葡萄病毒病主要检测技术

葡萄是世界性水果，栽培面积和产量均居水果的第二位。葡萄在长期无性繁殖过程中，感染并积累了多种病毒。葡萄病毒已由1999年的17个属，47种增加到2003年的25个属，55种。其中葡萄病毒属(Vitivirus)、凹陷病毒属(Foveavirus)、葡萄斑点病毒属(Maeulavirus)和葡萄卷叶病毒属(Ampelavirus)为新确定的4个属。迄今，还不能对葡萄病毒病进行有效的药剂防治，因此，高效灵敏的检测技术成为解决种苗检疫的基本前提，是防治葡萄病毒病，确保我国葡萄业健康发展的有效方法。     

葡萄种质资源卷叶病毒病田间自然发病调查

对郑州果树所国家果树种质郑州葡萄圃内的808份种质（品种和野生类型）的卷叶病自然发病情况进行了调查研究。在美洲种群、东亚种群及山美杂种中没有发现卷叶病症状;欧亚种葡萄中有卷叶病症状的品种比例最高,且程度严重;具有欧亚种葡萄血统的欧美杂种和欧山杂种均有表现卷叶病症状的品种,但发病率和严重程度较欧亚种低。在欧亚种葡萄中以鲜食葡萄品种为主的东方品种群的卷叶病的发病率较低,而以酿酒品种为主的西欧和黑海品种群发生卷叶病的比例较高,而且病情最严重。     

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄病毒病田间自然发病率调查及检测

对宁夏贺兰山东麓8个酿酒葡萄种植地区8个葡萄品种的病毒病田间自然发病情况进行调查,采用RT-PCR方法,检测了40份样品中GLRaV-1~5这5种葡萄卷叶伴随病毒的感染率。结果表明:宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄主要病毒病有葡萄卷叶病、扇叶病和栓皮病,其中葡萄卷叶病尤为严重;不同酿酒葡萄种植区和品种间葡萄卷叶病的感染存在着差异,老葡萄种植区中品种间葡萄卷叶病发病率明显高于新葡萄种植区的品种;"蛇龙珠"和"黑比诺"是感染葡萄卷叶病毒的主要品种,发病率高达85.1%和52.7%;利用5种葡萄卷叶伴随病毒引物进行RT-PCR检测,检出3种病毒类型,且GLRaV-3的检出率最高,为87.5%。     

葡萄种质资源卷叶病毒病田间自然发病调查

对郑州果树所国家果树种质郑州葡萄圃内８０８份种质（品种和野生类型）的卷叶病自然发病情况进行了调查研究,在美洲种群,东亚种群及山美杂种中没有发现卷叶病症状,欧亚种葡萄中有卷叶病症状的品种比例最高,且程度严重,具有欧亚种葡萄血统的欧美杂种和欧山杂种均有表现卷叶病症状的品种,但发病率和严重程度曾欧亚种低,在欧亚种葡萄中以鲜食葡萄品种为主的东方品种群的卷叶病的发病率较低,而以酿酒品种为主的西欧和黑海品种种     

贺兰山东麓酿酒葡萄病毒病田间发生状况调查

2007—2009年对宁夏贺兰山东麓主要酿酒葡萄产区病毒病的田间发生状况进行了调查。明确了葡萄扇叶病(GFLV)和葡萄卷叶病(GLRaV)是该地区主要病毒类型,疑似病毒类型是葡萄茎痘病和葡萄栓皮病;葡萄卷叶病毒感染的主要品种是蛇龙珠,主要发病区域是广夏二基地;葡萄扇叶病毒感染的主要品种是西拉,主要发病区域是玉泉营地区。     

山东省葡萄几种主要病毒病调查及检测研究

对采自山东省不同葡萄园类别的葡萄样品,采用PTA-ELISA法和Dot-ELISA法对葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)进行了检测,采用DAS-ELISA法对葡萄卷叶病的3个毒原(GL-RaV-1-、2-、3)进行了检测。GRSPaV检测结果表明:检测的61个品种518个样品,阳性样品率33.6%,阳性品种率73.8%,其中资源圃样品阳性率32.7%,生产园样品阳性率34.0%。对检测到阳性样品辅以RT-PCR法验证,2对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340 bp片段、CP基因842 bp片段。GLRaV-1-、2-、3的检测结果表明:鲜食品种3种病原的阳性样品率分别为33.7%、7.1%、62.2%,酿酒品种阳性样品率分别为35.1%、16.2%、54.1%,综合3种病毒的阳性样品率为76.3%,品种感染率87.7%。通过该类研究对推动国内葡萄无毒化生产有重要意义。     

3种葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测

2010—2011年我们对河北省涿鹿、怀来、昌黎、宣化等县(区)以及北京市葡萄卷叶病的发生情况进行了调查,并对采集的葡萄植株样品用RT-PCR方法检测病毒种类。在检测的82个样品中,葡萄卷叶伴随病毒3号(GLRaV-3)的检出率为100.0%,葡萄卷叶伴随病毒1号(GLRaV-1)的检出率为17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号(GLRaV-2)的检出率为11.0%;病毒混合侵染的样品占总检测样品数的28.1%,其中葡萄卷叶伴随病毒1号、3号混合侵染样品占总检测样品数的17.1%,葡萄卷叶伴随病毒2号、3号混合侵染的样品占总检测样品数的11.0%,且在这些被病毒混合侵染的样品中,有2个样品被葡萄卷叶伴随病毒1号、2号、3号三重侵染。     

葡萄卷叶病毒3 RT-PCR检测技术研究

采用改进的二氧化硅吸附法和2组特异性引物进行葡萄卷叶病毒3(GLR aV-3)RT-PCR检测。结果表明,二氧化硅吸附法提取总RNA纯度好、浓度高、操作简便;随机引物合成cDNA能同时用于多种病毒及不同引物的PCR,可简化检测程序,降低检测费用;LC 1/LC 2引物进行RT-PCR检测,病毒检出率高于PU/PD引物和EL ISA方法。建立了规范、灵敏、稳定、快速、经济的GLR aV-3RT-PCR检测技术体系。     

四川葡萄病毒病发生种类及其危害状况调查

根据中意国际合作项目“四川无病毒果苗繁育中心”的要求 ,为了弄清四川葡萄产区内病毒病的种类、危害程度及其流行规律 ,中意双方成立了联合工作组 ,并于 2 0 0 2年 9月在成都龙泉及攀枝花两地开展了葡萄病毒病的田间普查和采样。考察期间共收集葡萄枝样 5 0份 ,随后送往意大利巴厘大学 ,经双抗体和三抗体夹心酶联免疫吸附法测试 ,共检出了6种危险性病毒种类及株系。现对它们在田间的症状表现及其流行趋势作如下阐述。1　葡萄卷叶病 (GLRaV)　　葡萄卷叶病由长线形病毒引起 ,主要致病原因是病毒粒子在葡萄茎干的筛管中大量繁殖 ,堵塞筛管…     

葡萄病毒病多重RT-PCR检测技术体系优化分析

在确立葡萄卷叶病毒Ⅲ和扇叶病毒RT-PCR优化体系基础上,研究了多重PCR的主要成分:dNTPS、TaqDNA聚合酶、MgCl2对PCR反应的影响,从而确立了GLRaVⅢ、GFLV的多重RT-PCR检测体系。研究结果表明,多重PCR反应体系中TaqDNA聚合酶的用量较单重PCR反应体系要低,而且可降低成本和缩短检测时间。     

葡萄病毒病研究进展

葡萄栽培历史悠久 ,主要靠扦插和嫁接等方法无性繁殖 ,导致病毒长期积累和重复感染 ,病毒病发生日趋严重。病毒侵染葡萄后 ,引起葡萄树势衰退(甚至树体死亡 ) ,产量降低 ,品质下降 ,经济寿命缩短 ,嫁接成活率降低 ,繁殖材料生根能力差 ,树体抗性减弱等许多不良后果。欧美等一些发达国家从2 0世纪 4 0年代开始研究葡萄病毒病 ,并于 195 6年成立了“国际葡萄病毒学会” (TheInternationalCouncilforStudyofVirusesandVirus likeDiseaseofTheGrapevine ,简称ICVG) ,该组织至今已召开了13届国际会议 ,有力地推动了世界葡萄病毒病害的研究…     

A蛋白酶联免疫吸附法检测葡萄卷叶病毒的研究

研究了用A蛋白酶联免疫吸附检测法（PAS-ELISA）检测葡萄卷叶病毒的程序，提出了A蛋白、酶标A蛋白、抗体的适宜工作浓度及样品粗提液衡释倍数。通过对感病植株的幼叶、幼茎、老叶、老茎的检测研究，规范了PAS-ELISA检测技术。应用该技术，对国家果树种质资源圃郑州葡萄圃的39份种质及郑州地区栽培的品种进行了检测，保存品种的带毒率76.9%，抗逆性较强的东亚种群带毒率55.6%，郑州地区栽培品种葡萄带毒率为45.0%。     

葡萄茎痘病毒病的RT-PCR检测

根据症状随机选取石河子大学校园内的多年生全球红、无核白等葡萄为试材,采用SDS法提取高质量总RNA作为模板,以GRSPaV的特异互补引物引导,反转录合成cDNA,通过PCR扩增,获得830bp的预期目的片段。将此目的片段纯化回收,克隆测序分析。与NCBI中的此病相关序列同源性达到96%。     

葡萄4 种病毒多重RT-PCR 检测体系的建立

 以复合感染4种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材,对影响多重PCR的dNTPS浓度、Taq酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化,建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病毒3（Grapevine leafroll-associated virus-3,GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus,GRSPaV）、葡萄病毒B（Grapevine virus B,GVB）和葡萄病毒A（Grapevine virus A,GVA）的多重RT-PCR方法。灵敏度测验结果显示,多重RT-PCR与单一RT-PCR检测灵敏度基本一致。多重RT-PCR获得的特异性片段大小分别为905、546、460和196 bp,经过克隆、测序及序列比对,表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对7个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果表明,所建立的多重RT-PCR技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。     

葡萄斑点病毒的血清学检测技术

应用A蛋白酶联免疫吸附法(ProteinASandwichEnzymeLinkImmunoSorbantAssay,PAS-ELISA)、三抗体夹心酶联免疫吸附法(TripleAntibodySandwich,TAS-ELISA)、酶联板直接捕获抗原的酶联免疫吸附法(PlateTrappedAntigen-Indirect-ELISA,PTA-I-ELISA)、直接组织印迹法(DirectTissueBlotImmunoassay,DTBIA)和圆点免疫印迹分析法(Dot-ImmunoBindingAssay,DIBA)等5种方法检测葡萄斑点病毒(GrapevineFleckVirus,GFkV)感染的葡萄枝条、叶柄和叶片。结果表明:TAS-ELISA法灵敏度最高,其粗汁液的最大稀释度为1:5120,DTBIA和DIBA法均为1:1280,PAS-ELISA法为1:640,PTA-I-ELISA法检测的灵敏度最低,为1:320。针对不同季节和葡萄不同的取样部位进行的血清学检测结果表明,以秋末冬初和葡萄中下部枝条为GFkV最佳的检测时机和器官。另外,用健康汁液吸附抗血清,可以明显降低DTBIA和DIBA的非特异性反应,便于得到直观、准确可靠的检测结果。     

辽宁、山东葡萄与核果病毒病的田间调查

辽宁、山东葡萄与核果病毒病的田间调查王国平，洪霓，张尊平，张少瑜，姜修风（中国农业科学院果树研究所，辽宁兴城１２５１００）１９９６年６月，意大利地中海作物病毒研究中心Ｖ．Ｓａｖｉｎｏ教授根据中国农业科学院（ＣＡＡＳ）和意大利国家研究委员会（ＣＮＲ）１...     

DAS-ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的比较研究

在生长季节分3次对部分葡萄品种枝条上部、中部和下部叶片及韧皮部,进行双抗体夹心法(DAS-ELISA)、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫捕捉反转录聚合酶链式反应(IC-RT-PCR)3种方法检测卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)的比较。结果表明:DAS-ELISA的检出率明显低于RT-PCR和IC-RT-PCR方法。RT-PCR可以检测出RNA提取液为1:10-4的GLRaV-3病毒,但它受到了提取RNA难以及其它物质(如蛋白质、DNA等)干扰的影响,检测难度增加。从检测的灵敏度来看,RT-PCR和IC-RT-PCR比DAS-ELISA灵敏;并且,IC-RT-PCR比其它两种方法较快,整个过程仅需8h。     

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

 葡萄卷叶伴随3型病毒（Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3）和葡萄A病毒（Grapevine virus A,GVA）常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Himrod’）中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera L. × V. labrusca L.‘Fujiminori’）中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白（coat protein,CP）基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子（viral suppressor of RNA silencing,VSR）基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。     

A蛋白酶联免疫吸附法检测葡萄卷叶病毒的研究用离体微嫁接法快速检测苹果潜隐病毒

研究了用A蛋白酶联免疫吸附检测法 (PAS -ELISA)检测葡萄卷叶病毒的程序 ,提出了A蛋白、酶标A蛋白、抗体的适宜工作浓度及样品粗提液稀释倍数。通过对感病植株的幼叶、幼茎、老叶、老茎的检测研究 ,规范了PAS -ELISA检测技术。应用该技术 ,对国家果树种质资源圃郑州葡萄圃的 39份种质及郑州地区栽培的品种进行了检测 ,保存品种的带毒率 76 .9% ,抗逆性较强的东亚种群带毒率 55.6 % ,郑州地区栽培品种葡萄带毒率为 4 5.0 %。     

葡萄GLRaV-3和GRSPaV病毒双重PCR方法建立及初步应用

针对我国西南地区葡萄园中卷叶相关病毒3(grapevine leafroll-associated virus 3,GLRaV-3)和茎痘相关病毒(grapevine rupestris stem pitting-associated virus,GRSPaV)发生普遍的情况,在单一PCR检测的基础上,分别从引物浓度和退火温度对双重PCR体系进行优化,建立了同时检测GLRaV-3和GRSPaV的双重PCR技术。建立的双重PCR反应体系最适退火温度为56.1℃,20μL PCR反应体系中10μmol/L浓度的混合引物最适用量为0.1μL;该方法能够检测出GLRaV-3和GRSPaV的cDNA最低浓度分别为0.99pg/μL和99.43ng/μL,且特异性良好。应用该双重PCR方法检测了来自贵州凯里和遵义地区"南玉""温克""摩尔多瓦"葡萄品种疑似病株样品,GLRaV-3检出率为100%,部分样品检出GRSPaV。通过核苷酸序列克隆测序和对比发现,贵州检测出的GLRaV-3与美国分离株(AJ748523)相似度最高,为99.82%;贵州检测出的GRSPaV与巴西分离株(KT008370)相似度最高,为99.08%。