巴马小型猪内源性反转录病毒感染对HEK293细胞周期调控相关基因mRNA表达的影响

以巴马小型猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)感染HEK293细胞模型(PERV-BMHEK293)为研究对象,分析PERV整合对HEK293细胞活性的影响,同时建立7种与人细胞增殖和周期调控密切相关基因的实时荧光定量PCR(q-PCR)检测方法,并对细胞感染模型中7个基因的mRNA表达情况进行分析。细胞活力分析结果显示,随着培养代次及培养时间增加,相对于母源HEK293细胞PERV感染模型的细胞活力下降;qPCR检测方法建立结果显示,所构建的cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、c-myc、p53、p16基因检测方法检测各基因在1.0×10~1~1.0×10~9 copies/μL反应范围内有很好的线性关系,扩增产物熔解曲线只出现特异性单峰,各组内变异系数在0.31%~2.01%之间,组间变异系数在0.46%~2.19%之间,重复性好,可稳定地用于相关基因mRNA的定量检测。用建立的q-PCR检测方法对PERV感染模型进行细胞周期调控相关基因mRNA表达分析,结果显示,与母源细胞相比,模型细胞cyclinD1、CDK1、CDK4、k-ras、p53和p16基因的mRNA表达无明显变化,原癌基因c-myc基因表达下调,提示PERV感染可能抑制c-myc基因表达。该研究结果可为评价巴马小型猪来源PERV在人-猪异种移植中生物安全性提供参考。     

中国巴马小型猪内源性反转录病毒的检测

目的 :对我国特有巴马小型猪内源性反转录病毒 ( porcine endogenous retrovirus,PERV)的存在与 m RNA的表达情况进行检测 ,了解巴马小型猪内源性反转录病毒的携带情况。方法 :根据以往建立的 PCR、RT-PCR检测方法 ,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的 DNA和RNA样品进行 PERV核心蛋白基因 ( gag)、多聚酶基因 ( pol)及囊膜基因 ( env)的存在与表达进行检测 ;同时 ,根据目前通用的 env基因分型方法检测 PERV env-A、env-B、env-C的存在与表达。结果 :在 1 2个被检的 DNA样品中均检出了PERV特异性 DNA的存在 ;同样 ,在 1 2个被检的 RNA样品中均有 PERV特异性 RNA的表达 ,且所表达的 PERV均为 A型和 B型 ;其中有9个 DNA样品检测出 PERV-C型的存在 ,所有样品中均未检出 C型 PERV的表达。结论 :检测结果表明 1 2个被检巴马小型猪基因组中存在着内源性反转录病毒序列 ,且能以 m RNA的形式表达 ,这一结果为我国特有小型猪的开发、利用及其病毒安全性评价奠定了基础。     

中国巴马小型猪封闭群内源性反转录病毒存在状况分析

检测分析猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus;PERV);PERV)在中国巴马小型猪封闭群中的携带情况.根据本实验室已建立的PCR、RT-PCR检测方法,对来自于巴马小型猪外周血淋巴细胞的DNA和RNA样品进行PERV核心蛋白基因(gag)、多聚酶基因(p0l)及囊膜基因(env)的存在与表达进行检测;同时根据目前通用的env基因分型方法检测PERVenv-A、env-B、env-C的存在与表达情况.所有被检样品不仅存在PERV gag、pol、env特异性DNA,而且都能够转录为RNA;所有样品同时存在PERV A、B亚型的前病毒,且有70%个体还同时存在PERV-C亚型前病毒,但仅有90%样品检测到PERV-A亚型的表达,50%检测到PERV-B亚型的表达,而所有的样品均未检测到PERV-C型的表达.巴马小型猪封闭群外周血淋巴细胞基因组中存在PERV-A、B、C 3种亚型,但仅有A、B两种亚型能够表达.PERV-A、B、C 3种亚型的同时存在,预示着巴马小型猪封闭群中存在不同亚型病毒重组的可能性.     

中国小型猪内源性反转录病毒研究进展与对策

作者介绍了国内外猪内源性反转录病毒（PERV）研究进展,简述了中国不同品种小型猪PERV存在情况、PERV前病毒全基因克隆与序列分析、细胞水平鉴定方法、感染HEK293细胞研究平台的创建、猪A3F对PERV的抑制作用研究,以及从分子遗传学上揭示不同品系PERV特异性等创新性研究成果,分析了五指山小型猪近交系具有PERV基因拷贝少且没有PERV-C等特异性,以及展望培育中国PERV阴性猪新品系方法等研究,以期为人类异种器官移植和生物医用材料产品安全性研发,解决小型猪PERV疾病传播危险性提供科学对策和新的方向。     

五指山小型猪内源性反转录病毒囊膜基因变异特征研究

为分析近交系连续3代次五指山小型猪内源性反转录病毒囊膜基因(PERV-env)变异特征,本研究采用PCR方法对该基因进行扩增、克隆和序列测定,将其与参考序列比对和遗传进化分析.序列分析显示:PERV-env核苷酸序列与参考序列之间的同源性为98.3 ％～99.3％,具有明显G→A突变,并且偏好发生于GA、GG.进一步分析表明,在PERV-env序列190 bp和1 875 bp位置均有G→A突变发生.PERV-env基因遗传进化树分析表明,五指山来源的PERV与国外小型猪PERV-A亲缘关系较近,但仍存在差异.本实验将有助于PERV分子特性的研究,为进一步开展异种移植中PERV的安全性评价奠定基础.     

广西巴马小型猪内源性反转录B亚型病毒5′非编码区的序列扩增及分析

应用SMART RACE方法快速扩增广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV)5'非编码区,获得了一条长度为1 423 bp的PERV-5'UTR序列(GenBank登录号GU390231),该序列与GenBank已发表的PERV-A、B、C各亚型同源性分别为92.4%～95.2%、91.8%～99.5%和86.5%～...     

不同代次广西巴马小型猪内源性反转录病毒3′UTR克隆及结构和调控元件分析

利用CDNA末端快速扩增技术（RACE）成功扩增了广西巴马小型猪近交系连续4代次及封闭群的猪内源性反转录病毒（PERV）3UTR,共获得8条序列（GenBank登录号分别为：GQ475493、GQ475494、GQ475495、GQ475496、GQ475497、GQ475498、GQ475499、GQ475500）,分为638、749bp 2种不同的类型,都属于PERV-A亚型。以PERV-3UTR构建遗传进化树,PERV-A,B,C分群清晰,3UTR可作为PERV亚型区分的另一基因序列。对调控元件定位分析,推测具有749bp类型3UTR的PERV病毒转录水平更高。在所获得序列的209～227bp位置,发现了＂CTTGAAACTT＂10个碱基的1.9个重复。模拟RNA二级结构,广西巴马小型猪PERV-3UTR 2种类型无论从空间构型、自由能,还是茎环数量都存在明显的不同。这些结果为全面评价广西巴马小型猪来源的PERV病原安全性提供了参考。     

人氨基肽酶N在猪丁型冠状病毒感染HEK293细胞中的作用

以HEK293细胞为模型,探讨人氨基肽酶 N(human aminopeptidase N,hAPN)在猪丁型冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)入侵人源细胞中的作用。RT-qPCR/RT-PCR鉴定PDCoV在HEK293细胞上的增殖情况,再用CRISPR/Cas9技术构建敲除hAPN基因的HEK293细胞系,通过CCK-8试验验证敲除细胞和野生型细胞的细胞活性;用RT-qPCR和Western blot检测hAPN敲除和过表达对PDCoV复制的影响;进一步通过同源建模和分子对接预测PDCoV S蛋白和hAPN蛋白的结合位点。结果显示： PDCoV在感染HEK293细胞后12~36 h快速增殖,在36 h达到顶峰,在HEK293细胞上至少可传至2代;hAPN敲除细胞与野生型细胞的细胞活性无明显差异,细胞敲除hAPN可显著抑制PDCoV复制,细胞过表达hAPN可促进PDCoV复制;同源建模和分子对接表明,S1蛋白可与hAPN蛋白结构域II结合,主要是S1蛋白的受体结合基序1(receptor binding motif 1,RBM1)氨基酸残基TYR⁹²、THR⁵¹、THR⁴⁸、PHE¹⁶和MET¹⁴通过氢键与hAPN蛋白的氨基酸残基PHE⁴⁹⁰、GLN⁵³¹、ARG⁵²⁸和SER⁵²⁹结合。hAPN在PDCoV感染人源细胞中发挥重要作用,为深入研究PDCoV的细胞入侵和跨种传播机制提供了新的理论依据。     

聚合酶链反应检测4种猪源细胞系中的内源性反转录病毒

为了建立检测猪内源性反转录病毒（porcine endogenous retrovirus,PERV)的特异性方法，根据巳发表的PERV的序列，设计并合成了针对PERV核心蛋白（gag）、多聚酶（pol)、囊膜蛋白（env）基因的3对引物，预期扩增片段分别为361、150、265bp。应用PCR技术检测了PERV在4株猪源细胞中的整合情况。结果表明，在所有被检细胞的基因组中均存在有PERV的前病毒序列，应用RT-PCR检测上述4株猪源细胞中PERV特异性MRNA的表达，结果均为阳性。试验还对建立的上述2种方法的特异性进行了探讨，结果表明试验建立的PERV检测法具有较高的特异性。该方法的建立为进一步研究PERV奠定了基础，还可对异种移植动物模型及异种移植受体进行病原安全性监测。     

适应无血清培养的HEK293细胞系的培育

为培育适合腺病毒增殖的无血清培养细胞系,本研究采用培养液渐进替换的方法获得了一株适应无血清培养的HEK293细胞(293SF),经检测293SF细胞具有稳定的支持腺病毒增殖与表达外源蛋白的能力;平均病变时间为97 h,比HEK293细胞缩短12.9%;毒价达到107.48TCID50/mL,比HEK293细胞提高43.3%;并且稳定性良好,连续传16代后293SF细胞状态与易感性未发生变化。该细胞系为腺病毒的无血清培养奠定基础。     

转Lp-PLA_2猪成纤维细胞系的建立及其功能鉴定

根据NCBI上公布的猪Lp-PLA2mRNA序列设计引物,以小型猪肺脏cDNA为模板进行PCR,将扩增产物连接进入具有EF1α启动子的pIRES2-EGFP真核表达载体中,并对其功能进行鉴定。然后,将猪Lp-PLA2表达载体转染入小型猪胎儿成纤维细胞,经过G418抗性筛选,鉴定,成功得到5株转Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系。这为下一步建立Lp-PLA2转基因猪及其功能研究奠定基础。     

Characteristic features of porcine endogenous retroviruses in Vietnamese native pigs

We aimed to clarify the genomic characteristics of porcine endogenous retroviruses (PERVs) in Vietnamese native pig (VnP) breeds. First, we investigated genetic polymorphisms in β‐ and γ‐like PERVs, and we then measured the copy numbers of infectious γ‐like PERVs (PERV‐A, B, and C). We purified genomic DNA from 15 VnP breeds from 12 regions all over the country and three Western pig breeds as controls, and investigated genetic polymorphisms in all known PERVs, including the beta (β)1–4 and gamma (γ)1–5 groups. PERVs of β1, β2, β3, and γ4 were highly polymorphic with VnP‐specific haplotypes. We did not identify genetic polymorphisms in β4, γ1, or γ2 PERVs. We then applied a real‐time polymerase chain reaction–based method to estimate copy numbers of the gag, pol, and env genes of γ1 PERVs (defined as A, B, and C). VnP breeds showed significantly lower copy number of the PERV genes compared with the Western pig breeds (on average, 16.2 and 35.7 copies, respectively, p < .05). Two VnP breeds showed significantly higher copy number compared with the other VnPs (p < .05). Our results elucidated that VnPs have specific haplotypes and a low copy number of PERV genes.     

转Lp-PLA2猪成纤维细胞系的建立及其功能鉴定

根据NCBI上公布的猪Lp-PLA2mRNA序列设计引物,以小型猪肺脏cDNA为模板进行PCR,将扩增产物连接进入具有EF1α启动子的pIRES2-EGFP真核表达载体中,并对其功能进行鉴定。然后,将猪Lp-PLA2表达载体转染入小型猪胎儿成纤维细胞,经过G418抗性筛选,鉴定,成功得到5株转Lp-PLA2基因的猪成纤维细胞系。这为下一步建立Lp-PLA2转基因猪及其功能研究奠定基础。     

稳定表达猪干扰素调节因子7的ST细胞株的建立

干扰素调节因子(IRF)在抗病毒感染中具有重要作用,为构建稳定表达猪IRF7 (pIRF7)的猪睾丸细胞系(ST),本研究从猪淋巴细胞中扩增获得pIRF7基因,将其插入pEGFP-C3载体中构建重组表达质粒pEGFP-pIRF7.并转染于ST细胞中,通过G418加压筛选及细胞纯化获得G418抗性ST细胞株(STA1).RT-PCR和western blot检测结果表明,STA1细胞株能够稳定表达重组pIRF7;而且以聚肌胞刺激STA1细胞可以观察到表达的pIRF7在细胞内具有核转位能力,该项研究为进一步研究猪瘟病毒对pIRF7的作用奠定基础.     

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒转基因细胞系的建立

采用脂质体法将具有抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的shRNA质粒pEGFP-N1-shRNA导入PK-15细胞中,经G418药物筛选后,分离扩增绿色荧光蛋白阳性细胞,获得抗PRRSV转基因PK细胞系。通过对转染方法和条件的优化,确立最佳的转染及筛选步骤;对得到的阳性转基因细胞进行冷冻-解冻,并作PCR检测。结果表明,G418最佳筛选浓度为600μg/mL,脂质体与质粒的最佳转染比例为7∶2,最佳转染时间为24 h。本研究成功建立抗PRRSV转基因细胞系,为进一步的功能验证及体细胞核移植奠定了基础。     

表达绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白HepG2细胞系的建立

为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA.通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系.间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达.JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台.