表达变化

为获知草鱼B细胞淋巴瘤基因-2(B cell CLL/ lymphoma-2, Bcl-2)基因序列及其在草鱼各组织和脂肪细胞中的表达变化,本研究通过cDNA快速末端扩增(Rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术获得了草鱼Bcl-2的全长cDNA序列,并采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测了Bcl-2在草鱼不同组织中的表达情况。为研究二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)对草鱼前体脂肪细胞凋亡的诱导作用,本研究检测了100 μmol/L DHA处理后,草鱼前体脂肪细胞中Bcl-2基因的时序表达。结果显示,所获得的草鱼 Bcl-2 基因全长cDNA序列长度为1292 bp,包含133 bp 的5′非翻译区(untranslated region, UTR)和784 bp 的3′UTR;开放阅读框为375 bp, 编码124 个氨基酸。草鱼Bcl-2与鲤、斑马鱼Bcl-2氨基酸同源性分别为89.5%和91.1%,与人、原鸡、小鼠、野猪、欧洲牛、褐家鼠、家猫和犬等其他动物的氨基酸同源性为57.7%-62.0%。其编码蛋白的分子量为14.14KDa,等电点为4.68。Bcl-2基因在草鱼心脏、肝胰脏、脾脏、鳃、肾脏、肌肉、腹腔脂肪组织、脑、小肠、精巢10个组织中均有表达,其中在腹腔脂肪组织、肾脏和精巢中表达丰度最高,在肌肉中表达最低。DHA处理草鱼前体脂肪细胞后,Bcl2基因表达在增殖阶段下调,而在分化阶段上调。研究表明,Bcl-2在草鱼各组织中广泛表达,且DHA对其在脂肪细胞中的表达具有调控作用。     

中华鳖SOX9基因在胚胎期性腺中的表达模式及在性逆转中的表达变化

SOX9基因在脊椎动物性别决定和性腺分化中扮演重要的调控作用。从mRNA和蛋白水平分析中华鳖SOX9基因在不同组织中的差异性表达、在胚胎性腺和成年睾丸中的细胞定位以及在性逆转中的表达变化,研究SOX9基因在中华鳖性别分化中的调控作用。Real-time PCR结果显示,SOX9基因在中华鳖雄性性腺中特异性表达。免疫荧光染色分析显示,SOX9蛋白在雄性18期胚胎性腺中开始表达,随着性腺的发育,SOX9蛋白定位于性腺Sertoli前体细胞细胞核中;而在雌性胚胎性腺并未见其表达。此外,在雌激素诱导的雄性向雌性性逆转胚胎中,SOX9基因显著下调,而在芳香化酶抑制剂诱导的雌性向雄性性逆转胚胎中,SOX9基因表达则显著上升。研究表明,SOX9基因为中华鳖雄性特异性基因,参与雄性性腺的发育过程,可能在中华鳖早期性别分化过程中起调控作用。     

栉孔扇贝sox9基因的cDNA克隆及其在不同发育时期性腺中的表达特征

SOX9是SOX家族的SOXE亚族成员,在脊椎动物骨骼发育、胰腺发育、性别决定与分化以及肿瘤形成中发挥重要的作用。sox9在不同种类脊椎动物性腺中的表达存在差异,在无脊椎动物性腺中的表达特征尚不清楚。本研究利用RACE技术克隆了栉孔扇贝(Chlamys farreri)sox9(Cf-sox9)全长的c DNA序列,其长度为2835 bp,开放阅读框为1413 bp,编码470个氨基酸。预测的氨基酸序列具有SOX家族的HMG-box和SOXE亚族的高保守区域,但没有脊椎动物羧基端的Pro-Gln-Ser rich区域。原位杂交和免疫组织化学技术确定Cf-sox9 m RNA和Cf-SOX9蛋白均定位在栉孔扇贝精巢和卵巢的所有生殖细胞中,并且在不同发育时期性腺中呈现了类似的表达规律,即在精巢中,阳性信号在精母细胞中最强,在精子中最弱;在卵巢中,阳性信号在卵原细胞、卵母细胞以及成熟卵中呈现逐渐减弱的趋势。这一表达特征与脊椎动物性腺中多样的性别差异表达特征不同,提示sox9在贝类性腺发育和配子发生中的作用可能与大多数脊椎动物不同。     

拟穴青蟹Sp-Sox14基因在胚胎发育和性腺发育过程中的表达

为了解Sox14基因在拟穴青蟹胚胎发育和性腺发育过程中可能起到的调控作用,实验从青蟹性腺转录组数据库中得到全长为2558 bp的Sp-Sox14 c DNA序列,该序列编码一个包含427个氨基酸的蛋白,包含一个HMG-box。进化树分析表明,Sp-Sox14与其他节肢动物的Sox14亲缘关系较近。实时定量PCR结果显示,Sp-Sox14在成蟹雌雄各组织中均有不同程度的表达,其中在卵巢和雄蟹心脏中的表达量最高。在胚胎发育过程中,SpSox14在复眼色素形成期的表达量显著高于其他时期。在性腺不同发育阶段,Sp-Sox14在卵黄发生前期(O2)的表达量显著高于卵巢其他发育阶段;而在精巢发育过程中,其表达量在成熟精子期(T3)高于精母细胞期(T1)和精子细胞期(T2)。推测其参与卵巢的前期发育以及精子成熟等过程。整胚原位杂交结果显示,Sp-Sox14在青蟹胚胎复眼色素形成期阳性信号定位于头部以及鄂足附近,在近孵化期定位于复眼附近,幼体孵出期则在头部仍有少量信号,暗示其与青蟹神经器官的形成以及体节附肢的发生有关。     

Determination of Salt Diffusion Coefficient in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss)

ABSTRACT

The diffusion properties of sodium chloride in rainbow trout muscle during dry salting at 10°C were investigated. The average initial dry matter content of the samples increased from 27.80 ± 0.10 to 36.01 ± 0.16%, and the average salt content increased to 17.98 ± 0.38 g NaCl/100 g dry matter at the end of the 10-h dry salting process. The analytical solution of Fick’s second law considering one-dimensional diffusion through an infinite slab was used to calculate effective salt diffusion coefficients (D_eff). The D_eff values in rainbow trout fillets decreased with increasing salting time and ranged from 6.64 × 10^?10 to 16.45 × 10^?10 m²/s.     

二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究

与二倍体（2n组）精原液做比较,以不同密度为组别,研究了4℃下两组（3n-HD和3n-LD）三倍体虹鳟（Oncorhynchus mykiss）精原液的保存时限。结果发现,随着保存时间的延长,精液中精子的活力和寿命逐渐降低。2n组、3n-HD组和3n-LD组虹鳟精原液中精子分别在保存5d、4.5d和12.5d后失去活力;在7d、15d和14.5 d后死亡,即三倍体虹鳟精原液4℃保存时间约为二倍体的2倍,说明低温短期保存三倍体虹鳟精原液可以取得较好效果。     

Prediction of the Weight of Aquacultured Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss) by Image Analysis

Prediction relationships between weight and image features were established with a high correlation for whole aquacultured rainbow trout. Three hundred fish from three different farms were used. The fish were temporarily removed from the raceway, anesthetized, and their picture was taken by a digital camera. A reference square of known surface area and color was placed beside the fish. The fish were then returned to the raceway alive. The image was analyzed, and the view area of the fish was calculated using the area of the reference square. The average color of the fish was also determined (L*, a*, and b* values). The following equations were used to fit the view area (X) vs. weight (Y) data: linear, power, and second order polynomial. The R² values for the used equations were: linear = 0.98; power = 0.99; polynomial = 0.98. Image analysis can be used reliably to predict the weight of whole aquacultured rainbow trout. In addition, color and other visual attributes can be objectively determined by image analysis to sort by visual quality.     

二倍体和三倍体虹鳟精液低温保存寿命的研究

与二倍体(2n组)精原液做比较,以不同密度为组别,研究了4℃下两组(3n-HD和3n-LD)三倍体虹鳟(Oncorhynchus mykiss)精原液的保存时限。结果发现,随着保存时间的延长,精液中精子的活力和寿命逐渐降低。2n组、3n-HD组和3n-LD组虹鳟精原液中精子分别在保存5d、4.5d和12.5d后失去活力;在7d、15d和14.5 d后死亡,即三倍体虹鳟精原液4℃保存时间约为二倍体的2倍,说明低温短期保存三倍体虹鳟精原液可以取得较好效果。     

虹鳟IL-17多克隆抗体的制备及初步鉴定

本研究根据NCBI已发表序列设计引物,提取经植物血凝素刺激后的虹鳟Oncorhynchus mykiss头肾细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增IL-17成熟肽基因,测序结果表明所获得的序列与发表序列相一致。将该基因重组至原核表达载体pET32a中,并转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta,进行诱导表达。SDS-PAGE电泳结果表明:目的蛋白以包涵体形式表达,大小约为32k Da,重组蛋白经Ni-NTA系统纯化、复性后纯度达90%以上,以其免疫小鼠制备虹鳟IL-17多克隆抗体。ELISA结果显示其效价为1∶25 600,而间接免疫荧光结果显示所制备的多克隆抗体能够特异性地识别真核细胞中瞬时表达的虹鳟IL-17。本研究成功制备虹鳟IL-17多克隆抗体,为下一步IL-17在虹鳟黏膜免疫中的作用及其佐剂效应研究奠定基础。     

Use of Underground Brackish Water for Reproduction and Larviculture of Rainbow Trout,Oncorhynchus mykiss

Broodfish were reared for 6 months in underground brackish water (11 ppt), and the quality of eggs and semen was evaluated in comparison to broodfish held in fresh water. Fry produced by the broodfish in brackish water (S) and freshwater (F) were then reared in different salinities (1, 4, 7, and 10 ppt). Broodfish successfully matured and spawned in underground brackish water, and gonad quality was better than of the broodfish in fresh water (p < 0.01). Growth indices of fry produced by both groups decreased with increasing salinity (p < 0.01). Survival was not affected by the salinities tested. Underground brackish water can be used as a source to induce successful sexual maturation and to produce high-quality gonads.     

荧光染色法检测虹鳟精子质量

本实验运用三种荧光染色方法对虹鳟精子的质量进行检测,并探讨荧光染色对虹鳟精子质量评价的可性及意义。在生殖季节采集虹鳟精液,分别进行Hoechst33342/碘化丙啶双染,吖啶橙染色及罗丹明123/碘化丙啶双染,然后将其制成涂片荧光显微镜下观察。经荧光染色的虹鳟精子质膜完整,DNA完整,可明显分辨出活体和死亡精子,线粒体膜功能正常精子的比率分别为90.7%、98.7%和96.4%。综上所述,结合三种检测方法可以简便快速地测定虹鳟精子的质量。     

新型锌制剂对虹鳟生长及免疫功能的影响

为研究纳米锌及纳米锌多糖复合体对虹鳟生长及免疫功能的影响,选取平均体质量(120.0±3.0) g的虹鳟300尾,随机分成5组,每组3个平行,每个平行20尾,按1μL/g进行尾部肌肉注射纳米锌及纳米锌多糖复合体溶液,含量分别为1000、3000 mg/kg,试验周期为10 d。试验结果显示,纳米锌及纳米锌多糖复合体可不同程度提高虹鳟特定生长率(P>0.05)。1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组虹鳟血液NBT阳性细胞数量百分比在第3 d最高,达22.3%(P<0.05);3000 mg/kg纳米锌多糖复合体组白细胞吞噬能力在第6 d最强(P<0.05)。3000 mg/kg纳米锌组虹鳟血清杀菌能力第3 d最高(19.4%),而3000 mg/kg纳米锌多糖复合体组血清杀菌能力第6 d最高,达32.43%(P<0.05)。第3 d,1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组过氧化氢酶活性、一氧化氮合成酶活性分别为26.39、43.38 U/mL (P<0.05);第6 d,超氧化物歧化酶、酸性磷酸酶活性最高,分别为29.91 U/mL、201.4 U/L(P<0.05),微量丙二醛浓度最低,为3.19 nmol/mL。试验结束后通过杀鲑气单胞菌攻毒感染,7 d内观察虹鳟累积死亡率,1000 mg/kg纳米锌多糖复合体组累积死亡率仅30%。由试验结果可知,纳米锌和纳米锌多糖复合体均能对虹鳟免疫功能产生促进作用,以1000 mg/kg纳米锌多糖复合体效果最佳。     

热休克诱导全雌虹鳟三倍体

以虹鳟二倍体的伪雄鱼为父本（遗传型为xx），探讨了采用热休克方法阻止第二极体排放诱导全雌虹鳟三倍体的适宜条件。结果表明：虹鳟三倍体诱导率明显受处理温度、起始时间以及持续时间等因子的影响。在孵化水温为6．5℃，卵子受精后20min经26℃热处理20min，孵化率为64．62％，三倍体诱导率为86．67％；卵子受精后lOmin经26℃热处理20min，三倍体诱导率为100％，但孵化率仅为3．87％。受精卵经26℃处理的诱导效果好于24℃和28℃的（P〈0．01）。     

三倍体虹鳟实时荧光定量PCR内参基因稳定性分析

采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、核糖体大亚基蛋白基因(rplp2)、真核延伸因子基因(ef1-α)、β-肌动蛋白(β-actin)和18S核糖体核酸基因(18S rRNA)等5个候选内参基因在体质量约800 g三倍体虹鳟脑、眼、鳃、皮肤、心脏、肾脏(头肾、中肾、后肾...