中国小型猪内源性反转录病毒研究进展与对策

作者介绍了国内外猪内源性反转录病毒（PERV）研究进展,简述了中国不同品种小型猪PERV存在情况、PERV前病毒全基因克隆与序列分析、细胞水平鉴定方法、感染HEK293细胞研究平台的创建、猪A3F对PERV的抑制作用研究,以及从分子遗传学上揭示不同品系PERV特异性等创新性研究成果,分析了五指山小型猪近交系具有PERV基因拷贝少且没有PERV-C等特异性,以及展望培育中国PERV阴性猪新品系方法等研究,以期为人类异种器官移植和生物医用材料产品安全性研发,解决小型猪PERV疾病传播危险性提供科学对策和新的方向。     

中国巴马小型猪内源性反转录病毒的检测

目的 :对我国特有巴马小型猪内源性反转录病毒 ( porcine endogenous retrovirus,PERV)的存在与 m RNA的表达情况进行检测 ,了解巴马小型猪内源性反转录病毒的携带情况。方法 :根据以往建立的 PCR、RT-PCR检测方法 ,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的 DNA和RNA样品进行 PERV核心蛋白基因 ( gag)、多聚酶基因 ( pol)及囊膜基因 ( env)的存在与表达进行检测 ;同时 ,根据目前通用的 env基因分型方法检测 PERV env-A、env-B、env-C的存在与表达。结果 :在 1 2个被检的 DNA样品中均检出了PERV特异性 DNA的存在 ;同样 ,在 1 2个被检的 RNA样品中均有 PERV特异性 RNA的表达 ,且所表达的 PERV均为 A型和 B型 ;其中有9个 DNA样品检测出 PERV-C型的存在 ,所有样品中均未检出 C型 PERV的表达。结论 :检测结果表明 1 2个被检巴马小型猪基因组中存在着内源性反转录病毒序列 ,且能以 m RNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。     

中国巴马小型猪封闭群内源性反转录病毒存在状况分析

检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus;PERV);PERV)在中国巴马小型猪封闭群中的携带情况.根据本实验室已建立的PCR、RT-PCR检测方法,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(p0l)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测;同时根据目前通用的env基因分型方法检测PERVenv-A、env-B、env-C的存在与表达情况.所有被检样品不仅存在PERV gag、pol、env特异性DNA,而且都能够转录为RNA;所有样品同时存在PERV A、B亚型的前病毒,且有70%个体还同时存在PERV-C亚型前病毒,但仅有90%样品检测到PERV-A亚型的表达,50%检测到PERV-B亚型的表达,而所有的样品均未检测到PERV-C型的表达.巴马小型猪封闭群外周血淋巴细胞基因组中存在PERV-A、B、C 3种亚型,但仅有A、B两种亚型能够表达.PERV-A、B、C 3种亚型的同时存在,预示着巴马小型猪封闭群中存在不同亚型病毒重组的可能性.     

巴马小型猪内源性反转录病毒感染对HEK293细胞周期调控相关基因mRNA表达的影响

以巴马小型猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染HEK293细胞模型(PERV-BMHEK293)为研究对象,分析PERV整合对HEK293细胞活性的影响,同时建立7种与人细胞增殖和周期调控密切相关基因的实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法,并对细胞感染模型中7个基因的mRNA表达情况进行分析。细胞活力分析结果显示,随着培养代次及培养时间增加,相对于母源HEK293细胞PERV感染模型的细胞活力下降;qPCR检测方法建立结果显示,所构建的cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、c-myc、p53、p16基因检测方法检测各基因在1.0×10~1~1.0×10~9 copies/μL反应范围内有很好的线性关系,扩增产物熔解曲线只出现特异性单峰,各组内变异系数在0.31%~2.01%之间,组间变异系数在0.46%~2.19%之间,重复性好,可稳定地用于相关基因mRNA的定量检测。用建立的q-PCR检测方法对PERV感染模型进行细胞周期调控相关基因mRNA表达分析,结果显示,与母源细胞相比,模型细胞cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、p53和p16基因的mRNA表达无明显变化,原癌基因c-myc基因表达下调,提示PERV感染可能抑制c-myc基因表达。该研究结果可为评价巴马小型猪来源PERV在人-猪异种移植中生物安全性提供参考。     

巴马小型猪内源性反转录病毒的整合对HEK293细胞周期、细胞凋亡和相关基因表达的影响

检测广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV)整合到HEK293细胞基因组(HEK293-PERV-BM)后,宿主细胞的细胞周期、细胞凋亡及cyclin D1、CDK4、c-Myc、p53、p16和k-Ras等相关基因表达的改变,推测相关作用机制。检测发现P10代巴马小型猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型(HEK293-PERV-BM)的细胞周期主要被阻滞在S期和G2/M期,细胞凋亡受到抑制,P25代细胞周期主要被阻滞在S期,细胞凋亡明显受到诱导。通过实时荧光定量PCR和Western blot检测发现细胞周期相关基因的表达与细胞感染模型传代次数(P1～P35)有密切关系,其中cyclin D1、c-Myc和k-Ras基因表现为先降低后升高,而CDK4和p16基因则恰好相反,同时,p53基因表达的改变不明显,据此可以推测P10代细胞周期的改变可能由Rb调控通路诱导发生,P25代细胞周期的改变可能由Rb调控通路与p53调控通路协同诱导发生。上述结果提示PERV的感染可能存在潜在的危险。     

猪内源性反转录病毒囊膜蛋白基因的克隆及其蛋白二级结构和B细胞表位预测

猪内源性反转录病毒（PERV）是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对PERV-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现PERV-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于PERV疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及PERV对人源细胞的感染机制。     

聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒

为了建立检测猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法，根据巳发表的PERV的序列，设计并合成了针对PERV核心蛋白（gag）、多聚酶（pol)、囊膜蛋白（env）基因的3对引物，预期扩增片段分别为361、150、265bp。应用PCR技术检测了PERV在4株猪源细胞中的整合情况。结果表明，在所有被检细胞的基因组中均存在有PERV的前病毒序列，应用RT-PCR检测上述4株猪源细胞中PERV特异性MRNA的表达，结果均为阳性。试验还对建立的上述2种方法的特异性进行了探讨，结果表明试验建立的PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究PERV奠定了基础，还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。     

广西巴马小型猪1号染色体 DNA文库的构建和鉴定

研究利用玻璃针显微分离了巴马小型猪外周血淋巴细胞有丝分裂中期的1号染色体,然后将显微分离的染色体进行简并寡核苷酸引物PCR（DOP—PCR）扩增,通过PCR技术和荧光原位杂交（Florescence in situ hybridization,FISH）技术对扩增产物来源进行鉴定后,将DOP—PCR产物与pMD18-T载体连接、转化以构建1号染色体微克隆文库。结果表明：DOP—PCR扩增产物与猪的1号染色体DNA同源,并且得到了插入片段为100～600bp的巴马小型猪的1号染色体微克隆DNA文库。     

稳定表达猪干扰素调节因子7的ST细胞株的建立

干扰素调节因子(IRF)在抗病毒感染中具有重要作用,为构建稳定表达猪IRF7 (pIRF7)的猪睾丸细胞系(ST),本研究从猪淋巴细胞中扩增获得pIRF7基因,将其插入pEGFP-C3载体中构建重组表达质粒pEGFP-pIRF7.并转染于ST细胞中,通过G418加压筛选及细胞纯化获得G418抗性ST细胞株(STA1).RT-PCR和western blot检测结果表明,STA1细胞株能够稳定表达重组pIRF7;而且以聚肌胞刺激STA1细胞可以观察到表达的pIRF7在细胞内具有核转位能力,该项研究为进一步研究猪瘟病毒对pIRF7的作用奠定基础.     

巴马小型猪主要固有免疫分子的克隆及序列分析

为了开展巴马猪的固有免疫相关研究,试验采用巴马小型猪的外周血分离淋巴细胞,提取总RNA,利用特异性引物进行RT-PCR,将克隆片段与pc DNA3.1载体相连接,转化到大肠杆菌DH5α中,筛选阳性克隆并进行测序,并将测序结果提交NCBI,比较克隆序列与已知序列的同源性。结果表明:克隆的巴马猪TLR7、TLR8、TLR9、VISA、STING和IRF3序列长度分别为3 075,3 087,3 097,1 575,1 260,1 137 bp,测序结果与预期相符,各序列与猪的同源性较高。     

Research Progress and Countermeasures of Porcine Endogenous Retrovirus in Chinese Miniature

The paper is a brief introduction of porcine endogenous retrovirus (PERV) innovative research results in the world and also expounds the passing PERV existence situation on different varieties of miniature pig, analyzes the PERV-virus gene cloning and sequence, appraises method on cell level, create the platform of infection HEK293 cells research, study on pigs A3F inhibition of PERV, and reveal the innovative research results on the specific molecular genetics in the different strain of PERV, analyzes the advantages of Wuzhishan miniature pig inbred line such as low gene copy of PERV,and there is no passing PERV-C specificity and as well as looking forward to cultivate the methods for new strain of PERV negative pigs. It will provide a scientific counter measure and new perspective to solve the spread of disease risk of miniature pig PERV and product safety for human xenotransplantation and biomedical materials of research and development.     

适应无血清培养的HEK293细胞系的培育

为培育适合腺病毒增殖的无血清培养细胞系,本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(293SF),经检测293SF细胞具有稳定的支持腺病毒增殖与表达外源蛋白的能力;平均病变时间为97 h,比HEK293细胞缩短12.9%;毒价达到107.48TCID50/mL,比HEK293细胞提高43.3%;并且稳定性良好,连续传16代后293SF细胞状态与易感性未发生变化。该细胞系为腺病毒的无血清培养奠定基础。     

猪食欲肽受体2激动剂细胞筛选模型的建立及对天然中药提取物受体激动剂的筛选

本研究旨在构建猪食欲肽受体2（pOX2R）的真核表达载体,探究其对天然中药提取物的药理学活性。将成功构建的pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R和报告质粒PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]分别瞬时转染HEK293T细胞,利用萤火虫荧光素酶报告基因检测法测定阳性细胞株在不同浓度激动剂Orexin A和Orexin B以及颉颃剂TCS作用下胞内cAMP水平。将目的质粒与报告质粒稳定共转染CHO-K1细胞,利用G418和潮霉素B进行抗性筛选,获得6株阳性细胞株和5株阴性细胞株。对具有促进食欲作用的18种天然中药材的36种提取物进行筛选,并用瞬时共转染了pcDNA3.1（+）-myc/pOX2R和PGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]的HEK293T细胞作为研究对象,对阳性提取物进行剂量效应分析。结果显示,Orexin A与Orexin B单独作用细胞时,可以使萤火虫荧光素酶的活性提高,呈明显的剂量效应关系,当与颉颃剂TCS联合作用时,TCS可以颉颃激动剂对受体的激活作用。通过优化药物刺激时间和二甲亚砜（DMSO）用量后,建立了以pOX2R为靶点的稳定、可靠的激动剂细胞筛选模型。经过初筛和复筛,得到了甘草水提物、白莲子和山药醇提物3种可以使阳性细胞荧光素酶表达量升高的提取物。提取物在一定浓度范围内可以刺激胞内荧光素酶的表达,呈剂量效应关系。以上结果为筛选出可以提高猪生产效率的先导化合物及相关药物研究提供参考依据。     

人氨基肽酶N在猪丁型冠状病毒感染HEK293细胞中的作用

以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶 N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因的HEK293细胞系,通过CCK-8试验验证敲除细胞和野生型细胞的细胞活性;用RT-qPCR和Western blot检测hAPN敲除和过表达对PDCoV复制的影响;进一步通过同源建模和分子对接预测PDCoV S蛋白和hAPN蛋白的结合位点。结果显示： PDCoV在感染HEK293细胞后12~36 h快速增殖,在36 h达到顶峰,在HEK293细胞上至少可传至2代;hAPN敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无明显差异,细胞敲除hAPN可显著抑制PDCoV复制,细胞过表达hAPN可促进PDCoV复制;同源建模和分子对接表明,S1蛋白可与hAPN蛋白结构域II结合,主要是S1蛋白的受体结合基序1(receptor binding motif 1,RBM1)氨基酸残基TYR⁹²、THR⁵¹、THR⁴⁸、PHE¹⁶和MET¹⁴通过氢键与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE⁴⁹⁰、GLN⁵³¹、ARG⁵²⁸和SER⁵²⁹结合。hAPN在PDCoV感染人源细胞中发挥重要作用,为深入研究PDCoV的细胞入侵和跨种传播机制提供了新的理论依据。     

猪流行性腹泻病毒CH-HuN1301株N基因重组表达载体的构建及稳定表达细胞系的建立

本研究旨在建立猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV） CH-HuN1301株N蛋白稳定表达细胞系。采用RT-PCR扩增PEDV新流行毒株CH-HuN1301株N基因,分别克隆至原核表达载体pET28a和真核表达载体pEGFP-C1构建重组表达载体,所测定的序列采用Mega 5.0软件进行进化分析。将原核表达的N蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,重组真核表达载体pEGFP-PEDV-N转染HEK293细胞,经用G418筛选获得稳定的表达细胞系。荧光倒置显微镜观察细胞荧光,免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）检测N蛋白的表达。结果表明,PEDV HuN1301-14毒株N基因大小为1 323 bp,原核表达重组N蛋白分子质量约60 ku,其多克隆抗体与PEDV呈特异性反应,荧光倒置显微镜观察和IPMA检测结果显示N蛋白在HEK293细胞中稳定表达。该细胞系的建立为进一步研究PEDV的诊断方法提供了基础材料。     

Construction of Recombinant Expression Vector and Establishment of Stable Expression Cell Line of N Gene of Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain CH-HuN1301

This study was aimed to construct stable cell line expressing N protein coded by porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) strain CH-HuN1301. N gene of this virus strain was amplified by RT-PCR, which was then cloned into prokaryotic expression vector pET28a and eukaryotic expression vector pEGFP-C1,respectively. Recombinant plasmids were sequenced and analyzed by software Mega 5.0. To prepare polyclonal antibody of N protein, the prokaryotic expression recombinant N protein was used as antigen to immunize rabbits. HEK293 transfected with recombinant eukaryotic expression plasmids pEGFP-PEDV-N was selected by G418 to produce a stable cell line which then was identified by immunoperoxidase monolayer assay (IPMA) and fluorescence observation. Results showed that, the N gene of PEDV strain CH-HuN1301 was 1 323 bp, molecular weight of recombinant prokaryotic expressing N protein was about 60 ku, prepared polyclonal antibody against N protein showed wonderful reactivity with PEDV propagated in Vero cells, recombinant eukaryotic expressing N protein was positively detected in the established stable cell line by IPMA and fluorescence observation. This stable cell line provided foundation for the research in PEDV diagnosis methods.     

Generation and purification of recombinant bovine pregnancy associated glycoprotein

Bovine pregnancy-associated glycoprotein-1 (bPAG-1) is predicted to play an essential role during pregnancy and is labelled as a potential biochemical marker of pregnancy in ungulates. We have compared the generation of the glycosylated form of recombinant bPAG-1 (rbPAG-1) by human embryonic kidney 293 (HEK 293) and Chinese hamster ovary (CHO) cells in attached cultures and evaluated the adaptation of the rbPAG-1 transfected cell line to suspension culture. The PAG cDNA was cloned from placental RNA obtained from a slaughtered cow on day 55 of pregnancy. The PAG-pRcRSV expression vector was transfected into HEK 293 and CHO cells. Western blot analysis showed that clonal HEK 293 cells expressed rbPAG-1 better than CHO cells in attached cultures. Transfected HEK 293 cells were adapted to suspension culture in spinner flasks and the rbPAG-1 purified to homogeneity using ion-exchange, pepstatin-sepharose affinity chromatographies and preparative SDS-PAGE. The expression of rbPAG-1 was immunocharacterised using a polyclonal antibody. Our findings indicated that 293 cells are suitable for production of glycosylated form of rbPAG-1 and that the availability of the recombinant glycoprotein will aid in further studies to elucidate the function and structure of the protein.     

新城疫病毒复制对其溶瘤作用影响的初步分析

本研究旨在明确新城疫病毒（NDV）溶瘤作用是否依赖其复制水平,并改进NDV溶瘤机制研究模型。以NDV疫苗株LaSota感染人肿瘤细胞系HCT116、A549和人非肿瘤细胞系HEK293T为研究模型;RT-qPCR检测NDV在各细胞系的基因组复制水平;Western blot检测NDV在各细胞系的蛋白表达水平;利用流式细胞术检测NDV感染对各细胞系的细胞周期和细胞凋亡的影响。结果表明,NDV在三个细胞系内的基因组复制水平和蛋白表达水平没有显著差异,但对三个细胞系的溶瘤作用存在明显差异;进一步流式细胞术检测发现,NDV感染能诱发HEK293T和HCT116的细胞周期发生G1期停滞,但对A549的细胞周期没有明显影响;此外,NDV感染24 h后,A549细胞以早期凋亡为主,而HCT116细胞以坏死/晚期细胞凋亡为主。NDV的溶瘤作用并不依赖于其复制水平,而且NDV对不同类型肿瘤细胞的溶瘤作用存在不同机制。     

TLN-58和hLYZ基因融合表达载体的构建及其细胞毒性研究

为了评价融合表达抗菌肽TLN-58和人溶菌酶hLYZ双基因重组表达质粒的安全性,试验采用基因重组法将TLN-58和hLYZ基因片段克隆至pEGFP-N1载体,利用转染试剂GeneTwinTW将构建好的重组质粒转染HEK293细胞,RT-PCR验证重组真核质粒在细胞中表达情况;通过DAPI染色、AO/EB染色、CCK-8...