木薯ERF转录因子基因MeERF5克隆及表达分析

【目的】克隆木薯ERF转录因子基因MeERF5,并分析其在多种逆境胁迫下的表达模式,为深入研究MeERF5基因在木薯逆境胁迫应答中的调控机制提供参考。【方法】PCR扩增木薯品种华南8号的MeERF5基因编码区(CDS)全长序列,对其进行生物信息学分析,并利用根癌农杆菌介导法进行蛋白亚细胞定位。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeERF5基因在木薯不同组织及多种逆境胁迫处理下的相对表达量。【结果】克隆获得MeERF5基因CDS序列为948 bp,与Phytozome数据库中的参考序列(登录号:Manes.01G085200.1)的核苷酸序列相似性为100.00%,其编码315个氨基酸残基,蛋白分子量为77.84 kD,理论等电点(pI)为5.08,属于酸性蛋白,其二级结构中α-螺旋占16.51%,β-转角占3.81%,无规则卷曲占62.22%,延伸链占17.46%,亚细胞定位于细胞质。通过多序列比对及系统进化分析发现,MeERF5蛋白含有1个AP2/ERF保守结构域,与同属大戟科的橡胶树ERF蛋白氨基酸序列相似性最高(76.8%),亲缘关系最近。MeERF5基因在木薯不同组织中均有表达,其中,在茎中的相对表达量最高,在腋芽中的相对表达量最低。MeERF5基因能快速响应低温胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫、盐胁迫及ABA处理,均出现诱导表达上调的现象,其中,在氧化胁迫下,MeERF5基因的相对表达量持续上升;在干旱胁迫、盐胁迫及ABA处理下,MeERF5基因的表达量先上升后降低;在低温胁迫下,MeERF5基因在处理5 h时的相对表达量达到最大值,之后有所下降,但在处理48 h时再度上升。【结论】克隆获得的MeERF5基因属于AP2/ERF类转录因子,参与木薯多种非生物胁迫应答过程。     

苦荞转录因子基因FtMYB1的克隆及序列分析

采用RACE-PCR技术,从苦荞花蕾克隆得到一个MYB基因(FtMYBl).结果表明,FtMYBl基因DNA序列全长863 bp(GenBank,JF313344),含两个内含子,内含子1长度为78 bp(134～211 bp),内含子2长度为74 bp(342～415 bp);cDNA序列全长711bp(GenBan...     

苦荞转录因子FtNAC15基因的克隆及表达分析

为研究NAC转录因子在苦荞中的功能,从苦荞发育种子中克隆了一个NAC家族基因,其开放阅读框全长1 098 bp,编码365个氨基酸,将其命名为FtNAC15。基因结构分析表明:FtNAC15基因由3个外显子和2个内含子组成。氨基酸序列多重比对和进化关系分析表明:FtNAC15蛋白与水稻ONAC003、拟南芥ANAC010和ANAC073亲缘关系较近,属于NAC家族转录因子家族中同一亚组。基因上游启动子序列顺势作用元件分析表明:该基因启动子中的顺式作用元件可以分为5类,即启动子核心元件、节律和光照响应元件、转录因子结合位点、非生物胁迫响应元件和激素响应元件。表达分析表明:FtNAC15基因在种子发育的成熟期和干旱胁迫下上调表达,表明其参与调控荞麦种子发育和响应干旱胁迫。     

玉米MYB家族转录因子基因ZmMYB002的克隆及表达分析

通过电子克隆技术从玉米中克隆了ZmMYB002转录因子全长cDNA,采用荧光定量PCR方法分析ZmMYB002基因在玉米不同部位和胁迫处理的表达变化。结果表明:ZmMYB002基因在玉米种子、根和叶子中表达量较高;干旱胁迫和盐胁迫能够诱导ZmMYB002基因的显著表达。证明ZmMYB002基因与玉米干旱和盐胁迫路径密切相关。     

玉米ZmREM基因的克隆与逆境胁迫后表达分析

B3超家族基因是植物中特有的一类转录因子,参与植物生长发育、形态建成及抗逆境胁迫等过程。从玉米黄早4中获得一个含有2个B3-DNA结合域的基因,为B3超家族基因,命名为ZmREM。该基因全长1 047 bp,编码含有349个氨基酸的蛋白。Blast比对结果表明,ZmREM和谷子含有B3结构域蛋白、高粱的假定蛋白相似性分别为81%和84%。ZmREM基因是组成型表达,在根中表达量最高。同时ZmREM基因的转录水平可以为干旱、盐、冷和热所诱导。因此,ZmREM可能参与玉米多种非生物胁迫应答途径。     

大豆转录因子GmDof1.5的克隆与非生物胁迫诱导表达

Dof转录因子在植物的生长发育和非生物胁迫响应中起重要的调控作用。利用RT-PCR技术从大豆中克隆了一个功能未知的Dof转录因子基因GmDof1.5,该基因位于大豆基因组15号染色体上,ORF全长540 bp,编码含有179个氨基酸的蛋白质,相对分子质量为20.15 ku,等电点为9.82。蛋白序列预测发现,GmDof1.5蛋白含有一个典型Zf-Dof结合域,且含有大量磷酸化位点。蛋白系统进化分析表明,大豆GmDof1.5与豆科植物鸡血藤SsDof4的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果显示,ABA、干旱、高盐、高温和低温胁迫均可不同程度地诱导GmDof1.5的表达,且GmDof1.5对高温胁迫的响应最为显著。     

青蒿中AaWRKY3转录因子的克隆及表达分析

研究克隆得到了青蒿AaWRKY3基因,属Ⅱ类WRKY转录因子,其表达蛋白约为76kD。该基因在植物组织中广泛表达,在根中的表达量最高,且其表达量随叶片生长不断增加。其表达量受到低温、干旱和盐胁迫的强烈诱导,但对于甲基茉莉酸、乙烯、ABA及伤害处理不敏感。该研究结果表明,此基因可能通过ABA非依赖性信号转导途径来调节植物非生物胁迫应答。     

陆地棉转录因子基因GhMYB108的克隆及其在抗旱中的作用

【目的】MYB基因家族作为植物中最大的转录因子家族之一,在抵御逆境胁迫中发挥着重要的作用。克隆陆地棉MYB转录因子基因GhMYB108,并进行表达分析,验证其在干旱胁迫响应中的作用,为进一步研究GhMYB108调控陆地棉耐旱的分子机制奠定基础。【方法】根据干旱转录组数据分析,确定GhMYB108为干旱响应基因;运用聚合酶链式反应（PCR）从陆地棉根系cDNA中扩增目的基因;对GhMYB108进行基因结构特征、预测基因序列信息以及系统进化关系等生物信息学分析;利用Plant Care网站对获得的基因启动子序列进行分析;在不同逆境胁迫条件下,对GhMYB108的表达特性进行qRT-PCR分析;通过亚细胞定位确定GhMYB108蛋白在细胞中的位置;利用酵母试验验证其转录活性;使用病毒诱导的基因沉默技术（virus induced gene silencing,VIGS）沉默GhMYB108,并用qRT-PCR检测基因沉默效率。观察沉默株系在干旱处理前后的表型变化,并统计存活率,采用试剂盒测定相关生理生化指标;通过对棉花叶片喷施ABA与氟啶酮试验来分析GhMYB108与ABA的关系。【结果】从陆地棉中克隆了GhMYB108（Gh_A10G1563）,其全长879 bp,编码292个氨基酸,其蛋白质相对分子量为33.288 kD,等电点为6.037,多重序列比对和保守结构域分析,发现GhMYB108含有2个高度保守的MYB结合结构域,属于典型的R2R3型MYB转录因子。不同物种亲缘关系分析发现,GhMYB108与AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2的同源性较高,属于同一亚族,且已有研究发现AtMYB108、AtMYB78和AtMYB2与干旱或ABA信号通路相关。GhMYB108定位于细胞核,且具有转录激活活性。在干旱和对照植株中,GhMYB108均在根中表达量最高,茎中表达量最低,并且受自然干旱、18% PEG 6000模拟干旱、盐胁迫和低温等非生物胁迫诱导表达。GhMYB108沉默之后,在自然干旱条件下,沉默植株出现临界表型,与对照相比,其萎蔫更严重,且存活率降低,一些生理生化指标也发生显著变化,如叶片失水率加快,丙二醛含量升高,叶片相对含水量和脯氨酸含量减少,过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）活性降低,且通过DAB与NBT染色发现植物体积累了更多过氧化氢（H₂O₂）和超氧阴离子（O₂^-）。通过对棉花叶片喷施激素ABA或氟啶酮发现GhMYB108可受ABA信号的正调控。【结论】GhMYB108正调控棉花抗旱性,且受ABA信号的正调控。     

梅花PmERF4基因的克隆及其表达分析

为阐明梅花(Prunus mume)ERF基因的功能,采用RT-PCR技术从梅花品种‘雪梅’中克隆获得1个PmERF4基因。生物信息学分析表明该基因cDNA全长序列为842 bp,完整开放阅读框(ORF)为690 bp,编码229个氨基酸。氨基酸序列比对发现,PmERF4蛋白包含1个AP2/ERF保守结构域。系统进化分析结果显示,梅花PmERF4蛋白与李亚科李属植物的ERF蛋白高度同源。利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PmERF4基因在非生物胁迫和激素处理下的表达,结果表明:PmERF4基因受低温、氧化胁迫的诱导,但响应程度不同,它能够持续且强烈地响应低温胁迫,对甘露醇、MeJA、SA处理不敏感,而高盐和ABA则抑制其表达;PmERF4基因可能在梅花低温胁迫应答中发挥重要作用。     

拟南芥转录因子CBF1基因的克隆与原核表达

CBF1转录激活因子与植物的抗逆密切相关,根据GenBank中拟南芥（Arabidopsis thaliana）CBF1（C-repeat/dre binding factor 1）基因的编码区设计1对特异引物,通过RT-PCR扩增出拟南芥CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,测序、序列分析表明与拟南芥CBF1对应区域相似性为100%。将该片段亚克隆到原核表达载体pET22b（＋）中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌ER2566,在IPTG诱导下产生CBF1蛋白,SDS-PAGE结果表明表达的蛋白约24ku,与预期一致。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子CsBZIP40的克隆及功能分析

【目的】分析柑橘BZIP转录因子家族并克隆柑橘溃疡病菌相关的转录因子Cs BZIP40,对其进行亚细胞定位并研究外源激素及机械损伤对该基因的诱导表达,确定其诱导表达模式,分析其与溃疡病菌侵染的关系。【方法】基于全基因组公共数据库,对柑橘BZIP转录因子进行综合专业注释以获得柑橘中BZIP家族的所有成员信息,并根据染色体定位对其进行命名;利用MEME分析其结构域;利用MEGA 6.0分析柑橘BZIP与拟南芥BZIP的系统发育关系,并根据系统发育关系对该基因家族进行分类,确定本研究关注的Cs BZIP40所属的类型;结合染色体定位和系统发育树确定该家族的基因复制情况;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法验证感染溃疡病菌前后由柑橘转录组筛选出的Cs BZIP40表达模式;分析Cs BZIP40、启动子元件(plant CARE)和核定位信号(c NLSmapper),构建GFP融合载体,用洋葱表皮进行亚细胞定位分析,来对预测的核定位信息进行验证;利用q RT-PCR技术分析水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(Me JA)、乙烯利(ET)以及机械损伤(wounding)对该基因的诱导表达模式,揭示该转录因子与激素代谢途径的关系。【结果】从柑橘(甜橙)全基因组数据库中共注释到47个BZIP,这些BZIP基因位于9号染色体之外的所有染色体上,其中3号染色体基因密度最大为4.5×10-7个/Mb,2号染色体上的BZIP基因密度最小,仅占所有BZIP基因的2%;柑橘BZIP基因家族含有较少的基因复制事件,所以相对其他已测序物种其BZIP家族较小;Cs BZIP40基因全长5 756 bp,开放阅读框1 530 bp,编码509个氨基酸;经BZIP家族染色体定位、结构域和系统发育分析结果显示Cs BZIP40基因序列特异性较好,且Cs BZIP40与拟南芥中AT1g08320属于同源基因,属于柑橘10个亚家族中参与病菌防御的D亚类;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,例如Box-W1、HSE、ERE等;此基因含有核定位信号,亚细胞定位表明此蛋白定位于细胞核,具备转录因子发挥作用的前提;外源水杨酸并不会使四季橘和纽荷尔脐橙中Cs BZIP40的表达水平显著上调,纽荷尔脐橙在茉莉酸甲酯诱导后有明显的差异表达,但乙烯利可以使Cs BZIP40在四季橘和纽荷尔脐橙中均有较明显的差异表达;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因上调表达,而在感病品种纽荷尔脐橙中,该基因对柑橘溃疡病菌侵染没有响应。【结论】Cs BZIP40是响应溃疡病菌侵染的一个转录因子,该基因可作为柑橘抗溃疡病菌分子育种的一个候选基因来进行进一步功能性验证,具有潜在的分子育种价值。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

玉米逆境响应转录因子ZmGBF1的克隆及表达分析

从玉米中克隆了ZmGBF1基因,该基因长1 134 bp,编码377个氨基酸。进化树分析表明,玉米ZmGBF1与小麦TaGBF1、TuGBF3和高粱SbCPRF1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,ZmGBF1在玉米胚芽鞘中表达量最高,叶片次之,根中表达量最低;ZmGBF1基因表达受到盐、干旱、高温、低温、脱落酸和水杨酸诱导,且在干旱和高温条件下ZmGBF1的表达量与对照相比呈显著差异,暗示ZmGBF1可能参与玉米对干旱和高温的响应过程。     

花生栽培品种转录因子基因DREB1的克隆及表达载体构建

本研究从33个花生栽培品种中克隆获得干旱胁迫响应转录因子基因PNDREB1,经序列分析发现,33个栽培品种PNDREB1的核苷酸序列同源性为100%,并构建了植物表达载体p GBDREB1,为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

元宝枫MYB转录因子基因的克隆

[目的]克隆元宝枫转录因子MYB基因,为进一步研究元宝枫MYB基因功能和对其花青苷结构靶基因的调控研究奠定基础.[方法]以元宝枫‘鲁红1号’为材料,采用RT-PCR和RACE-PCR方法,克隆元宝枫‘鲁红1号’中MYB基因.[结果]测序结果显示该基因全长831 bp,编码276个氨基酸,该蛋白分子量为32.17 kDa,分子式为C1430H14052N2247O406S14,原子总数为4 510个,等电点为9.44,GenBank登录号为1825712,命名为AtrMYB.该蛋白具有R2R3MYB结构域,该蛋白偏疏水性,没有信号肽,具有核定位信号.氨基酸序列比对发现与其它物种的MYB有较高的同源性,进化树分析表明,AtrMYB与调控橙子花青苷合成的转录因子MYB亲缘关系最近,处在同一进化枝.[结论]从元宝枫‘鲁红1号’中成功获得了元宝枫转录因子MYB基因.     

受青枯菌诱导表达的马铃薯转录因子类StWRKY8的克隆与表达分析

【目的】从接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）的马铃薯中薯3号（Solanum tuberosum）中克隆类StWRKY8部分序列,分析其序列结构特征,研究该基因在感、抗病基因型马铃薯中受诱导的差异表达模式及其不同的组织表达定位。【方法】分别培养抗病基因型马铃薯ED13、感病基因型中薯3号至9-10叶期,以伤根浸菌法接种青枯菌菌株PO41。提取叶片总RNA,反转录为cDNA,使用PCR筛选cDNA差减试剂盒构建消减文库,筛选出384个阳性克隆作为原始SMART cDNA文库,采用5'-RACE法根据SMART-RACE cDNA扩增试剂盒说明克隆全长类StWRKY8。并分别应用生物信息学软件BioEdit、BLAST、MEGA 5.0分析类StWRKY8的基因序列、序列相似性比对以及建立系统进化树。利用ProtParam、ProtScale、SWISS-MODEL、NetPhos2.0 Server、WOLF PSORT、TargetP1.1 Server等在线服务器预测类StWRKY8的理化特性、三级结构、磷酸化位点以及亚细胞定位。提取马铃薯ED13、中薯3号接种青枯菌后的叶片总RNA,采样时间点分别为处理后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d和6 d,运用反转录PCR和荧光定量PCR检测类StWRKY8的表达情况。以类StWRKY特异PCR产物制备地高辛标记探针,取材料茎、叶组织制作石蜡切片,并与标记探针进行原位杂交,定位其组织表达。【结果】获得了类StWRKY8 cDNA部分序列,长563 bp,包括一个完整开放阅读框258 bp,编码85个氨基酸。类StWRKY8属于第二类WRKY,锌指结构类型为C₂H₂,具有一个典型的WRKY保守结构域。其氨基酸序列与茄科（Solanaceae）其他成员具有高度同源性,与马铃薯转录因子StWRKY8相似性高达98%。预测类StWRKY8等电点约为9.1,半衰期大于5.5 h,为水溶性蛋白,其三维结构为非球状分子,含有3个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞内。类StWRKY8受青枯菌诱导后表达上调,且在感、抗病基因型马铃薯中表达有差异。类StWRKY8在感病基因型马铃薯接种青枯菌6 h内表达量较低,而在抗病基因型马铃薯接种青枯菌6 h内高强度表达。该基因主要在茎叶维管束系统的韧皮部表达,具有组织特异性。【结论】类StWRKY8具有转录因子的一般结构特征,受青枯菌等病菌的诱导表达,同时受寄主植物固有抗性的影响,在感、抗病基因型中表达模式不同。推测其在植物防御反应中发挥作用并参与机体调控。     

西瓜抗枯萎病相关基因ClMYB转录因子的克隆及表达分析

【目的】克隆西瓜抗枯萎病相关基因CIMYB转录因子,进行生物信息学及表达模式分析,为进一步解析CIMYB在西瓜抗枯萎病机制中的作用提供理论依据。【方法】根据西瓜与枯萎病菌不亲和互作的抑制差减文库和Microarray数据分析,获得与西瓜抗枯萎病相关的基因CIMYB,采用RT-PCR技术分离克隆CIMYB c DNA全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的保守结构域及序列特征;使用MEGA5.0对CIMYB蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;采用GFP标记的方法进行亚细胞定位,分析编码蛋白表达位置;将该基因片段通过Nde I和Xba I双酶切连接至原核表达载体p Czn1,重组质粒转化至大肠杆菌Arctic Express,经终浓度为0.5 mmol·L~(-1) IPTG诱导4 h,用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达;利用实时荧光定量PCR方法检测目的基因在西瓜与枯萎病菌互作中及在茉莉酸(jasmonate,JA)诱导下的表达情况。【结果】利用RT-PCR方法从西瓜野生材料PI296341-FR根系组织中克隆该基因片段(Gen Bank:KT751229),序列比对及生物信息学分析表明,其基因编码的氨基酸序列具有MYB转录因子R2R3型的典型特征,其N端具有R2、R3两个MYB结构域,C端高度变异。多序列比对及进化树分析表明,该基因编码的蛋白与甜瓜MYB(Gen Bank:XM_008440304)和黄瓜MYB(Gen Bank:XM_011652633)同源性最高,其编码的氨基酸一致性达到86%,这与它们同属葫芦科植物有关;亚细胞定位显示CIMYB定位于细胞核,为典型的转录因子;成功构建了该基因的原核表达载体p Czn1-CIMYB,转化至大肠杆菌得到36 k D左右蛋白;CIMYB受枯萎病菌诱导,在高抗枯萎病菌材料PI296341-FR中,相对感病品种表达量高峰出现的早,且表达量高。50μmol·L~(-1)的Me JA处理可以显著提高感病材料Black diamond对枯萎病的抗病水平,同时诱导CIMYB表达,与抗病材料PI296341-FR相比表达趋势一致,但表达量更高。【结论】CIMYB为典型的R2R3-MYB转录因子,亚细胞定位于细胞核中;基因的原核表达得到36 k D的融合蛋白,在西瓜中的表达受枯萎病菌和茉莉酸诱导,推测CIMYB可能参与JA介导的西瓜抗枯萎病防卫反应的信号通路,在西瓜抗病中起一定的作用。